药物分析学课件：第十四章 维生素类药物的分析

1、第14章维生素类药物的分析Analysis of Vitamins1概 述维生素：是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物质。人体不能自行合成维生素。2022/8/42 如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。 例如: VitA 缺乏夜盲症 VitB1缺乏脚气病3 VitA、D2、D3、 E、K1 等 脂溶性水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺VitMVitPP4维生素A维生素B掌握结构与理化性质，硫色素鉴别反应非水滴定法和紫外分光光度法了解其它鉴别反应和含量测定方法。掌握结构与理化性质三氯化锑鉴别反应紫外分光光度法（三点

2、校正法）了解其它鉴别反应和含量测定方法。维生素C掌握结构与理化性质掌握硝酸银、二氯靛酚钠的鉴别反应，碘量法和二氯靛酚滴定法了解维生素C的杂质检查方法。学习要求维生素E掌握结构与理化性质熟悉显色反应和气相色谱法测定了解生育酚及其有关物质的检查。5-H 维生素A醇-COCH3 维生素A醋酸酯-COC15H31 维生素A棕榈酸酯R :第一节 维生素ACH3CH3CH2ORCH3CH3CH3具有共轭多烯侧链的环己烯6具有一个共轭多烯侧链的环己烯（一）结构与性质一、 具有UV吸收 存在多种立体异构化合物2022/8/47维生素A 325.5 100% 新维生素Aa 328 75%新维生素Ab 320.5

3、 24%新维生素Ac 310.5 15%异维生素Aa 323 21%异维生素Ab 324 24% 相对生物效价maxl结构与性质一、8VitA2VitA3 易发生脱氢、脱水、聚合反应CH2OHCH2结构与性质一、脱氢脱水2022/8/49鲸醇CH2OHCH2OHCH3结构与性质一、聚合2022/8/410 或有金属离子存在时氧化共轭多烯侧链 易被氧化（二）酸醛环氧化物、氧化剂紫外线、VitAVitAVitAOO2结构与性质一、11环氧化物VitA醛VitA酸OCH2OHHOCCOOH12 维生素A对酸不稳定(lewis酸/无水氯化氢乙醇溶液)，脱水，生成去水维生素A，活性降低。避光，充氮保存2

4、022/8/413（三）与三氯化锑发生呈色反应溶解性（四）不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等CHCl3紫红色蓝色3SbClVitA结构与性质一、2022/8/414理化性质15（一）三氯化锑反应（Carr-Price）条件: 无水无醇鉴别二、CHCl3紫红色蓝色3SbClVitA16蓝色紫红色鉴别二、17（二）VitAVitAHCl去水无水乙醇鉴别二、18USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值BP 杂质对照品法 显色剂 三氯化锑TLC法（三）鉴别二、19鉴别试验20基于： （1）维生素A醋酸酯的环己烷溶液在328nm有最大吸收，吸收系数E=1530； （2）维生素A醇的异丙醇溶液在325n

5、m有最大吸收，吸收系数E=1820.杂质：立体异构体；氧化产物及光照产物；合成中间体；去氢维生素A（ VitA2）；去水维生素A（ VitA3）UV法 （一）含量测定三、 杂质也有紫外吸收。因此采用在三个波长处测得吸光度后，再按规定进行校正-三点校正法。21三点校正法（ChP 2010）原理：（1）杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。含量测定三、2022/8/422含量测定三、选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除-等波长差法23第一法：维生素A醋酸酯的测定(等波长差法)2022/8/424等波长差法若此种情况下，分别计

6、算5个波长下的差值，若有一个或几个超过0.02，按下法判断：25注意： C 为混合样品的浓度 第二步 求)()(%cm1%cm1纯样EE)(%cm1样E)(LCAcm=E(%)%1样(因为样品是混合物)2022/8/426第三步 求效价换算因数由纯品计算而得：换算因数)效价(样样=%)(cm1)(Eg/IU/%)(cm1EgIU纯)效价(换算因数2022/8/427醋酸酯维生素Ag344.0IU1m=2907 000g344.0g101g/IU6=mm=）效价（15302907 000Eg/IU%)(cm1=纯）效价（换算因数2022/8/428换算因数)效价(样样=%)(cm1)(Eg/IU

