2010CB912600-内源性代谢产物硫化氢与介导心脏生理子的相互作用及其机制20

1、项目名称：内源性代谢产物硫化氢与介导心脏生理与病理机制的蛋白质靶分子的相互作用及其机制首席科学家：朱依谆复旦大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部上海市科委-、研究内容综合应用代谢组学、基因组学、蛋白质组学、结构生物学等方法和技术，以重要的心血管生理和病理调控通路为研究主要对象，研究硫化氢与蛋白质靶分子的相互作用及其机制；研究硫化氢对蛋白之间、蛋白质和核酸之间相互作用的调节及其机制。阐明心脏中内源性硫化氢在生理和病理情况下的生成代谢途径，探讨硫化氢的分解代谢过程。揭示若干h2s调控跨膜离子转运的重要通路；发现若干h2s直接作用的靶分子；明确h2s与靶分子蛋白相互作用的分子

2、机制。分离和验证H2S细胞效应相关的细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路中的重要蛋白因子，结合基因组学，蛋白质组学生物化学和分子生物学以及细胞生物学的实验结果揭示h2s细胞效应的分子机制和重要蛋白的作用机理和生物学功能。应用独创的半胱氨酸衍生物SPRC可作为分子探针，全面揭示含硫氨基酸体内代谢的基本规律。筛选出与含硫氨基酸及探针药物SPRC的心肌缺血保护作用密切相关蛋白分子，并对其功能进行研究，探寻含硫氨基酸及探针药物生物学效应和代谢通路的机体内源性拮抗剂和抑制剂，可能是具有临床应用前景的防治心血管疾病的新策略。阐明心脏中CSE途径和ATT/MST途径的表达调控机制及两条途径的协调机制。阐明

3、CSE在生理条件和病理条件下表达调控的实时监测和在体研究，同时对阐明CSE的调控网络也非常重要。阐明h2s跨膜传递及与氧化性小分子和金属离子的反应特性OH2S的跨膜传递关系到内源性h2s的作用方式以及外源性h2s或h2s供体作为药物的可行性；与氧化性小分子和与金属离子的反应特性则与H2S的分解代谢相关。二、预期目标（一）总体目标采用蛋白组学和代谢组学的经典研究方法，结合心血管疾病的生理和病理过程，从细胞水平到整体水平进行动态研究。以缺血性心脏病为核心，探讨体内活性代谢产物小分子气体信号-h2s对心血管系统保护作用的分子机制，筛选分离出特异的靶蛋白、目标基因和生物标记物；进一步利用结构生物学，生

4、物化学的方法研究蛋白之间，蛋白和DNA,RNA的相互作用机理。全面阐述心脏中内源性h2s在生理和病理情况下的生成代谢途径，以及生成的内源性h2s在细胞内和细胞间的传递过程以及传递过程中与氧化性小分子（如no,h2o2）及金属离子的相互作用，从而探讨h2s的分解代谢过程。（二）五年预期目标阐明h2s在细胞水平上的传递过程，探讨h2s传递机制及传递过程中参与的反应，如h2s对氧化应激蛋白和凋亡相关蛋白的构象和正常功能的影响。该工作可能找到体内h2s新的作用靶分子，从而为最终阐明h2s对心脏保护作用的机制提供理论依据；阐明H2s传递机制及传递过程中蛋白之间，蛋白和DNA，RNA的相互作用机理，为在哺

5、乳动物中揭示h2s细胞效应的分子机制和阐明H2S在生理病理上的作用提供理论依据;细胞水平和整体水平上研究内源性H2S产生相关酶CSE在应激条件下（如氧化压力）和病理状态下表达调控的机理，找到相关转录因子及激活这些转录因子的信号通路和相关蛋白分子，为设计激活体内内源性h2s产生的药物打下基础；培养一批国际一流心脏蛋白组学领域科研人员，培养一批髙水平的中青年科学家，提髙我国蛋白组学科研水平和自主创新能力，增强国际竞争力。研究成果将以论文形式表现，发表髙水平论文2030篇（其中510篇IF10）,申请1015项发明专利。三、研究方案（一）课题总体思路鉴于目前蛋白质组研究比较多地侧重于蛋白质表达谱的研

