免疫细胞的分离技术2011

1、第三节免疫细胞的分离技术免疫细胞的种类与特征免疫细胞的分离技术免疫细胞分离的临床意义免疫系统的组成中枢：胸腺、骨题免疫髓官淋巴结、脾脏、粘膜相关淋巴组织等免疫柔统免疫细腿：淋巴细腿、单核巨噬细跑、粒细腮、DC、肥大细腮、NK细腹免疫分子：扰体.补体、细腮囲子、MHC、TCR、粘附分子等定义：人类在种菜迸丫匕过程中形炭萌、经遗传获霄萌免疫，遇病原体后莒先养逑速趙彷N乍用萌免疫血普組欣：皮U粧膜及茸产將、细脛（驱细腥、单核丢噬细腿.DC.NKT、中幢粒细跑、yST细脛、B1细胞丿等特点：先天具有.无濟伏期.无特弄无记忆牲乍用时同：096小时Adaptiveimmunity定义：机体在圭満过程中,丫

2、接触扰原牲將质而获浮的免疫。TvB细腮谀列病原体眈分后产主的免疫庞答特凉：后天获語、有潜伏期、特弄牲，记忆牲赛与细腮:T细脛和B细脛趙乍用时间：晚,般在感辭后45天发挥乍用一、免疫细胞的种类与特征免疫细胞的分类凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，通称为免疫细胞(immunocyte),其中包括淋巴细胞.单核细胞、巨噬细胞.NK细胞、树突状细胞DC.肥大细胞.粒细胞等根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类免疫活性细胞(immunocompetentcells)抗原提呈细胞(antigen-presentingcells，APC)其他细胞淋巴细胞（T、B细胞）树突状细胞NK细胞单核细胞/巨噬细

3、胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞肥大细胞W红细胞血小板免疫细胞种类Immunology免疫细胞的起源与分化粒/巨噬细胞前体细胞巨核/红细胞前体细胞共同淋巴样前体细胞共同髓样前体细胞巨核细胞有核红细胞Lz效应1匕XZ细胞浆细胞活化的T细胞T细胞B细胞粒细胞（或多形核白细胞;驚：驚：囂未誠体单核细胞專囂0肥大细胞巨噬细胞未成熟树突状细胞血小板红细胞1/淋巴结0成熟树突秋细胞免疫活性细胞具有待异性抗原受体.在接受抗原刺激下发生克隆性活化、增值和分化，产生适应性免疫应答(adaptiveimmuneresponse)6&细胞。这类细胞是机体产生待异性免疫应答的包括T细胞、I?(aniigenpre

4、sentingce_LAPC)皆H怜asm*芾#列弄常擀钢粛如廉爭flff満8松淞轎雷褂。目掛-frM删SAPC凿活W開弗冷溺对浴并擀津B密津其他细胞自然杀伤（NK）细胞，肥大细胞,1中性粒细胞，嗜破性粒细胞，血小板等NK细胞肥大细胞嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞嗜碱性粒细胞血小板免疫细胞的特征免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状2、免疫细胞的表面分子特征：白细胞分化抗原指血细胞分化成熟为不同谱系.分化的不同阶段以及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子聚类分化群（分化抗原，clusterofdifferentiation,CD）：应用单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克

5、隆抗体所识别的同一分化抗原称为CD抗原CD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志人CD分组分组CD(举例)T细胞CD2、CD3.CD4.CDS.CD8、CD28.CD152(CCD154(CD40L).CD272(BTLA).CD278(ICOS)CD294(CRTH2)B细胞CD19CD20、CD21CD40CD79a(Iga)CD79b(Igp)CD80(B7-1).CD86(B7-2).CD267(TACI)、CD268(BAFFR)CD269(BCMA).CD307(IRTA2)髓样细胞CD14.CD35(CR1)CD64(FcyRI)CD256(APRIL)CD257(BAFF).CD

6、312(EMR2)血小板CD36.CD41(整合蛋白allb).CD42a-CD42dCD51(整合蛋白av八CD61(整合蛋白卩3八CD62P(P选凝素)NK细胞CD16(FcyRIII).CD56(NCAM-1).CD94.CD158(KIR).CD161(NKR-P1A).CD314(NKG2D)CD335(NKp46)、CD336(NKp44)、CD337(NKp30)非谱系CD30.CD32(FcyRII).CD45RA.CD45RO.CD46(MCP)CD55(DAF).CD59.CD252(OX40L).CD279(PD1)CD281-CD284(TLR1-TLR4).CD289