7、1900)效价(样样=%)(cm1)(Eg/IU1900CA=L1900W称重A=LD1002022/8/429第四步：求标示量标示量每丸的效价标示量100标示量平均丸重100)效价(样)(g/IU1900W称重A=LD100标示量W1001900W称重A=LD100标示量W1002022/8/430 方法：直接测定法维生素A醋酸酯分别于300、316、328、340、360nm处测Aiml/IU159溶液环己烷样品31 判断 是否在326329nm之间在326329nm之间改用皂化法是否 求算 并与规定值比较maxl328iA/Amaxl2022/8/432 规定值 差值=-=-=-=-=-

8、299.0AA811.0AA0000.1AA907.0AA555.0AA328360328340328328328316328300？328iA/A2022/8/433 判断差值是否超过规定值的有一个以上超过无超过 计算 A328（校正） 用A328计算02.002.02022/8/434()()3403163283282523AAA.A-=校正%100AAAf328328)(328-=校正35 VitAD软胶囊中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10 000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；

9、精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下：36A300 ：0.374A316 ：0.592A328 ：0.663A340 ：0.553A360 ：0.228A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328 ：0.344 求本品中VitA的含量？37A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328

10、 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.0090.014 0 + 0.023 + 0.045=()()()637.0553.0592.0663.0252.3252.3340316328328=-=-=AAAA校正2022/8/438()%9.93%10010 00007985.01005015021287.01900637.0%100)ml100/g(C1900A%328=标示量平均丸重标示量校正%)3%15(%92.3%100328328)(328-=-=AAAf校正2022/8/439第一法无法消除杂质干扰时用此法40水溶性脂溶性i/KOHAnm

11、334325310300ml/IU159VitAVitA样品处测、于稀释至溶解异丙醇除去植物油的干扰甘油和脂肪酸盐植物油醇醋酸酯皂化液挥干乙醚乙醚提取乙醇2022/8/441等吸收比42 判断max是否在323327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算是否325300AA2022/8/443 判断 A300 /A325 是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算A325(校正)2022/8/444（二） 高效液相色谱法测定维生素A的含量为ChP2010新增的分析方法，适用于维生素A醋酸酯原料及其制剂中维生素A的含量测定。高效液相色谱法451仪器与色谱条件(1)仪器

12、：高效液相色谱仪，紫外检测器。(2)色谱条件与系统适用性试验：填充剂：硅胶流动相：正己烷-异丙醇(997:3)检测波长：325nm。进样量：10l。维生素A醋酸酯主峰与其顺式异构体峰的分离度应大于3.0。对照品溶液连续进样5次，主成分峰面积的相对标准偏差不得过3.0%。46VitA对照品（约相当于维生素A醋酸酯300mg）碘试液0.2ml混匀放置10min定量转移至200ml量瓶中正己烷稀释精密量取1ml置100ml量瓶中系统适用性试验溶液47供试品（约相当于15mg维生素A醋酸酯） 正己烷100ml量瓶精密量取5ml定量，摇匀50ml量瓶定量，摇匀正己烷供试品溶液 另精密称取维生素A对照品适

13、量(约相当于15mg维生素A醋酸酯)，同法制成对照品溶液。按外标法以峰面积计算含量。 48三氯化锑比色法（二）优点 简便 快速max 618nm620nm标准曲线法缺点呈色不稳定 （5 10s内）水分干扰与标准曲线温差1专属性差三氯化锑有腐蚀性SbOClSbClOH23蓝色+3SbClVitA(三)49维生素A类药物母核：共轭多烯侧链的环己烯主要理化性质：脂溶性；不稳定；与三氯化锑呈色；紫外吸收鉴别试验：化学法 三氯化锑反应（Carr-Price反应） 光谱法 UV 色谱法 TLC含量测定：三点校正法 三氯化锑比色法总 结50练习E51练习B 在盐酸催化下加热，发生脱水反应，生成脱水维生素A，