6、究上，对于在重要生理、病理过程中调控通路的蛋白质间的相互作用的研究有待深入研究。此外，蛋白质是在有机体内发挥生理功能的；而机体内存在着众多可与蛋白质结合的小分子物质，其中包括代谢产物。内源性代谢产物可能和蛋白质结合，从而改变蛋白质分子的空间构象和功能。因此，研究内源性代谢产物对蛋白质组的作用是进一步了解蛋白质在活体的功能是至关重要的，尤其是如能发现可直接与代谢产物发生相互作用的蛋白质，不但对于了解重要的生理、病理调节机制具有重要的科学意义，而且也将有助于蛋白质学的研究更加深入，更有望了解各重要生理、病理过程的机制；有望形成蛋白质组学研究的一个分支，即小分子活性物质对蛋白质大分子结构和功能的调控

7、。h2s是最近几年开始引起国内外学术界注意的内源性代谢产物。总体来讲国内外对该领域的研究尚处于起步阶段。通过本课题的研究，有望分析h2s与蛋白质之间的相互作用，发现相互作用的基本规律，揭示h2s调控若干重要心血管生理、病理过程的机制。其研究成果还有望对于蛋白质组学的进一步发展作出一定的贡献。（二）课题的特色和创新点心脏离子通道功能调节和血管新生是调节心脏生理功能和心脏缺血等疾病的重要调控通路，本课题组于2007年和2008年分别发现了H2S对上述两条心血管通路的调节作用。本课题组发现在心肌细胞中，H2S抑制心肌细胞膜L型Ca2+通道的开放；在内皮细胞中，h2s促进细胞增殖、迁移、管腔形成以及在

8、整体模型中的血管新生。但是h2s产生生物学效应的机制未被阐明，尤其是h2s直接作用的靶分子至今不明。本项目在前期工作的基础上,推定H2S直接作用的靶分子在心肌细胞是调控跨膜离子转运的Ca2+离子通道，或与其相偶连的信号分子；在内皮细胞直接作用于VEGFR2，或PI3KAktTHIF-1f生存素信号通路中的信号分子，在此有限范围中寻找h2s直接作用的靶分子。如能取得成功，对于揭示h2s这样一个小分子物质是如何调控大分子（靶蛋白）的空间构象和功能的具有重要的科学意义，可能会发现一种蛋白功能调控的新规律。首次应用代谢组学方法系统研究含硫氨基酸及其衍生物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、SAC、SPRC等在体

9、内的代谢途径，包括H2S及有关中间代谢产物。此外，针对缺血、缺氧性心脏疾病，特别是含硫氨基酸及探针药物SPRC进行生物化学，结构研究和代谢功能的研究，及上述代谢途径的变化。在此基础上，筛选和优化具有治疗前景的可以生成内源性H2S的化合物，并进行合理的结构改造。项目涉及的领域和技术非常多，预期在缺血、缺氧性心脏疾病的基础研究、临床治疗和医药开发方面取得突破性进展。首次通过裂殖酵母模式生物的基因组学和蛋白组学重点研究h2s对细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路的影响，结合用酿酒酵母的突变体库的筛选分离出H2S细胞效应信号传导通路中的多个重要蛋白因子，找到这些重要蛋白因子在大鼠心肌细胞中的同源蛋白

10、，进一步利用结构生物学，生物化学的方法研究蛋白之间，蛋白和DNA，RNA的相互作用机理，结合基因组学和蛋白质组学，生物化学和分子生物学以及细胞生物学的结果，揭示h2s细胞效应的分子机制，阐明h2s在生理病理上的作用为新药设计及许多疾病的治疗提供新的思路。通过转基因小鼠技术构建携带CSE启动子控制的报告基因的转基因小鼠，从而在整体水平上实现对心脏中内源性H2S产生相关酶CSE在生理条件和病理条件下表达调控的实时观测和在体研究。阐明生理和病理条件下心脏内源性h2s产生的调控机制及调控网络，为通过药物干预心脏内源性h2s的产生奠定基础。阐明体内h2s的传递途径及其作用的小分子，从而探讨H2S的分解代