7、(TLR9).CD305(LAIR-l).CD306(LAIR-2).CD319(CRACC)黏附分子CDlla-CDllcCD15.CD15s(sLx).CD18(整合蛋白卩2).CD29(整合蛋白卩1).CD49a-CD49f.CD54(ICAM-1).CD62E(E整合蛋白).CD62L(L整合蛋白人CD324(E-cadherin).CD325(N-cadherin)CD326(EpCAM)细胞因子/趋化因子受体CD25(IL-2Ra).CD95(Fas).CD116-CDwl37.CD178(FasL)、CD183(CXCR3).CD184(CXCR4).CD195(CCR5)CD2

8、61-CD264(TRAILR1-TRAILR4)内皮细胞CD105(TGF-pRIII)CD106(VCAM-l).CD140(PDGFR)CD144(VE钙黏蛋白人CD299(DCSIGN-related).CD309(VEGFR2)JAM1(CD321)JAM2(CD322)碳水化合物结构树突状细胞CD15u.CD60a-CD60c.CD75.CDw327-CDw329(siglec6.7.9)CD85(ILT/LIR).CD273(B7DC)CD274-CD276(B7H1-B7H3)CD3O2(DCL1)CD303(BDCA2).CD304(BDCA4)干细胞/祖细胞基质细胞CD13

9、3、CD243CD292(BMPR1A).CD293(BMPR1B).CD331-CD334(FGFR1-FGFR4).CD339(Jagged-l)红细胞CD233-CD242分组人CD分组CD（举例）（五）NK细胞的分离技术二免疫细胞的方离技术（一）夕卜周血单个枚细胞分离T淋巴细胞及其亚群的分离（三）B淋巴细胞及其亚群的分离）Mo/M0分离技术免疫细胞分离基本原理不同纟田胞密度不同不同纟田胞表面生物学特4生不同不同纟田胞表面分化抗原不同免疫细胞的分离技术根据不同的实验的可以采取下列不同的分离方法h密度樺度离心法2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法.亲和板法）3、琏性分离法4、荧光澈活分离法5、

10、为*（花环沉降法）poojqejaqdudd)码(OWSdsjpojuapnuououi畴溶4审Btef*星令酬晦的責珂留匕（一）不同细胞密度不同单个核细胞（淋巴细胞和单枚细胞）的密度为1.077左右人的红细胞密度为1.093,1.077粒细胞密度为1.092,1.077血小板密度辅助性T细胞HelperTcells，Th效应T细胞EffectorTcells，TE细胞毒T细胞CytotoxicTlymphocytes，CTLA迟发性变态反应T细胞DelayedTcells,Td初始T细胞NaiveTcellsA调节性T细胞RegulatoryTcells,Tr记忆T细胞MemoryTcell

11、s,Tm抑制性T细胞SuppressorTcells,辅助性T细胞HelperTcells，ThThl:细胞免疫Th2：体液免疫Thl7：炎症反应辅助性T细胞HelperTcells，ThTh1%pMHCL4Th2L17IFNGIL4IL-237IL-23ROIL-12IL-12R初始T八柬激ThOCXCR3a31尸川GpMHCTCRIL-4IFN-yR(Stat6T-bepribi1FNGIFNyIL-4R亠IFN-yTNF-a细胞免疫CCR3.4.8IL-4IL-5IL-13体液免疫IL-17IL-17FTh17辅助性T细胞HelperTcells，Th滤泡辅助性T细胞（Tfollicul

12、arhelper,Tfh）通过细胞因子IL-10和IL-21来调节B细胞的功能调节性T细胞RegulatoryTcells,TrCD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化Foxp+T调节细胞可以从胸腺直接分化，也可在TGF-p作用下从Foxp3-T细胞分化。（二）T淋巴细胞及其亚群的分离玫瑰花结法（E花环沉降法）尼龙毛柱分离法淘洗法免疫磁珠法流式细胞术分选法玫瑰花结法人T淋巴细胞表面表达CD2分子,即绵羊红细胞受体，B细胞则无。在适当的条件下，可与绵羊红细胞(SRBC)结合，形成玫瑰花结(rosette)個为红细胞环绕T细胞，形似花环，所以又称E花环(Erosette)该实验常用于临床检