14、比维生素A多一个双键，最大吸收峰红移。52氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱)第二节 维生素B1 HClCl-NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+（碱性，和酸成盐）53（一）溶解性1. 易溶于水2. 水溶液呈酸性（二）UV共轭双键max = 246nm结构与性质一、2022/8/454嘧啶环 伯氨噻唑环 季铵1. 可与酸成盐2. 与生物碱3. 含量测定 非水碱量法（三）硫色素反应（四）碱性蓝色荧光硫色素正丁醇-OOH结构与性质一、2022/8/455鉴别试验二、（一）硫色素反应荧光消失蓝色荧光硫色素正丁醇）（环合+-HCNFeKOHNaOHVitB6321-OH2022/8/456-

15、H2O57硫色素(O)环合-H22022/8/458VitB1H+H+H+（二）沉淀反应()4242HgIHBHgIK淡黄()OH4WO12OHSiOB23222H+白色硅钨酸()2KIIIHIB2-红色白色扇形苦酮酸鉴别试验二、具有嘧啶环和氨基，显生物碱特征2022/8/459S元素反应Cl-反应（三）其他反应()21PbSNaSVitBAcPbNaOHD3HNOU233OHNHAgNOAgCl白3HNO蓝色淀粉试纸-22KIMnOCl2022/8/46061三、含量测定喹那啶红亚甲蓝 （紫红天蓝）（一）非水溶液滴定法4-44-2+2HClOClOBHClOHClClBAcHg）（2022/

16、8/462()ml/mg.nMCT861622733710=2022/8/463UV法（二）片剂、注射剂ChP= 421A = ECLg/100ml2022/8/464（每片）相当于标示量的%=规格g/片g%WEA%cm100110011标示量平均片重稀释度2022/8/465（每ml）相当于标示量的%=规格g/mlml%VEA%cm1001110011标示量稀释度2022/8/466NaOH（三）硫色素荧光法荧光硫色素异丁醇铁氰化钾1VitB原理1.2022/8/467激发波长365nm发射波长435nm方法与计算2、2022/8/468+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇+ NaOH +

17、 异丁醇+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇+ NaOH + 异丁醇SdAb对照液供试液%WWdSbA%VitB1001-=稀释度稀释度样对2022/8/469特点3、（1）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于 体液分析2022/8/470练习多选：BC Chp2010 原料药-非水溶液滴定； 片剂注射剂-紫外分光光度法 USP34-NF29 硫色素荧光法71第三节 维生素CL抗坏血酸654321OOHHOO COHHCH2OH烯二醇结构*手性碳原子2022/8/4721、易溶于水2、水溶液呈酸性结构与性质一、（一）溶解性2022/8/473二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构（二）强

18、还原性2022/8/474有活性有活性无活性CH2OHOOOO COHH2022/8/475糖类的显色反应50结构与糖类相似（三）具糖的性质蓝色糠醛吡咯脱水+HVitC2022/8/476C3OH的pKa = 4.17C2OH的pKa = 11.57酸性（四）一元酸2022/8/477L(+)抗坏血酸活性最强手性C（C4、C5）（五）光学活性*OOHHOO COHHCH2OH1234562022/8/478与碱反应（六）水解反应单钠盐32CONa酮酸盐水解NaOH2022/8/479NaOH2022/8/480（七）UV特征nmnmmaxOHmaxH265l245l-+2022/8/48182

19、与氧化剂的反应（一）鉴别试验二、去氢抗坏血酸OVitC831. 与AgNO3反应(ChP2010)（银镜）黑3AgAgNOVitC2.鉴别试验二、2022/8/484（玫瑰色）（无色）鉴别试验二、2022/8/4853、与碱性酒石酸铜反应4、与KMnO4反应红色碱性酒石酸铜2OCuVitC+24MnKMnOVitC鉴别试验二、2022/8/486（二）薄层色谱法 ChP2010采用薄层色谱法对维生素C制剂进行鉴别。鉴别试验二、87糖类的反应（三）或盐酸50吡咯蓝色糠醛戊糖脱水三氯醋酸VitC鉴别试验二、88鉴别试验二、2022/8/489UV（三）BP0.01mol/L HClnmmax243