11、谢途径。利用转基因小鼠技术，实现对CSE表达的实时监测和在体研究。同时研究心脏内源性h2s产生的两条途径，既阐明各自的调控网络又研究两条途径之间的关联。既研究生理条件下内源性H2S产生的调控机制，又强调缺血、缺氧等病理条件下调控机制的变化。研究H2S与细胞内氧化性小分子和金属离子的反应特性，探讨内源性h2s的分解代谢。（三）课题设置课题1.内源性代谢产物h2s对心脏细胞离子通道和血管新生通路的调控机制主要研究内容：离子通道和血管新生是与心脏生理、病理疾病密切相关的两条重要调节通路。本课题组首先发现h2s可影响上述两条重要调控通路，并在前期研究中率先发现h2s可抑制心肌细胞膜上L型Ca2+通道的

12、开放；可促进内皮细胞增殖、迁移、形成新的血管。在此基础上，我们拟深入研究H2S调控L型Ca2+通道与促血管新生的分子机制，确定H2S作用的关键靶蛋白，阐明其调控网络，为通过h2s途径干预心脏病打下基础。研究目标：揭示若干h2s调控跨膜离子转运的重要通路，找到若干h2s直接作用的靶分子，深入研究h2s对其的调控机制。找到H2S调控血管新生的直接作用靶点，深入研究H2S的调控血管新生机制。发现H2S在不同靶分子蛋白上共同的可结合的位点或共有的化学修饰方式。课题承担单位：复旦大学；上海理工大学课题负责人：朱依纯教授课题参加人员：王睿、钱睿哲、付伟、卢宁、蔡文杰、王文伟经费比例：23%课题2.H2S对

13、真核细胞中蛋白质表达谱、蛋白间相互作用以及蛋白与核酸的相互作用的调控主要研究内容：h2s是最近发现的内源性信号分子，对细胞具有独特的调控作用。本课题以酵母为模式生物，通过基因组学和蛋白组学的方法，阐明h2s影响细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的信号通路，确定h2s作用的重要靶分子，绘制一幅完整的h2s细胞效应的信号通路图。将酵母中的研究结果进一步到心肌细胞加以验证。该工作有望全面系统的阐明h2s细胞效应的分子机制与调控网络，为通过h2s途径干预重大疾病找到新的靶点。研究目标：结合基因组学和蛋白质组学，生物化学和分子生物学以及细胞生物学的结果在裂殖酵母中绘制一幅完整的h2s细胞效应得信号传导通路图。

14、分离出多个参与细胞周期，细胞增殖和凋亡过程中信号通路中的重要蛋白因子，重点研究重要蛋白因子在各个信号通路中的作用机理，揭示h2s细胞效应的分子机制，为在哺乳动物中揭示h2s细胞效应的分子机制和阐明h2s在生理病理上的作用提供巨大的帮助和奠定基础。课题承担单位：复旦大学；南开大学课题负责人：AlastairMurchie教授课题参加人员：陈东戎、MarkGerrardBartlam、王哲、王铭洁、霍克克经费比例：20%课题3.含硫氨基酸及其衍生物对心脏作用靶点及代谢途径研究主要研究内容：体内含硫氨基酸及从食物中摄入的含硫化合物通过酶的作用分解代谢产生h2s,心脏中产生H2S的关键酶是CSE。本课

15、题首次发现半胱氨酸衍生物SAC通过促进H2S生成而具有心血管保护作用。我们进一步合成了具有自主知识产权的半胱氨酸衍生物SPRC，其具有更好的心血管保护作用。在此基础上，我们拟通过代谢组学的方法，全面揭示含硫氨基酸及其衍生物（如SPRC）在体内的代谢规律，确定与含硫氨基酸及探针药物SPRC心脏保护作用密切相关的关键蛋白质，并对其功能进行深入研究。设计、优化、合成更好的具有药用前景的h2s供体化合物，为h2s供体药物的临床应用打下基础。研究目标：阐明SPRC对心肌缺血保护作用的分子机制，鉴定出其作用的关键蛋白，揭示其调控网络。进一步优化SPRC的结构，设计合成出具有更好心肌保护作用的H2S供体化合

