高效液相色谱概述、特点和作用

1、高效液相色谱概述、特点和作用以液体作为流动相的色谱过程概述 定义概述 特点高压-150 350 x 105 Pa高速-小于1h高效-3万塔板/米（气相色谱2000塔板/米）高灵敏度-10-910-11 g特点概述 特点气相色谱惰性气体（无亲和性，只起运载作用）气体、沸点较低的化合物分析温度较高GC和HPLC比较液相色谱不同极性的液体（有一定亲和作用）高沸点、不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物一般室温在所有色谱技术中，液相色谱法是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。 到了20世纪60年代后期，将已经发展得比

2、较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 气相色谱适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物；而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远

3、超过气相色谱，位居色谱法之首。 分析对象通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。 高效液相色谱的类型 高效液相色谱的类型 HPLC按分离机理的分类 类 型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备 分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分

4、析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析液相色谱仪单元组件基本组件高压输液泵色谱柱检测器数据系统记录仪积分仪色谱工作站其余组件在线脱气装置梯度洗脱装置自动进样系统全自动控制系统柱后反应系统液相色谱仪的工作流程输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系1进样器将样品导入色谱柱前，流动相将样品带入色谱柱2各组分在色谱柱中分配系数或吸附力大小的不同而被分离3各组分依次随流动相流至检测器，产生检测信号4数据系统记录、处理或保存信号。5液相色谱流程图PUMPDet

5、ectorWData station (Recorder) or Collection基本理论和条件选择基础理论热力学理论：塔板理论平衡理论动力学理论：速率理论Vander方程一、塔板理论1.二、速率理论（与GC对比）二、速率理论参 数气 体液 体扩散系数Dm/cm2s-110-110-5密度/gcm-310-31粘度/g（cms）-110-410-2影响扩散的主要物理性质2.HPLC涡流扩散项：纵向扩散项：传质阻力项：固定相传质阻力项：HS流定相传质阻力项:Hm22流动的流定相传质阻力项:Hm滞留的流定相传质阻力项:Hsm2H= He + Hd + Hs+ Hm + Hsm222H =+提高

6、填料装填的均匀性减小填料的粒度低粘度的流动相的使用适当提高柱温降低流速提高液相色谱分离效率的方法：柱前峰展宽：进样引起柱后峰展宽：接管、检测器的流通池体积引起1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m） 首选化学键合相，匀浆法装柱2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择：选室温25左右HPLC法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography)二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chr

7、omatography, chemical bonded phase chromatography三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography)四、空间排阻色谱法（SEC） （ steric exclusion chromatography 各类高效液相色谱法简介1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等。k大，保留值大。作用机制：溶质分子和溶剂分子对吸附剂活性表面的竞争吸附。一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂Xm+nSa Xa+

8、nSm适用范围：分子质量中等的油溶性试样。对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。缺点：拖尾严重概念：流动相和固定相都是液体，但互不相溶，两者之间有一个明显的分界面。1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC二、液液分配色谱法（LLC）3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF4流动相极性与k的关系： 流动相极

9、性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱6适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等1反相离子对

10、色谱法（IPC或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱三、离子色谱法（IC）反相离子对色谱 RP-Ion-Pair HPLCMinutes02468101214Volts-0.10.00.10.20.30.4Volts-0.10.00.10.20.30.4 MgCdZnChromatogram of Mg, Cd and Zn separation2反相

11、离子抑制色谱 在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围： pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物2对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的3）与检测器匹配： UV（常用，测定波长应大于溶剂的

12、截止波长） 荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈） 使用前过滤、脱气3洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱） 以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱： 在一定分析周期内不断变换流动相的种类 和比例 即不断改变其极性（两个泵） 适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）3离子交换色谱 原理：离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，而离子对交换剂具有不同的亲和力而达到分离。溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法分离。 3离子交换色谱阳离子交换： M（Na+-O3S树脂） （ M+-

13、O3S树脂）+Na+溶剂中溶剂中阴离子交换： X- （Cl-+R4N树脂） （ Cl-+R4N树脂）+Cl-四、空间排斥（阻）色谱固定相为凝胶（gel)，通常为交联葡聚糖凝胶。原理：溶质在两相中按分子大小进行分离。分离只与凝胶孔径的分布和溶质的流体力学体积或分子的大小有关。硅胶型、聚苯乙烯型、葡聚糖凝胶型空间排斥（阻）色谱Size Exclusion Chromatography空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR空间排斥（阻）色谱Size Exclusi