20、=l58554511E%cm=2022/8/49091杂质检查三、VitC、 VitC注射液草酸的检查（三）（一）（二）92指示剂 淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量测定四、-+IIVitCH去氢抗坏血酸29394 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6方法2、2022/8/495（1）酸性环境 d . HCl （2）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度讨论4、（3）立即滴定 赶走水中O2减少

21、O2的干扰2022/8/496（4）附加剂干扰的排除片剂 滑石粉 过滤注射剂 抗氧剂 丙酮甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 2022/8/497二氯靛酚滴定法（二）USPJP原理1、酚亚胺二氯靛酚，6-2VitC98自身指示终点法方法2、空样二氯靛酚液空白样品VVHAcHPO-399（2）快速滴定 2min内 （1）酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定 （定量过量）（测剩余染料）讨论3、100（4）缺点 需经常标定贮存一周不稳定干扰多 氧化力较强101HPLC法（三）1. HPLC的优点灵敏度高选择性高分离分析同步微量分

22、析干扰少 快速2022/8/41022. HPLC法分离VitC常用方法及测 定对象 对象 制剂、生物样品、果汁方法 离子交换色谱法 离子对色谱法 分配色谱法（正、反相）血、尿、组织、细胞等2022/8/4103练习D104 维生素C能使2,6-二氯靛酚试液颜色消失，是因为维生素C具有（ ）A氧化性 B还原性 C酸性 D碱性练习B105 用碘量法测定维生素C注射液含量时，为消除抗氧剂焦亚硫酸钠的干扰，可加入的掩蔽剂是（ ）A丙酸 B甲醇 C酒石酸 D丙酮练习D106苯并二氢吡喃醇第五节 维生素E OHO107生物效价 右旋体 ：消旋体 = 1.4 ：10（天然品）（合成品）dl生育酚醋酸酯10

23、8名 称R1R2相对活性-生育酚-生育酚 -生育酚 -生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*OR1HOR2CH32022/8/4109结构与性质一、苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链1、易溶于有机溶剂，不溶于水2、UV3、酯键 易水解-+Oor OHHVitE醌型化合物生育酚2022/8/4110111（一）硝酸反应橙红色鉴别二、75 15minOHNO3VitE生育红生育酚112（橙红色）生育红生育酚HNO3强氧化剂CH3HOOCH3C16H33CH3H3COOCH3C16H33H3CCH3O113 取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在

24、75加热15min，溶液应显橙红色。2022/8/4114三氯化铁联吡啶反应O（二）红色生育醌对生育酚联吡啶-+2FeKOHFeVitE3115生育酚对-生育醌O弱氧化剂CH3HOOCH3C16H33CH3H3C116红色+23Fe3+2FeNNNN117 = 41.045.5max = 284nmmin = 254nm0.01%无水乙醇中UV法（三）118薄层板 硅胶G展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）显色剂 浓硫酸（105 5min） VitE Rf = 0.7TLC法（四）2022/8/4119 检查 三、酸度 目的：检查维生素E制备过程中引入的游离醋酸。乙醇15ml乙醚15ml酚酞指示

25、液0.5ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）微显粉红色本品1.0g溶解滴加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L) 滴定不得过0.5ml (一)120游离生育酚 硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄灰紫） 利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈原理1.试剂2.生育醌对生育酚-+3422CeCe（二）121（M生育酚= 430.8）例 取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。2022/8/41222.15限量3.%15.2%1001.0002154.00.1%=限量123

26、药典规定消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml设：应消耗硫酸铈液 V ml0.011.0 实际浓度 V若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量硫酸铈实际浓度）（0.101.0mlV=124例 Ce(SO4)2 =0.01020mol/L）（）（ml.mlV98001020001010=125有关物质残留溶剂ChP2010版对维生素E（合成型）中有关物质进行检查。ChP2010版对维生素E（天然型）中残留溶剂进行检查。(三)（四）126四、含量测定GC法（一）GC特点1. 选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制2022/8/4127载气N2固定液硅酮（OV-17）担体硅藻土或高分子多孔小球柱温265检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标正三十二烷 n 500 R2VitE测定的色谱条件2. 内标法加校正因子2022/8/4128内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的