16、物，为其临床应用奠定基础。阐明含硫氨基酸和SPRC在体内的代谢途径，确定其代谢的关键酶，建立体内含硫氨基酸代谢途径研究的关键技术。阐明缺血、缺氧病理条件下SPRC对心肌保护作用的机制和经由CSE的代谢途径，鉴定出其影响的关键蛋白质和信号通路，揭示SPRC对CSE是否具有反馈调节作用，从而发现干预心脏疾病病的全新靶蛋白。课题承担单位：复旦大学课题负责人：朱依谆教授学术骨干：郭薇、林国强、储以微、赵伟利、孙逊、魏邦国、古险峰经费比例：34%课题4心肌中局部内源性H2S生成调控及传递主要研究内容：以小鼠为模式动物，综合运用基因组学和蛋白质组学的方法，着重研究已知的心脏中内源性H2s的生成关键酶CSE

17、在心脏生理和病理条件下的表达调控，阐明其信号通路和调控网络。本课题同时研究AAT途径在心脏内源性H2S产生中的作用及在心脏生理和病理过程中的表达调控。本课题还将研究内源性h2s在细胞内和细胞间的传递及传递过程中与氧化性小分子及金属离子的相互作用，探讨其在体内的代谢途径。研究目标：构建携带CSE启动子控制的报告基因的转基因小鼠，在整体水平上实现在生理条件下和病理条件下对CSE表达调控的实时观测和在体研究。通过生物信息学、分子生物学、生物化学和生物物理的方法阐明生理条件和病理条件下CSE表达调控的分子机制，阐明调控的信号网络。阐明ATT/MST途径在心脏生病理条件下表达调控的机制，及其对心脏内源性

18、H2S产生的作用。阐明HQ在细胞内和细胞间的传递过程，以及传递过程中与氧化性小分子和金属离子的反应特性。课题承担单位：同济大学；复旦大学课题负责人：郭占云研究员学术骨干：查锡良、郜洪文、杨奕清、孙晓宇、邵晓霞、朱融融、吴玲玲博士后经费比例：23%（四）课题技术路线内勰性优谢产物也3对心脏离刊道和血管新生诵貉的调控机倒噩胞同籬白1Iflip广1nKMtAkfA,-iiVJMF*4皿I7*TZ爲:議H声二54*4*1*1；:跡7麵质请硫化議细胞效应信号植导逋路蛋旦细胞周期，增殖和凋亡）IhHki如十恤:心血LO*Ji0*1OS蚩白右祁普自和DhjA互签冃相互作幷C酵週惡CHIF-chipi/EM5

19、Ai罢白和辰朋相互作战RIP-chip蔬化氢细胞效啓杓亡子机制紐.蛋白的柏念诙報基酸及扛衍生物对心脏作用靶点及代谢途径研究心肌中局部内源性E生成调笠歴档趨（五）各课题关系：本项目为确保参加单位分工协作、优势互补，在明确合作方式的基础上，加强与课题组核心单位以外的其它在学科、资源、技术及人才方面有优势的实验室协作，并吸收优秀人才以个人所在实验室身份加入到对口的课题承担单位负责或参加本课题研究，以保证科研队伍组成的最佳化。实现技术平台共用、科研资源共享，研究目标集中、点面结合及研究内容紧密衔接等组织形式。同时，课题实行2+3的滚动制，制订课题完成质量的定量考核标准，半年和一年分别进行一次研究进度考

20、核。完成不好的课题将减少科研经费，完成好的课题将增加科研经费。2年完成不好的单位和个人承担的课题将被取消，重新吸收新的课题组进行本课题的研究或将经费集中到其它有望获得较大突破的课题。为保证项目的顺利完成及与其它“973”项目的无缝衔接，项目将聘请国内外相关领域的著名专家，特别是“973”相关领域的首席科学家，担任本项目的学术顾问并成立相应的顾问委员会，监督本项目的实施，参与本项目的管理并提出合理化建议。本项目第一子课题的研究方案针对h2s对心肌细胞离子通道的调控和h2s促血管新生作用的两条重要生理、病理通路，结合内源性代谢产物对蛋白质结构和功能进行调控形成，尽管上述研究可使我们在明确的生理、病

