细胞融合技术及进展

1、细胞融合技术及进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项核 心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应 用领域不断扩大。本文综述了关于细胞融合的基本理论并重点综述了细胞融 合的基本方法及最新进展。关键字：细胞融合生物技术方法 综述刖言细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于 20世纪70年代末至80年 代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人 们所需物质的技术过程。细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互 补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了 有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、

2、发生生物学，特别是在单 克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。细胞融合使细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远 缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此 打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组 范围。但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性，致使细胞株的遗传性不 稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现，直接利 用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。细胞融合技术避免了分离、提纯、 剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂， 投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实

3、践意义，正得到科学界 的日益重视。随着细胞融合技术研究的不断深入，细胞融合技术的发展前景 及其产生的影响将日益显著。1关于细胞融合的基本理论及概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上 的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和 核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)。如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。体 细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。由于对植物细胞和微生物细胞进行细胞融合时，必

4、须除去细胞壁，而剩 余的部分称为原生质体(protoplast)，所以植物和微生物细胞的细胞融合实际 上就是原生质体融合。原生质体融合(protop last fusion)亦称细胞融合(cellfusion)，是指两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞，使一个细胞的遗传 物质包括细胞核DNA和核外基因都进入另一个细胞。细胞融合大体分三个阶段进行。第一阶段是制出细胞融合体。首先要用 氧把细胞分散开，再把细胞壁溶解掉，这时的细胞就成了原生质体。原生质 体用聚乙烯乙二醇(PEG)处理后，再把PEG洗掉，形成原生质体的结合。第二 阶段是融合子的鉴定。利用利于融合子生存的培养基删选出已经融合的杂种 细

5、胞。第三阶段是培养融合细胞阶段。融合细胞在细菌培养基或是不含有细 菌的液体培养基中进行培养，结合细胞反复分裂后，形成细胞团，把细胞团 移植于含有植物激素的培养基里长出茎、叶，再把它们移植于土壤之中或嫁 接于植物体上，继续生长形成新植物。细胞融合技术大体上可分为化学诱导融合、生物诱导融合和物理诱导融 合三类。2细胞融合技术的常用方法2.1化学诱导融合2.1.1 PEG诱导细胞融合法1974年发现的高效融合剂聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体 之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在 一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而 发生质膜

6、结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%50%，分子量为6000)，但PEG在高浓度 下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及 作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环 境中的阳离子存在，融合时的pH也对原生质体融合有较明显的影响。一般 来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但 在缺乏钙离子时，若pH较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电 荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生 凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、

7、活性稳定、使用方 便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽 然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、 融合率较底及经验性大等缺陷。2.2物理诱导融合2.2.1细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向 电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技 术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当 可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合， 从而导致细胞融合

8、。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact)；第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其 诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合 法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本 间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异 性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚 集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：细胞间接触；接触区的膜 结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特 异性的细胞融合。与使用PEG的化学法相比，电融合诱

9、导法是一种非常高效的细胞融合方 法。电融合技术的优点在于：融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快 速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程。故这种方法得以在短期内被广泛 采用，成为细胞融合的主要技术手段。该方法的缺点是必须购置专用的细胞 电融合设备。2.2.2激光诱导法激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行 破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。 即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接 触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样， 由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。

10、使用此 技术时，使细胞接触的方法可用光俘虏法；用低浓度的融合剂PEG (5% ) 使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光 镊(potical tweezers)利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向 光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要 大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从 而实现对细胞的操作。激光微束融合法与病毒法、PEG法、电融合法相比较，可选择任意两个 细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时、定 位性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰地观察整个 融合