14、on ChromatographyM.W.tR空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR空间排斥（阻）色谱Size Exclusion ChromatographyM.W.tR特点：样品出峰在溶剂之前，柱内峰扩展较小，半峰宽窄。固定相和流动相选择简单。相对分子量范围较宽，样品溶解性好即可。化学键合相色谱Bonded Phase ChromatographySiOH+ ROHSiOR + H2OSiOH+ R3SiClSiOSiR3 + HCl1 功能基团的引入方法 液相色谱法固定相液-液色谱法及离子对色谱法固定相液-固吸附色谱法固定相离子交话色谱法

15、固定相排阻色谱法固定相液-液色谱法及离子对色谱法固定相全多孔型担体表层多孔型担体担体固定液：强极性:，- 氧二丙腈中等极性：聚乙二醇- 400非极性：角鲨烷液-液色谱法及离子对色谱法固定相通过化学键把有机分子结合到担体表面化学键合固定相硅氧碳键型：硅碳键型:硅氮键型：硅氧硅碳键型：SiOCSiCSiNSiOSiC化学键合相色谱Bonded Phase ChromatographySiSiSiOOOOOHOHOH+RSiCl3SiSiSiOOOOOOOSiR硅胶表面硅胶表面化学键合相色谱Bonded Phase ChromatographyR-C4, -C8, -C18-C6H5, -CN, -

16、NH2-SO3H, -COOH, -NR4Cl-特点：表面没有液坑，比一般液体固定相传质快；无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；可以键合不同的官能团，能灵活的改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗脱，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集；化学键合相色谱Bonded Phase Chromatography正相色谱3 反相色谱 RP-HPLC4 反相离子对色谱 RP-Ion-Pair HPLCNM(HQS)n2-n液-固吸附色谱法固定相吸附剂：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺担体：全多孔型、薄壳型510um的硅胶微粒（全多孔型）离子交话色谱法固定相按担体分：薄膜型离子交换树脂

17、离子交换键合固定相键合薄壳型键合微粒型按官能团分：阳离子交换树脂阴离子交换树脂强酸型阳离子交换树脂弱酸型阳离子交换树脂强酸型阴离子交换树脂弱酸型阴离子交换树脂排阻色谱法固定相软质凝胶 半硬质凝胶硬质凝胶葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚凝胶多孔硅胶、多孔玻珠流动相为水，只能用于常压流动相为非极性有机溶剂，能耐较高压，流速不宜大流动相溶剂，压力，流速、PH或离子强度影响小，适合于较高流速下操作 液相色谱法流动相流动相的纯度避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂样品在流动相中要溶解溶剂的粘度要小应与检测器匹配选择流动相应注意的因素：调节流动相的极性，通过多次试验，以选择到合适的溶剂

18、。流动相极性的选择：正相色谱溶剂的选择底剂：低极性溶剂洗脱剂：极性较强的针对性溶剂反相色谱溶剂的选择底剂：极性溶剂洗脱剂：不同配比的有机溶剂离交色谱流动相的选择：排阻色谱法溶剂的选择分析介质：水组分保留值的调节：调节盐浓度（离子强度）调节PH溶剂性质与凝胶相适应溶剂粘度低液相色谱仪单元组件基本组件高压输液泵色谱柱检测器数据系统记录仪积分仪色谱工作站其余组件在线脱气装置梯度洗脱装置自动进样系统全自动控制系统柱后反应系统液相色谱流程图PUMPDetectorWData station (Recorder) or Collection高效液相色谱仪流动相前处理高压泵进样装置色谱柱检测器控制与记录系统

19、1.流动相的前处理流动相过滤：或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液1.流动相的前处理减压抽滤脱气法低溶性惰性气体导入替换超声脱气流动相脱气： 高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。2.高压泵高压泵的基本要求流量准确可调。对于一般的分析工作而言，流动相的流速在，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过

20、电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒（3-10粒径）的填料，在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器 泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于。泵的结构材料应耐化学腐蚀。 泵分类输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵 输液泵的流量稳定性非常重要，流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。输液泵按工作方式

21、分为往复式柱塞泵和气动放大泵两大类 气动放大泵泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。泵压力由两活塞的面积比决定。操作简便，流量范围大，但流速取决于溶剂粘度和柱渗透性。液缸大不便清洗。流量有波动。特点：高压、无脉动、成本低，用空气压缩机或气体钢瓶低压驱动，操作成本低。缺点是更换溶剂困难。气动放大泵往复式高压恒流泵柱塞泵原理高效液相色谱法 HPLC梯度洗脱（淋洗）低压梯度高压梯度PUMPPUMPPUMP浓度时间梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯

