叔丁基对苯二酚及其氧化产物与牛血清蛋白的相互作用

1、叔丁基对苯二酚及其氧化产物与牛血清蛋白的相互作用李军 毕艳兰 孙尚德 丁一冉（河南工业大学粮油食品学院，河南郑州 450001）摘要 采用紫外吸收光谱和荧光光谱法研究叔丁基对苯二酚（TBHQ）及其氧化产物叔丁基对苯二醌（TQ）与牛血清蛋白（BSA）的结合作用。结果表明，TBHQ和TQ与BSA之间发生了相互作用并形成新的聚合体；TBHQ和TQ与BSA的荧光猝灭均属于静态猝灭机制。TBHQ和TQ与BSA之间的结合常数均大于104 L/mol，表明它们之间形成的配合物结合较为牢固；TBHQ和TQ与BSA之间的结合位点数均为1；通过热力学参数方程计算得出：H0和G0.98，由此表明在这一系列浓度下存在

2、单一的猝灭机制，即静态猝灭或动态猝灭8。表1 不同温度下TBHQ/TQ与BSA相互作用的Stern-Vorlmer曲线方程和相关系数T/BSA-TBHQBSA-TQ回归方程R回归方程R15y=0.251 4CTBHQ+0.999 70.993 1y=0.273 7CTQ+1.002 50.990 025y=0.205 6CTBHQ+0.998 00.995 5y=0.211 5CTQ+0.998 50.996 637y=0.177 3CTBHQ+0.996 80.980 8y=0.170 5CTQ+0.997 70.989 8动态猝灭和静态猝灭可以温度来区分9。动态猝灭由于与扩散有关，当温度升

3、高时溶液的黏度下降，同时分子的运动加速，其结果将使分子的扩散系数增大，从而增大分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物稳定性的下降，静态猝灭常数减小。根据表1中BSA-TBHQ和BSA-TQ三个体系在不同温度下的Stern-Vorlmer曲线方程的斜率和截距算出三个体系在在不同温度下的动态猝灭常数Ksv和猝灭速率常数Kq，结果如表2所示。表2 不同温度下BSA-TBHQ/BSA-TQ体系的动态猝灭常数（Ksv）、猝灭速率常数（Kq）T/BSA-TBHQBSA-TQKsv103/（L/mol）Kq1011/（Lmol-1s-1）Ksv103/（L/mol）Kq1011/（Lmol-1s-1）1

4、52.514.052.744.41252.063.322.123.41371.782.861.712.75由表2可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ三个体系的Ksv均随着温度的升高而减小，表明BSA与TBHQ及BSA与TQ的反应过程都是静态猝灭过程。另外，由表2也可以看出，BSA-TBHQ和BSA-TQ体系的猝灭速率常数Kq的值约为1011 Lmol-1s-1。由于各种荧光猝灭剂对于生物大分子的最大动态荧光猝灭速率常数Kq约为1010 Lmol-1s-110。显然，BSA与TBHQ、TQ作用引起的猝灭常数大于最大动态荧光猝灭速率常数。进一步表明BSA与TBHQ、TQ反应的猝灭过程不是由动态

5、碰撞引起的，而是因为它们之间通过静态结合形成配合物产生的。2.3.2 结合常数和结合位点数对于静态猝灭过程，如果生物分子中存在相似的和独立的结合位点，则结合常数（Kb）和结合位点数（n）可根据方程（2）求得。 （2）其中，Kb是TBHQ/TQ与蛋白相互作用的结合常数，n是每个蛋白分子的结合位点数。根据方程（2）做log（F0/F-1）对logQ的双对数回归曲线，相应的回归方程和相关系数如表3所示。表3 BSA-TBHQ/BSA-TQ体系的双对数曲线方程、相关系数、结合常数（Kb）和结合位点数（n）体系T/回归方程RKb104/（L/mol）nBSA-TBHQ15y=1.168 0CTBHQ+4

