常见内分泌遗传病的基因检测医学教学课件

1、常见内分泌遗传病的基因检测第1页，共75页。一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录第2页，共75页。遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。单基因病：Thalassemias(地中海贫血)DMD(假肥大型肌营养不良)多基因病高血压染色体病染色体数目/结构改变Trisomy 21 Down syndromeTrisomy 18 Edward syndromeTrisomy 13 Plateau syndrome47,XXY Kl

2、inefelter syndrome45,X Turner syndrome69,XXXY Abortus异位 (平衡/不平衡)体细胞病体细胞遗传物质的改变，癌。视网膜母细胞瘤线粒体基因病由于线粒体DNA（mtDNA）上的基因突变所致的遗传病，呈母系遗传，如MELAS。一、遗传与人类疾病第3页，共75页。单基因遗传病的遗传方式常染色体显性SCA1 , SCA2, SCA3, 常染色体隐性SRD5A2, CYP21A2X-连锁显性Rett综合征(RETT syndrome)X-连锁隐性雄激素不敏感综合征(androgen insensitivity syndrome )Y-连锁Y连锁遗传性耳聋(

3、Y-linked hereditary hearing impairment)线粒体母系遗传： 线粒体病(MELAS, MERRF, etc.)第4页，共75页。染色体与基因第5页，共75页。基因组成第6页，共75页。一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录第7页，共75页。疾病概述出生缺陷的危害死亡率大幅升高导致儿童和成人残疾给本人、家庭造成极大的不幸，带来极为沉重的社会和经济负担，将有碍于提高人口素质。9.12中国预防出生缺陷日二、为什么要建立基因检

4、测？第8页，共75页。疾病概述遗传因素环境因素或二者的共同作用出生缺陷的发生原因第9页，共75页。疾病概述出生缺陷预防措施第10页，共75页。疾病概述降低出生缺陷的武器第11页，共75页。基因检测的意义1： -有效的遗传咨询，降低出生缺陷确诊遗传咨询产前诊断第12页，共75页。基因检测的意义2：-指导治疗肿瘤的个体化治疗预防：药物性致聋可治性/部分可治性遗传病遗传代谢病：PKU，希特林蛋白缺乏症，伴有高同型半胱氨酸血症MMA肝豆状核变性，低钾性周期性瘫痪，原发性震颤发作性非运动诱发性运动障碍原发性肌张力障碍先天性肌强直手术治疗原发性高草酸尿症神经纤维瘤结节硬化症第13页，共75页。一、遗传与人

5、类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录第14页，共75页。遗传病检查基因突变蛋白质改变代谢异常临床表现基因检测酶活性测定质谱检测临床诊断第15页，共75页。 微小突变 拷贝数变异复杂变异DMD多巴反应性肌张力障碍肝豆状核变性脂质沉积性肌病脆性综合征遗传共济失调亨廷顿病FSHDOPMDPWS综合征Angelman地贫Down syndrome如何检测基因突变？遗传病都是从基因突变开始的第16页，共75页。基因检测的目的与策略目的1：有无突变？策略1：直接检测突变策略

6、2：连锁分析间接检测有无携带突变目的2：何种突变？策略：直接检测突变第17页，共75页。突变类型方法举例微小突变错义/无义突变剪接突变调控区序列突变小缺失/插入基因测序(Sanger测序、二代测序NGS)熔点曲线地贫血友病乙肝病毒拷贝数变异简单拷贝复杂拷贝定量PCR/片段分析PCR; TP-PCR; TP-msPCR; msPCR强直性肌营养不良肯尼迪病大片段插入/缺失连接酶依赖性探针扩增（MLPA技术）Southern blotFISHaCGH假肥大型肌营养不良脊肌萎缩症复杂的重排长片段PCR血友病表观遗传变异msPCR; ms-MLPA天使综合征基因检测方法第18页，共75页。直接诊断策略