22、度洗脱中溶质k值的变化是通过流动相的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。梯度洗脱形式的选择梯度洗脱：优点： 可以提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离度。注意事项： 溶剂纯度要高，否则梯度洗脱重现性差。溶剂互溶性要好选择合适的检测器进样装置检测器紫外光度检测器荧光检测器差示折光检测器电导检测器蒸发光散射质量检测器 性能/检测器紫外荧光折光安培电导测量参数吸光度荧光强度折射率电流电导率类型选择性选择性通用选择性选择性池体积11032031011噪声/测量参数单位10-410-310-710-910-3最小检测浓度/g/mL10-1010-1110-71

23、0-12103线性范围103103104105104温度影响小小大大大流速影响无无有有有可否用于梯度洗脱能能不能不能不能对样品有无破性无无无无无检测器的主要性能 紫外光度检测器紫外-可见光检测器（UVD）又称紫外检测器。约有80的样品可以使用这种检测器，是HPLC中应用最广泛的检测器。它可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型。固定波长紫外检测器常采用汞灯的254nm或280nm谱线，许多有机官能团可吸收这些波长。可变波长紫外检测器实际上是紫外可见分光光度计作检测器。它既可测紫外区（190350nm)的光吸收变化，也可向可见光区(350700nm)延伸。紫外光度检测器紫外检测器由光源

24、、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。光学系统如图，由光源产生波长连续可调的紫外光或可见光，经过透镜和遮光板变成两束平行光，无样品通过时，参比池和样品池通过的光强度相等，光电管输出相同，无信号产生；有样品通过时，由于样品对光的吸收，参比池和样品池通过的光强度不相等，有信号产生。根据朗伯比尔定律，样品浓度越大，产生的信号越大，紫外检测器灵敏度高，检测下限约为10-10gmL；而且线性范围广，对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱;不破坏样品，可用于制备。紫外检测器缺点是只对具有-或P-共轭结构的化合物才能检测。流动相

25、的选择有一定限制。UVD广泛应用源于以下的特点:（1）灵敏度高；噪声低，可降至10-4。最小检测浓度达10-10 g/mL。最小检测量达10-12 g数量级。线性范围宽，应用广泛。（2）对流动相基本无响应，属溶质性能检测器。受操作条件变化和外界影响很小，一般对流速和温度不太敏感，适用于梯度洗脱。（3）属选择性检测器，对无紫外吸收的物质如饱和烃及有关衍生物无响应。（4）需选用无紫外吸收持性的溶剂作流动相。（5）属浓度敏感型检测器。（6）属非破坏性检测器，可要用于制备色谱，也能与其它检测器串联使用。（7）结构简单，维修方便。光电二极管阵列吸光度检测器 1982年惠普公司推出世界上首台光电二极管阵列

26、检测器以来，HPLC获得许多重大发展，一次进样可得到更多信息，数据处理更快。光电二极管阵列检测器有1024个二极管阵列，是同时可以得到吸光度、波长、时间这样三维光谱-色谱图情报的检测器。能以实际的时间瞬时测定在所有波长上的吸光度，可得到立体的光谱-色谱图。为分析工作者提供了十分丰富的定性定量信息。 光电二极管阵列吸光度检测器(photodiode array detector； PDAD)(1)在药物学和毒物学中的应用生物体内的毒品药物代谢产物的研究鉴定是个难题，尤其是浓度低及复杂生物基体组成变化时，识别更困难。药物代谢光谱往往与原药物相似。用二极管阵列检测器，可以将每个色谱峰的光谱图与原药物

27、光谱图进行比较来确认原药代谢物色谱峰。(2) 在生物科学中的应用肽和蛋白质的制备过程中，必须控制最终产品的纯度。高效液相色谱法可分离出肽和蛋白质中的杂质。由于肽和蛋白质的光谱差异性很小，用普通紫外检测器不能检测出肽和蛋白质中的杂质，只有利用极管阵列检测器提供的高重现性光谱才能准确测定。(3) 在环境科学中的应用饮用水中农药污物的标准分析方法是GC-MS联用法。但对不稳定化合物，HPLC是一种理想方法。利用二极管阵列检测器结合自动谱图检索，成功分析了饮用水中的苯脲类除草剂、三嗪类农药及甲氨酸脂。有文献报导在河水检测中，利用固相萃取-液相色谱-二极管阵列检测器建立自动报警系统：该系统利用聚合物固相