6、.208 10.992 31.611.1725y=1.179 1CTBHQ+4.137 70.996 81.371.1837y=1.187 3CTBHQ+4.065 90.988 91.161.19BSA-TQ15y=1.071 9CTQ+3.821 80.972 50.661.0725y=1.086 1CTQ+3.710 50.996 50.511.0937y=1.107 0CTQ+3.683 10.979 90.481.11由表3可以看出，BSA-TBHQ、BSA-TQ三个体系不同温度下log（F0-F0/F）对logQ所做双对数回归曲线的相关系数均大于0.98，表明方程（2）的假设是正确

7、的；在实验温度下n的值约为1，表明BSA与TBHQ、TQ的结合位点数均仅有1个；结合常数约为104 L/mol，说明BSA与TBHQ、TQ之间的结合较为牢固。BSA的主要结合区域位于具有相似化学性质的亚结构域IIA（Sudlows Site I）和IIIA（Sudlows Site II）的疏水腔中。因此，TBHQ和TQ最可能与区域A的疏水性空腔相结合，即212位色氨酸所在的结合位点附近。2.3.3 TBHQ、TQ与BSA的结合方式一般情况下，小分子与生物分子之间的相互作用力有疏水作用力、静电作用力、范德华作用力和氢键11。为了阐明TBHQ、TQ与BSA之间的相互作用，以lnKb对1/T进行线

8、性拟合，根据热力学方程（3）、（4）计算其相应的热力学参数如焓变（H）、熵变（S）和自由能变（G），结果如表4所示。 （3） （4）其中，Kb表示相应温度下的结合常数，R为气体常数。如果温度变化不明显，H可视为常数。表4 不同温度下BSA-TBHQ/BSA-TQ体系的热力学参数T/BSA-TBHQBSA-TQG/（kJ/mol）H/（kJ/mol）S/（Jmol-1K-1）G/（kJ/mol）H/（kJ/mol）S/（Jmol-1K-1）15-23.19-11.04+42.22-20.98-10.64+35.9025-23.62-11.04+42.22-21.34-10.64+35.9037-

9、24.12-11.04+42.22-21.77-10.64+35.90由表4中H、S值可得出TBHQ、TQ与生物分子BSA之间相互作用的结合方式：（1）S0表明了疏水作用力的存在，这是因为水分子在TBHQ、TQ周围排列有序，蛋白质获得了一个随机结构。（2）H0且不接近于0表明主要作用力不可能是静电作用力。当有氢键结合时，H0。因此，TBHQ、TQ与BSA相互作用的主要作用力是疏水作用力与氢键。并且由G0可以得知此反应过程是自发进行的。2.3.4 TBHQ和TQ与BSA之间的能量转移根据Foster偶极-偶极非辐射能量转移理论，当能够发射荧光的供能体与受能体之间的最大距离不超过7 nm，且供能体

10、的荧光发射光谱与受能体的紫外吸收光谱有足够的重叠时，将会发生非辐射能量转移现象，从而导致荧光体发生荧光猝灭3。图5 TBHQ/TQ的紫外吸收光谱和BSA的荧光光谱叠加图从图5中可以看出，TBHQ和TQ的紫外吸收光谱与BSA的荧光发射光谱均有一定程度的重叠，因此，根据能量转移理论公式（5）、（6）、（7）可求得TBHQ和TQ与BSA的结合距离r0，即能量转移的距离。 （5） （6） （7）其中，E为能量转移效率，R0为转换能量效率取50%时的临界距离，r0为能量转移的实际距离，K2为偶极空间取向因子，通常取平均值2/3，为没有能量转移时供能体的荧光量子产率，通常蛋白质中取色氨酸的量子产率0.11

11、8，n为介质的折射率，通常取水和有机物折射率的平均值1.336，J为供能体的荧光发射光谱和受能体的紫外吸收光谱的重叠，F()为波长从到范围内经过矫正的供能体的荧光强度，为波长为时受能体的吸光系数。通过对波长在300到450 nm范围内供能体的荧光发射光谱和受能体的紫外吸收光谱的重叠部分进行积分，求得BSA-TBHQ体系中J为8.9210-16 cm3L/mol，进一步求得E为0.02 nm，R0为1.64 nm，r0为3.13 nm，这与Shahabadi等3的研究结果是一致的。同理，求得BSA-TQ体系中J为2.5310-15 cm3L/mol，进一步求得E为0.02 nm，R0为1.95