11、过程，实验重复性好，无菌，无毒性。但它只能逐一处理细胞，不能像 其他方法一样同时处理大量细胞。而且由于其所需设备昂贵复杂，操作技术 难度大，很难推广应用。在微生物原生质体融合中应用激光微束技，融合效 率较低且丧失了高度选择性的优点有赖后续步骤检出融合子激光诱导融合 技术仍处在发展初期，还有待进一步完善。2.3生物诱导融合仙台病毒(HvJ)诱导法1962年日本的冈田善雄(Okada)偶然发现了由日本血凝性病毒(HVJ)或称 仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。冈田善雄的研究为 人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。细胞融合现象的发现引起细胞学界 的高度重。1965年英国的Harris

12、和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面 做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融 合。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后，人们又实现了灭活病毒促 进动物异种细胞的融合，从而打破了细胞融合的种属屏障，推动细胞融合技 术跃上新的台阶。但是，利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困 难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。细胞融合技术的最新进展3.1空间细胞融合技术植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在，有液泡的原生质体与 无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞融

13、合得率十分有限。在利用动物 细胞融合生产单克隆抗体过程中，在地面上由于无法排除地球重力的影响， 要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。空间站微重力环境没 有重力沉降、热对流和静水压等特点，不仅是研究重力生物学问题的理想场 所，而且也为那些在地面因重力限制而难以发展的生物技术提供了新的机 遇。20世纪80年代以来，德国细胞电融合技术发明家 Zimmermann等人在 空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量 的飞行实验结果表明，在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。融 合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故，杂种细胞活力增加可能是 细胞排列时间缩短引

14、起的。最近的飞行试验结果表明在微重力条件下，哺乳 动物细胞融合得率增加10倍，有活力的杂种细胞数比地面对照增加 2倍。 植物有无液泡原生质体的电融合得率，在微重力条件下比地面增加10-15倍。 在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能 性已经开始。3.2离子束细胞融合技术雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80年 代中期，中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入 生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用 机制体系。在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷 交换可导致细胞表面被刻蚀，引起

15、细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理， 发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可 调外，离子种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性高，可以用 微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程， 通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。此项 研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的 染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研 究的一大进步。3.3非对称细胞融合技术即利用某种外界因素（常为Y射线，即Y融合，gamma-fusion）辐照某一 细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核。

16、并用碘乙酰胺碱性蕊香红 6 G处理 在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使其细胞质失活。然 后融合来自这两个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的 优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原 生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性 状的同时改良其某个不良性状。实践表明非对称细胞融合技术通过Y射线和X射线等照射，为实现供体 亲本少数基因的转移，创造种间、属间杂种提供了可能性。值得注意的是， 此方法特别适用于细胞质雄性不育基因的转移，通过辐照胞质不育的原生质 体，破坏其染色体，与其具有优良性状品种的原生质体融合，从而获得实

17、用 的新的胞质不育系。这些都是常规育种所做不到的。3.4基于微流控芯片的细胞融合技术随着微机电系统（MEMS）技术和微加工技术的发展。微电极阵列的设计 加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得 微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求 大量融合异种细胞。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合 技术研究的重点领域。利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞 甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、 分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实 现.此外由于在微通道内的腔体容积很小，所

18、以会大幅减少细胞融合中所需 的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。3.5高通量细胞融合芯片高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内（1040m）产生的高 强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳 力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向 (可以是任何预先设计好的方向)以预定的速度(可以是不同种的细胞以不同 的速度定向)移动，从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型， 集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和 转移.由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射 电场强度只需

19、施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压 发生装置。高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结 合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率.此 外，二价阳离子(例如：钙离子)以及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可 大幅提高。细胞融合技术的应用及发展前景纵观细胞融合技术的发展历史，细胞融合技术的不断改进一方面表现在 融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。 融合剂走过了从活病毒，灭活病毒生物阶段到PEG化学物质阶段；新方法不 断涌现，从生物学，化学方法，物理学方法过渡到各种方法的综合应用乃至 应用空间技术。融合对象从动物，植物到微生物，从种内扩展到种间，从近 缘扩展到远缘。伴随着细胞融合技术的每一次革新和改进，都会迅速在各个 领域得到充分的应用，然后在实际应用中又不断