28、萃取装置和二极管阵列检测器，在5060min内可分析100mL河水中100150种有机微量污物。 光电二极管阵列吸光度检测器 1982年惠普公司推出世界上首台光电二极管阵列检测器以来，HPLC获得许多重大发展，一次进样可得到更多信息，数据处理更快。光电二极管阵列检测器有1024个二极管阵列，是同时可以得到吸光度、波长、时间这样三维光谱-色谱图情报的检测器。能以实际的时间瞬时测定在所有波长上的吸光度，可得到立体的光谱-色谱图。为分析工作者提供了十分丰富的定性定量信息。 示差折光检测器（differential refractive index detector）工作原理示差折光检测器是通过连续测

29、定色谱柱流出液折光率的变化来检测样品浓度的。就是检测参比池（流动相本身）和样品池中流动相之间的折光率差值。差值与浓度呈正比。见图，当参比池与测量池充满流动相时，它们的折光率相等，此时，光强相抵消，当测量池有组分时，因折光率与流动相不同，则折光发生一个距离的偏转，偏转程度与组分的性质、浓度有关。 偏转式差示折光检测器光路图 结构示差折光检测器有反射型和折射型。反射式示差折光检测器原理：光在两种不同物质界面的反射百分率与入射角和两种物质的折射率成正比。如果入射角固定，光线反射百分率仅与这两种物质的折射率成正比。光通过仅有流动相的参比池时，由于流动相组成不变，故其折射率是固定的；光通过工作池时，由于

30、存在待测组分而使折射率改变，从而引起光强度的变化，测量光强度的变化，即可测出该组分浓度的变化。偏转式示差折光检测器原理：当一束光透过折射率不同的两种物质时，此光束会发生一定程度的偏转，其偏转程度正比于两物质折射率之差。特点（1）凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可以使用这种检测器。因此是一种通用型检测器。它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能检测。示差折光检测器还适用于流动相紫外吸收本底大，不适合用紫外检测器的体系。在凝胶色谱中示差折光检测器是必不可少的，尤其是对聚合物，如聚乙烯、聚乙二醇、丁苯橡胶等的分子量分布的测定。（2）属浓度敏感型检测器。其响应信号与溶质浓度成正

31、比。（3）示差折光检测器属于中等灵敏度检测器，灵敏度不高是差折光检测器的最大缺点。最小检测浓度达10-6 10-7g/mL，不能做痕量分析。线性范围宽小于105。（4）示差折光检测器对压力和温度变化敏感。折光物质由于压力和温度变化引起该物质密度变化，而导至折射率的改变。（5）示差折光检测器最常用的溶剂是水，原则上所有透明溶剂都可以使用。流动相强度与的折射率无关。选择适合的溶剂，检测器的响应可以加强。示差折光检测器最大的优点是其通用性，但这同时也是它的缺点。由于溶剂之间的折射率只相差零点几个折光单位，因此溶剂组成的任何变化对测定都有有明显影响，如二元、三元溶剂混合不完全；色谱柱漏液；溶剂中有气泡

32、等。一般空气饱和溶剂的折射率较稳定，故常采用空气饱和溶剂作流动相。另外，为避免流通池中气泡的形成，还要将检测器的流动相出口位置提高。（6）示差折光检测器不能用于梯度洗脱。荧光检测器(fluorescence detector；FD) 荧光检测器适用于本身具有荧光的物质，或将无荧光物质衍生成荧光体物质的检测。工作原理:物质的分子或原子经光照射后，有些电子被激发至较高的能级，这些电子从高能级跃至低能级时，物质会发出比入射光波长较长的光，这种光称为荧光。在其他条件一定的情况下，荧光强度与物质的浓度成正比。许多有机化合物具有天然荧光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反应法或柱前反应法加入荧光化试剂，使

33、其转化为具有荧光活性的衍生物。在紫外光激发下，荧光活性物质产生荧光，由光电倍增管转变为电信号。直角型滤色片荧光检测器光路图特点（1）检测器灵敏度非常高，其检出量可达10-13g，荧光检测器灵敏度比紫外检测器高出23个数量级，适合于痕量分析。蒽是常用的衡量检测器灵敏度的基准物质。（2）有良好的选择性。荧光检测器的高选择性能够避免不发荧光分子的干扰，这是其独特的优点。它适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、胺类、维生素、蛋白质等荧光物质的测定。（3）线性范围较宽，约104105。（4）受外界条件的影响较小。（5）只要选择作流动相的溶剂不发荧光，荧光检测器就能用于梯度洗脱。（6）其缺点是应用范围较