12、nm，r0为3.73 nm。显然，BSA-TBHQ和BSA-TQ体系中供能体与受能体的结合距离r均7 nm，由此表明BSA到TBHQ和TQ均以能量转移的方式与BSA之间发生了相互作用。2.4 构象变化2.4.1 紫外吸收光谱紫外可见吸收光谱对于检测络合物的形成是一种简单而有效的方法。在本研究中，以BSA溶液为参比，通过加入不同量的TBHQ、TQ到BSA溶液中，来探索BSA的结构变化（图6）。图6 不同温度下BSA与不同浓度TBHQ/TQ作用的紫外吸收光谱（以25为例）注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TBHQ/TQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75,

13、 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.从图6可以看出，BSA的紫外吸收强度随着TBHQ、TQ浓度的增加而增加，且拟合曲线的线性关系较好，这表明BSA与TBHQ、TQ之间形成了结合较好的复合物6。另外，BSA-TBHQ和BSA-TQ体系紫外吸收光谱的最大吸收峰均发生红移，进一步说明蛋白质的构象发生了改变。2.4.2 同步荧光同步荧光光谱因具有简化光谱、窄化谱带和减小光谱重叠等优点而常用来探讨蛋白质构象的变化，近年来越来越广泛地被应用在小分子和生物大分子之间相互作用的研究领域中。对于蛋白质的同步荧光，=15 nm时仅表现出酪氨酸残基的荧光，=60 nm时仅表现出色氨酸残基的荧

14、光，因为不同氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关，所以可以根据发射波长的改变判断蛋白质构象的变化。图7 BSA与不同浓度TBHQ作用的同步荧光光谱注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TBHQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.图8 BSA与不同浓度TQ作用的同步荧光光谱注: c(BSA)=1.2010-5 mol/L, c(TQ)/c(BSA)=0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00.如图7、8所示，随着TBHQ和TQ的添加

15、，酪氨酸和色氨酸残基的荧光同时被猝灭，且色氨酸残基的荧光强度随TBHQ和TQ添加而降低的程度明显快于酪氨酸残基，表明TBHQ和TQ与BSA的结合位点更接近色氨酸3。另外，TQ对色氨酸残基的荧光猝灭比TBHQ更明显，表明TQ更容易跟BSA结合。对于TQ，色氨酸和酪氨酸的最大发射波长均发生了微弱的蓝移，表明TQ的加入使BSA中这两种荧光发射基团附近的极性降低，疏水环境增强，说明构象发生了变化12；TBHQ在色氨酸最大波长处发生蓝移，在酪氨酸最大波长处发生红移，表明TBHQ和BSA的相互作用改变了色氨酸残基和酪氨酸残基附近的构象，使色氨酸残基基团附近的极性降低、疏水环境增强，酪氨酸残基集团附近的极性

16、增强、疏水环境减弱。3 结论采用紫外吸收光谱法和荧光光谱法研究了TBHQ和TQ与BSA的作用机制，TBHQ和TQ对BSA的荧光猝灭机制是静态猝灭，它们分别与BSA以1: 1的结合方式形成复合物；TBHQ和TQ与BSA的相互作用力以疏水作用力和氢键为主；紫外吸收光谱和同步荧光光谱表明TBHQ和TQ的加入，使得BSA在微环境中的极性发生了改变，从而导致BSA构象发生了变化。参考文献1 李军, 毕艳兰, 杨会芳, 等. 加热条件下大豆油中TBHQ的挥发、转化规律及其对大豆油品质的影响J. 食品科学, 2014, 35(14): 106-112LI JUN, BI Yan-lan, YANG Hui-

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