21、理通路中研究h2s对蛋白质靶分子结构和功能的调节机制，但其局限性也是勿庸置疑的。H2S很可能还有在上述两条通路以外的靶蛋白，并由此再间接地影响上述通路。因此，还必须同时在更广的范围内寻找H2s的靶蛋白，以便发现h2s与靶蛋白结合的共同规律；还要应用基因组学和蛋白质组学的方法，观察h2s是否还能通过调控基因表达而使细胞蛋白质表达谱发生变化，并分析蛋白质与蛋白质，以及蛋白质与核酸间的相互作用。这部分研究将构成第二子课题的主要研究方案。第二子课题研究中所得到的较全面的关于h2s调节基因表达和蛋白质表达谱的研究结果，将为第一子课题的研究提供更全面的信息。另一方面，第一子课题中关于h2s对于特定蛋白靶分

22、子及其相互作用的研究结果，将有助于分析第二子课题中观察到的蛋白质和基因表达谱的诸多变化，有助于分析上述变化中基因表达产物之间的相互关系，继而可据此通过基因敲除等方法确认上述因果关系。因此，通过第一和第二子课题在研究过程中的互动，综合应用结构生物学、蛋白质组学、基因组学和生理、病理学研究方法，既在由本课题组首先发现的两条重要心血管调控通路中有的放矢地研究H2S对靶蛋白分子空间结构和动能的调控及其生理、病理学意义，又能全面地反映h2s对心脏蛋白质表达谱的影响，通过学科交叉的互补作用，使h2s对重要心血管信号通路的调控作用及其机制得到较完整、深入的解答。鉴于h2s是一种具有心血管调节功能的内源性代谢

23、产物，其体内代谢过程值得研究。h2s是由体内含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸）作为底物代谢产生的。但是，上述h2s底物对体内h2s生成的作用及其机制仍有待阐明，尤其是其组织特异性的作用，如在心脏中对局部h2s生成的调节作用至今不明。因此本项目第三子课题拟应用代谢组学方法研究含硫氨基酸及其衍生物的体内代谢过程，研究其对内源性h2s产生的调节作用及其机制。此外，还将以本课题组特有的含硫氨基酸衍生物SPRC为分子探针，通过研究其为何具有独特的调节h2s体内代谢的作用，剖析含硫氨基酸在体内的代谢过程。此外，由于h2s在体内的半衰期极短；而其最重要的调节作用又发生在心血管系统，对于h2s的心脏效应来说，局

24、部生成的h2s可能发挥更重要的调节作用。因此，本项目中还将设置子课题四，重点研究心肌局部h2s生成的调节机制。子课题四同时研究心肌缺血、缺氧等病理状态下心肌局部h2s生成的代谢途径，可能发现新的生成h2s的代谢途径。因此，子课题三是在整体水平上地应用代谢组学的方法系统地研究含硫氨基酸及其衍生物的代谢途径，除了H2S的生成外，还观察所有相关中间产物的生成，可望对内源性H2S生成的代谢途径有一个全面系统的认识。而子课题四则在此基础上重点研究心肌局部的h2s生成及其调控机制，使关于内源性h2s代谢的认识进一步得到深入。事实上，子课题三、四中调控h2s生成的关键因子-有关代谢途径的确都是蛋白质。因此，

25、子课题三、四的研究也可认为是关于蛋白质对h2s作用的研究。而子课题一、二则属于h2s对蛋白质结构和功能的调节作用。通过上述四个子课题的研究，可分析h2s与蛋白质之间的相互作用，发现相互作用的基本规律，揭示h2s调控若干重要心血管生理、病理过程的机制。其研究成果还有望对于蛋白质组学的进一步发展作出一定的贡献。课题1H式对心脏离子通道和血營新久通路的调控机制融?耳补指挣M2丫HS对蚩门质表达谱、蛋I分子间I以及匿门与核酸的柿土作用的调控验证深入课题4心肌屮局部内源性HS生成的代谢遼能M3含硫氨基酸及其衍生物对心脏作用靶点及代谢途径研究四、年度计划2010年1月至2010年12月研究内容1）在心肌细