34、窄。 电导检测器已成为离子色谱最常用的检测器。与安培检测器不同，电导检测池内没有化学反应发生，电导检测器是通过测量溶液中离子的电导变化来测定样品浓度的。电导检测器结构简单、成本低、线性范围宽、死体积小。原则上离子状态的物质都可以用电导检测器检测。电导检测器是一种通用型的电化学检测器。电导检测器蒸发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD)HPLC的发展中受到限制的一个原因, 就是缺少像GC中的FID一样的灵敏、通用型的检测器。20世纪80年代后研制的蒸发散射质量检测器给这一领域带来希望，并向具有真正通用型意义的检测器方向发展

35、。这就是：样品结构不需要具备紫外发色团和合适的折射率；对梯度洗脱和流动相系统的温度变化不敏感；对各种物质的响应因子很接近；在一次分析中可以同时检测主要成分和杂质。 蒸发光散射质量检测器(Evaporative Light-Scatting Mass Detector, ELSD)原理在一定的条件下，光散射强度正比于溶质粒子的大小和数量。散射光强度与样品微粒质量的关系为 I = k mb 式中，m为微粒质量，k、b为实验条件（如温度、流动相性质）决定的常数。因此可根据散射光强度对样品进行定量分析。散射质量检测和电导测定一样，电导是所有离子的通用性质，光散射是所有粒子的通用性质。对于色谱法来说，溶

36、质已经分离，关键的问题是如何除去流动相和保证检测条件的一致性。经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器，被高速的载气流（氦气、氮气或空气）喷成一种薄雾。这些雾粒子进入可控制温度的蒸发器（漂移管）中，使流动相气化蒸发，溶剂蒸发后剩下的不挥发组分成为微小的雾状颗粒，进入光散射池进行检测。在光散射池中溶质被光源照射而产生光散射，根据散射光强度正比于溶质粒子数目及粒子的大小，确定组分的含量。蒸发散射质量检测器的工作原理：（1）雾化池中雾化：经色谱分离的组分随流动相进入与色谱柱出口直接相连的雾化器针管中，在雾化器末端器流出物与高速气流（雾化载气流速：2 5 L / min）混合成均匀的气溶胶雾状颗粒。（2）

37、漂移管中蒸发：这些气溶胶雾状颗粒进入可以控制温度（蒸发器温度：100 180 ）的蒸发漂移管中，使流动相汽化蒸发，只剩下挥发性较小的被测物质雾状颗粒，它们高速通过蒸发漂移管进入光散射池。（3）光电检测器中检测：在光散射池中，光源光线通过光散射池中的被测物质雾状颗粒，然后被光阱捕集，以防止反射。样品颗粒散射光源发出的光用光电检测器接收，转换成电信号。蒸气状态溶剂通过光路时，光线反射到检测器上成为稳定的基线信号。雾状溶质颗粒通过光路时，被检测器收集。测量得的信号与在光散射池中样品的量成正比。结构 (l)通用性强，灵敏度高于示差折光检测器。灵敏度低于荧光、紫外检测器。(2)对流动相系统温度变化不敏感

38、。可进行梯度洗脱。(3)响应因子具有一致性。蒸发散射质量检测器的响应值仅取决于光束中溶质颗粒的大小和数量，检测器对的有物质几乎具有相同的响应因子。因此无需测定定量校正因子。(4)可消除流动相和杂质的干扰，提高了分辩率。与光吸收检测器相比，能解决最困难的HPLC检测问题。如磷脂、皂甙、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物的检测。(5)便于应用于质谱分析。因为蒸发散射质量检测器与质谱条件的要求是一致的。(6) 蒸发散射质量检测器受样品组分和流动相挥发性因素限制。要求样品组分应是非挥发性或半挥发性的，而流动相应是挥发性溶剂。(7) 对某些样品，蒸发散射质量检测器线性范围窄，有时不呈现线性关系，定量分析较为复杂。蒸发散射质量检测器的优缺点色谱数据处理系统 峰的检测峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。有各种判别峰的起点与终点的方法,各有利用弊,一般常采用下面两种方式