13、测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况方法淋巴细胞+SRBC悬液-37C水浴10min-低温低速离心fT细胞形成E花环而沉于管底悬液中为B细胞。尼龙毛柱分离法A混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而T细胞不与尼龙毛粘附的特性，这是获得富含T细胞群的有效方法优点简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用可分离大量细胞细胞不会被激活，可用于功能测定缺点纯度不髙耗时淘洗法也叫亲合板结合分离法(immunepanningisolation)。A利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于塑料平板上，由于各种淋巴细

14、胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则与相应的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适亲和板分离淋巴细胞示意图与板匕抗体对应的丧面抗原汹巴细胞混合液加入板屮IJ.洗涤板上除0其他细胞T淋巴细胞淘洗分离原理利用丁淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相载体上的特异性单抗结合，将T细胞与其他细胞分离的方法方法（以CD4+T细胞为例）1.羊抗兔ig包被平皿2.CD4一抗培育T细胞

15、，倒入平皿，4C孵育1小时;3.收集未粘附的CD4-T细胞PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微镜下观察免疫磁珠法(Magneticactivatedcellsorting,MACS)免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离免疫磁珠细胞分选原理直接标记和间接标记ENAiCMMtNrLMAMilO忡EVALUATIOH!OuCATIO*iEXHKTlSE阳性选择

16、法（正选）OO阴性选择法（负选）正选和负选的比较正选优点只需要一种抗体分离出的细胞纯度高对于比例小的细胞群，正选容易得到高纯度缺点需要特异性附靶细胞标记可能引起细胞活化负选需要的细胞没有被抗体等标记对需要的细胞，不需要特异性的细胞标记需要多种抗体标记不需要的细胞It!16TTof免疫磁珠细胞分选装置Affiiltcnyibiotac.ccn盲刨区|P百复吓文件Si(l奁君牧慈工具肋电）|E8出|免疫爲h.从年HXCS.MACS.厳MAIS.AkacsANg.bPart.Ac-;ACDe-AsaAcub七删:a.MACSCellSeparationReagentsIforhumancellsIT

17、cellsICD4*TcellschonaclarquaccCCD4+Tcells一VindovsInternetExplorerMACSC?CellSepardtionReagentsforhumancellsStemandpregenixorcellsTcellsPanTcellsACD犷TcellsCDe*7cells0Regulator/TcellsOthertcellsubsetsNKcellsBCellsMcnoc/tesDendriticcell;Antigen-presentingcellsGranulocytes3ndmyeloidcellsLeukocytesErythro

18、idcellsMegfloryocytesandplateletsEndothelialcell;EpithelialcellsFibroblastsNeuralcellsCytckirc-producingcellsTumorcellsFcrcccotorblockingfornon-humanprimatecellsformousecellsforratcellsforindrectmagneticlabalirgforapoptcticanddeadcellsforisolaricnofmitochondriaMACSCellSeparatiorColumnsMACSSep33torsa

19、utcHACSCellSeparationCD/1MicroBeadsProductApplicationsordernoCD4MicroBcads,humanPositiveselectionofhuman130045101Thelpercells;deplecicnofhumanThelpercells,mcnDcyt*srderdriticcellsWholeBloodCD4MicroRefldsProductApplicatioiifiorderno.WholeBloodCD4IsclatonM84callsfrom130090877MicroBcads,humanhumanwhole

20、bleedandbonemarrowCD4MultiSortKitProductApplicationsorderno.CD4MultiSortKitrhumanIsclatondFhum3rThelper130-055101cellsubsetsCD4TCellIsolationKitilProductApplicationsorderno.CD4TCellIsolationKitII,Isclobonofuntouded130-091-155humanhumanThelpercellsPomPBMCsbydepletiorcfnor-U：乙*TcellsNdiveCD4TCellIsold

21、tlociKitUProductApplicationsorderno.NaiveCD4rcellIsolationIsclatonoruntouched130094131KitIIrhuinanhumannav1helFerCllsFpmEHCsbydepletionorron-CD4TcellsondmemoryTcellsMemoryCD4*TCellIsolationKitProductApplicationsordernoMemoryCD4*TCellIsoldliunTsclationofuncoucbed130-091-893Kit,humanhum亦memoryThelperc

22、ellsfrom=BMCsbydeplericrcfncn-CD-lTcellsandnaiveTcellsCD”centralMemoryICellisolationKitToolboxiSiCon-aciHchSharePrintthispageMyfavoritesYourcurrentfavoritelistisempty.SeorchthiswebsiteScorchAdvancedsearch免疫磁珠法阳性选择T细胞将特异性抗T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合T细胞在磁场中，结合T细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场