7、-直接检测基因的各种突变 微小突变（“点突变”） 第一代(Sanger)测序 苯丙酮尿症 甲基丙二酸血症 肝豆状核变性 拷贝数变异片段分析Southern blot脆性综合征遗传共济失调亨廷顿病FSHD复杂变异MLPAFISHPWS综合征地贫下一代测序NGS基因芯片 CMA第19页，共75页。高级的诊断技术-CMA和NGS测序“高密度，灵活定制，微量样品”数千美元测定全基因组第20页，共75页。间接诊断策略-多态性连锁分析、关联分析 连锁分析例子间接诊断基因尚未被定位或阐明找不到突变产前诊断多态性连锁分析寻找具有基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等，并判断受检者是否存在。第21页

8、，共75页。CREDIT: JOE SUTLIFF Science, Vol 291: 1221.Fishing in a More Effective Way!选择哪种技术，要看具体想解决的问题第22页，共75页。一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录第23页，共75页。经典的直接测序方法，基因突变检测的“金标准”；主要检测微小的基因突变（包括点突变、微小缺失或重复）；仅适用于单基因遗传病检测，无法检测多基因遗传病；常用的基因检测技术平台及特点3、一

9、代测序：Sanger测序1、多重连接酶依赖性探针扩增技术（MLPA）探针与靶序列DNA进行杂交，通过探针的特异化连接、PCR扩增，收集数据并进行分析；可应用于缺失、重复突变检测；2、基于PCR的片段分析技术以PCR技术为基础；主要检测动态突变（指DNA中的核苷酸（主要为三核苷酸）重复序列的拷贝数发生扩增而产生的突变）；第24页，共75页。4、下代测序/高通量测序(NGS)：革命性技术发展对传统测序一次革命性的改变，通过边合成边测序，一次可并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定；可对多个基因共同作用引起遗传病进行测度检测，能更好、更快确诊各种遗传病；主流平台： Roche 454焦磷酸测序

10、； Illumina Solexa 合成测序； ABI SOLiD连接法测序；第25页，共75页。疾病概述（一）MLPA技术介绍/WebForms/WebFormMain.aspx原理：利用可与样本DNA正确杂交并被连接酶连接的探针进行扩增和定量分析。MLPA的典型特点是，它不是扩增靶序列，而是扩增与靶序列结合的MLPA探针。第26页，共75页。MLPA技术特点第27页，共75页。MLPA应用范围染色体异常（数目、重排、染色体亚端粒区域的基因拷贝数变化 ）遗传疾病基因缺失、重复分析单核苷酸多态性(SNP)和突变检测 基因甲基化检测肿瘤诊断与治疗方面的应用mRNA研究等第28页，共75页。案例一

11、第29页，共75页。第30页，共75页。第31页，共75页。第32页，共75页。（二）片段分析技术第33页，共75页。 动态突变：动态突变是指DNA中的核苷酸（主要为三核苷酸）重复序列的拷贝数发生扩增而产生的突变。动态突变伴随着世代的传递而不断扩增，重复序列的拷贝数越来越多，在达到一定的倍数后就导致疾病的发生，其发病率和疾病的严重性也逐代升高加重。eg:脆性X综合征是由FMR1基因（Xq27.3）的CGG重复数扩增而引起的，正常人重复数为645次，前突变为55-200，全突变则200次。需联合应用std-PCR及TP-PCR技术诊断脆性X综合征。第34页，共75页。特殊PCR方法std-PCR

12、原理由正反向引物扩增包含了重复序列的目的片段，检测目的片段的长度，从而计算出重复区的重复次数。TP-PCR原理PCR的反向引物被设计与致病基因的重复序列进行杂交。各种大小不一的序列在三重PCR反应中被扩增出来。如果重复数量增加了，一个明显的PCR产物轮廓（梯形轮廓）会在峰图中出现。第35页，共75页。 片段分析主要适用项目（动态突变）SCA（脊髓小脑共济失调）FRDA（Friedreich共济失调）HD（亨廷顿舞蹈病）KD（肯尼迪病）DM（强直性肌营养不良）FraX（脆性X综合征）第36页，共75页。SCA3片段分析第37页，共75页。（三）Sanger测序确定一条染色体片断上的碱基顺序。Sa