26、胞中研究PKA和PKG在介导H2S/HS-对L型Ca2+通道抑制效应中的作用；阐明PKA和PKG是否为H2S/HS-在心肌细胞中的靶分子。2）研究在血管内皮细胞中是否存在PI3KfAktHi伫1生存素通路，并研究这一通路分别与血管内皮细胞的增殖、迁移以及管腔形成的关系。3）用裂殖酵母生物芯片对比在细胞内有H2S和没有H2S的条件下全基因组基因的表达谱的差异；4）在酿酒酵母中全基因组基因敲除的文库和全基因组基因基因过表达的文库，对比在细胞内有h2s和没有h2s的条件下酿酒酵母生长情况。5）阐明SPRC通过何种机制产生心肌缺血保护的作用；SPRC及其衍生物对CSE是否具有反馈调节作用；SPRC对缺

27、血、缺氧状态下原代培养心室肌细胞的比较蛋白组学研究。6）明确SPRC在体内的代谢途径，在肾脏及肝脏中的代谢，完成动物实验。7）克隆CSE的调控区，构建用于转基因小鼠的表达载体；通过显微注射的方法构建携带CSE启动子控制的报告基因的转基因小鼠;培养心肌细胞，通过RNA干扰抑制CSE的表达。并建立测定体内h2s、氧化性小分子和金属离子的方法。预期目标1）阐明PKA和PKG是否为H2S/HS-在心肌细胞中的靶分子。2）阐明PI3KAktHif-1生存素通路对血管新生的影响。3）利用在酿酒酵母中所得结果对比，补充和证实裂殖酵母在基因组学和蛋白组学所得的实验结果，阐明在细胞内有h2s和没有H2S的条件下

28、酿酒酵母生长情况；4）构建出CSE启动子-报告基因载体；初步得到携带CSE启动子控制的报告基因的转基因小鼠；建立小鼠心肌细胞的培养体系，确定RNA干扰可以抑制CSE的表达；建立起测定体内h2s、氧化性小分子和金属离子的方法。5）阐明SPRC对心肌缺血时线粒体Katp、KCa和PTP离子通道的影响及其抗氧化作用关键蛋白SOD和CAT影响。6）揭示SPRC在体内释放H2S的过程及在体内的代谢途径，找出其代谢过程中的关键酶。7）发表SCI论文7篇以上，申请专利12项。8）培养研究生（博士生，硕士生）25名以上。2011年1月至2011年12月研究内容1）研究H2S/HS-在靶分子（PKA/PKG）上

29、的结合位点，结合后靶分子空间构象的变化与其功能之间的关系。2）研究Hif-1是否还存在生存素非依赖的通路（如VEGF）。3）利用双向电泳和质谱的方法，对比在细胞内有硫化氢和没有硫化氢的条件下全基因组蛋白表达谱的差异。4）通过计算机模拟对SPRC与CSE的相互作用进行了初步研究。分析CSE活性位点的化学性质，在设计中引入羟基，肼基，羧基，胍基，脲基，羟胺基等极性基团以加强与CSE的亲合性，进行活性筛选。5）通过生物信息学、CHIP、DNA亲和层析等方法预测并分离纯化调控CSE的转录因子；筛选转基因小鼠并建系；研究抑制CSE表达后ATT/MST途径的变化；研究H2S与细胞膜的相互作用。预期目标1）

30、阐明H2S/HS-在靶分子（PKA/PKG）上的结合位点，结合后靶分子空间构象的变化与其功能之间的关系。2）阐明Hif-1是否还存在生存素非依赖的通路。3）得到生物芯片和蛋白差异表达谱，分离出重要蛋白因子。4）完成在巯基上引入一系列疏水片段，以加强SPRC与CSE的结合。并将该一系列化合物应在心肌缺血模型上验证心肌的保护作用，完成H2S供体化合物的初筛。5）找到调控CSE表达的转录因子；建立转基因小鼠纯系；在mRNA、蛋白质和酶活力水平确定CSE被抑制后ATT/MST途径的变化；建立研究H2S与膜作用的研究方法，阐明作用的特性。6）发表SCI论文6篇以上，申请专利12项。7）培养研究生（博士生

31、，硕士生）25名以上。2012年1月至2012年12月研究内容1）H2S/HS-是否可通过调控AKAP所介导的PKA锚定作用而间接调控PKA对a1C亚单位的作用，从而抑制其开放。在心肌细胞中观察同位素标记的H2S/HS-是否可直接与L型Ca2+通道结合（包括a1C和卩）。2）观察H2S是否能够提高VEGFR2的活性。用AutoDockprogram计算H2S/HS-与VEGFR2相互作用的位点。3）找到这些重要蛋白因子在大鼠心肌细胞中的同源蛋白。用酵母双杂交的方法大规模筛选重要蛋白在体内的相互作用蛋白。同时利用CHIP-CHIP和RIP-CHIP技术筛选重要蛋白在体内的DNA和RNA靶点，用免