23、，再从免疫磁珠上洗脱T细胞免疫磁珠法阴性选择T细胞免疫磁珠法阴性选择T细胞将多种特异性抗非T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非T细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的T细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择CD4+T细胞实例CD4+TCellIsolationKitIICD4-PEPBMCbeforeseparationCD4-PEUntouchedCD4+TcellsoHLLeAQOggn迅kbbchngofun*wonkdcclkwithbiotinyhtedanbody44Tcdlsareretainedin3MACS*Columnp

24、lacedInaMACSSeparator.CD4*T11$throughChetolumnandare-collectedastheensfifhed,ufihbalwlcedfraction.Non-CD4+TcellsinPBMC,i.e.,CD8+Tcells,ylbTcells,Bcells,NKcells,dendriticcells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainst

25、CD8,TCRyCD19,CD56,CD14,CD16,CD36,CD123,andCD235a(glycophorinA).ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.Thereby,highlypureCD4+Tcellsareobtained荧光激活细胞分离法(fluorescenceactivatedcellsorterFACS)FACS用途：用流式细胞仪对单个细胞进行快速定量分析与分选的_门技术原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在

26、激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%流式细胞仪工作原理示意图分选样品一01=18FSCCD5PerCP方法（以CD4+T细胞为例）PBMC用PBS洗涤，低温离心弃上清;加入含AB血清的PBS封闭，4C孵育10分钟;加入适量的PerCP-CD3，APC-CD4抗体，4C孵育30分钟;PBS洗涤，低温离心弃上清并用RPMI1640重悬;流式细胞术分选;（三）B淋巴细胞及其亚群的分离A如果仅考虑PBMC中T细胞和B细胞，那么所有从PBMC中分离T淋巴细胞的方法实际上也可用于分离B

27、淋巴细胞。B细胞表面标志SmlgFc受体、补体受体.EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以Smlg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞去除Mo/M0法终浓度5mML-leucinePMBC,混匀，室温35smethylester(L-LME)重悬离心，400g,10min,弃上清，PBS洗涤细胞重悬于25mlRPMI除细胞团块1640培养基，过尼龙毛柱，去玫瑰花结法去除T细胞抗CD19或CD20单抗标记，流式细胞仪检验B细胞纯度免

28、疫磁珠法阳性选择B细胞免疫磁珠法阳性选择B细胞将特异性抗B细胞表面分子CD19的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合B细胞在磁场中，结合B细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱CD19+B细胞将多种特异性抗非B细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非B细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的B细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择B细胞实例CO19PEPBMCbeforeseparationudUFWco二TfCD19PEUntouchedBcellsoda(D4eyBCellIso

29、lationKitIIMagneticIdbellngofunwarnedcellsandAnti*BiotinMicrofteadsNon-8clKretainedin.aMACSColumnplxedinaMACSSeparator.BcellsjMSiihrough(hiecatumndnidarecolltM45thnrkMd,unbteldcollfraction.Non-Bcells,i.e.9Tcells,NKcells,monocytes,dendriticcells,granulocytes,platelets,anderythroidcells,areindirectlym

30、agneticallylabeledusingacocktailofbiotinylatedCD2，CD16,CD14,CD36,CD43,andCD235a(glycophorinA)antibodies.ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletionHighlypureBcellsareobtainedbydepletionofmagneticallylabelednon-Bcells（四）Mo/M0分离技术A单核巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞、以及组织内

31、的巨噬细胞（M（p）oM（p来源于血液中的单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。Mo/M0细胞*表面标志A表面标志抗原：CD14,但CD14也表达在粒细胞。CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上黏附法无血清RPMI1640培养液将PBMC2x106cell/ml重悬；75ml培养瓶中加入10ml细胞悬液，于培养箱内37C孵育1小时；吸尽培养液，RPMI1640培养液漂洗2遍，去除非黏附细胞；细胞刮片轻轻刮取黏附的单核细胞。优点快速，方便纯度和得率均较低缺点易引起Mo/M0激活，引起基因表达和分泌蛋白免疫磁珠法阴性选择单核细胞免疫磁珠法阳性选择单核细胞将特异性抗单核细胞表面分子CD14的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合单核细胞在磁场中，结合单核细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来*撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱CD14+单核细胞将多种特异性抗非单核细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠,用这种免疫磁珠从PBMC中结合