32、疫共沉淀（CO-IP）和凝胶阻滞（EMSA）等离子表面共振SPR和X-光晶体衍射的方法研究蛋白质的结构和构象；4）将分离的重要蛋白因子在裂殖酵母中作转基因和敲除研究，分析其在细胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通过提高或降低硫化氢在细胞中的浓度对比野生型细胞，转基因细胞和敲除细胞的表型。5）采用基因突变技术改变SPRC靶蛋白的分子结构，分析SPRC在靶蛋白上的作用位点，揭示SPRC结合与靶位点后对该靶蛋白功能及对细胞生理、病理过程的影响。6）通过活体成像技术，监测报告基因在生理条件下表达调控；研究CSE调控因子的调控机制与调控网络；7）利用转基因小鼠建立I/R模型；模拟病理条件下抑制CSE表达

33、后ATT/MST途径的变化；研究外源h2s供体在细胞内跨膜迁移输运过程。预期目标1）阐明H2S/HS-是否可通过调控AKAP所介导的PKA锚定作用而间接调控PKA对a1C亚单位的作用，从而抑制其开放。2）阐明H2S/HS-是否可直接与L型Ca2+通道结合。3）阐明H2S和VEGFR2重组蛋白相互作用的位点。4）揭示硫化氢对蛋白，DNA和RNA的相互作用的影响；5）观察SPRC对这些酵母菌株作用后所影响到的相关基因。改变SPRC靶蛋白的分子结构，分析SPRC在靶蛋白上的作用位点，揭示SPRC结合与靶位点后对该靶蛋白功能及对细胞生理、病理过程的影响。7）实验CSE在心脏中表达调控的实时观测；阐明C

34、SE调控因子的调控机制与调控网络；建立起小鼠I/R模型。8）在mRNA、蛋白质和酶活力水平确定病理条件下CSE被抑制后ATT/MST途径的变化；阐明外源Hf供体在细胞内跨膜能力和特性。9）发表SCI论文4篇以上，申请专利12项。10）培养研究生（博士生，硕士生）20名以上。2013年1月至2013年12月研究内容1）在心肌细胞中观察L型Ca2+通道的a1C和卩亚单位的相应位点是否被激活。在HEK293细胞中转染L型Ca2+通道的a1C和卩亚单位，研究H2S/HS-直接调控L型Ca2+通道的机制。2）通过核磁共振、质谱、红外光谱扫描、元素分析等实验方法，结合计算机辅助分子动力学模拟分析，研究H2

35、S与VEGFR2相互作用后对后者空间构象的影响。3）将分离的重要蛋白因子在裂殖酵母/大鼠心肌细胞中作转基因和敲除研究，分析其在细胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通过提高或降低硫化氢在细胞中的浓度对比野生型细胞,转基因细胞和敲除细胞的表型。4）用酵母双杂交的方法大规模筛选重要蛋白在体内的相互作用蛋白。同时利用CHIP-CHIP和RIP-CHIP技术筛选重要蛋白在体内的DNA和RNA靶点，用免疫共沉淀（CO-IP），凝胶阻滞（EMSA），等离子表面共振SPR和X-光晶体衍射的方法研究蛋白质的结构和构象。5）SPRC衍生物对缺血、缺氧状态下原代培养心室肌细胞的比较蛋白组学研究及对缺氧状态下游离培养心室组织块的比较蛋白组学研究。6）监测I/R过程中报告基因的表达实时变化；通过生物信息学、CHIP、DNA亲和层析等方法分离纯化病理条件下调控CSE的转录因子。7）确定ATT/MST途径在生理和病理条件下的转录因子和调控元件；研究H2S与细胞内氧化性小分子的相互作用。预期目标1）阐明H2S/HS-直接调控L型Ca2+通道的机制。2）阐明H2S与VEGFR2相互作用后对后者空间构象的影响。3）揭示硫化氢细胞效应中蛋白相互作用机理及生物