13、nger法：在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）ddX的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接电泳谁终止，碱基就是谁此方法获1974年的Nobel奖第38页，共75页。分析流程记录SNP编号和命名是否突变命名查数据库错义突变Polyphen预测非编码区同义突变剪接位点预测Google查询图形质量判断查SNP位点合格结果解释测序图形数据分析第39页，共75页。BTD基因测序结果父亲患儿母亲c.637delCc.1387TGc.1387TGc.637delC正常型正常型第40页，共75页。（四）高通量测序 高通量

14、测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 NGS主流平台包括Roche 454焦磷酸测序、Illumina Solexa 合成测序、ABI SOLiD连接法测序、单分子测序技术以及由life techlogies 公司推出的Ion Torrent PGM（PersonalGenomeMachine个体化操作基因组测序仪）半导体测序技术。第41页，共75页。传统的分子遗传检测一个项目检测一种疾

15、病某些复杂遗传病十分复杂，十分难以有效检测：ALS智力障碍肢带型肌营养不良第42页，共75页。酶学分析粘多糖症脑白质病-ASAKrabbe病肌肉病理LGMD免疫组化染色体与分子生化 与酶学形态分子通量 检测能力 第43页，共75页。Life: Ion torrent PGM; Ion protonIllumina miseq高通量测序平台nextseq 500第44页，共75页。由Illumina开发，TruSight One Sequencing Panel全面覆盖4,813个与临床表型相关的基因。实验室可分析panel上的全部基因，或有选择地关注特定亚群。通过这种方式，单个panel可有效

16、代表整个新一代测序组合。Illumina miseq第45页，共75页。一、遗传与人类疾病什么是遗传病？遗传病的分类什么是基因？什么是“基因突变”？二、为什么要建立基因检测？三、如何检测基因突变？四、常用的基因检测技术平台及特点五、基因检测的临床应用目录第46页，共75页。金域检验基因检测项目介绍针对疾病遗传物质变异方式：多种检测平台整合针对临床不同检测需求：单一项目和套餐项目设置第47页，共75页。疑难遗传病基因检测方案适用情况：临床已排除常见病因，高度怀疑是遗传病，但是患者症状不典型或者症状设计多个系统，临床无法明确诊断，仅怀疑为遗传病解决方案：金域能根据临床提供患者症状和病例，选择与疾病

17、相关基因进行检测，提供个性化检测服务第48页，共75页。常见遗传病基因检测方案适用情况：患者症状典型，临床能明确诊断疾病类型或者具体疾病亚型，如腓骨肌萎缩病或者腓骨肌萎缩病1型等解决方案：金域可针对临床诊断进行相关基因检测常见遗传病基因检测系列列表骨骼肌基因基因检测系列线粒体相关基因检测系列周围神经疾病基因检测系列神经系统先天畸形基因检测系列阿兹海默症基因检测系列神经皮肤综合征基因检测系列遗传性共济失调基因检测系列微量元素与金属代谢障碍基因检测系列智力发育障碍基因检测系列遗传代谢病基因检测系列癫痫基因检测系列.第49页，共75页。临床仅能判断为遗传病无法明确为哪种遗传病可送检疑难遗传病基因检测

18、项目，一次检测与临床表现相关的基因临床能明确为哪种遗传代谢病，如能判断为糖原累积症，但是无法明确为糖原累积症的哪种亚型临床可送检糖原累积症整体检测项目，一次检测与糖原累积症相关基因临床能具体诊断为哪种疾病，如能明确为21羟化酶缺乏症临床可送检CYP21A2基因检测项目（MLPA检测、测序） 基因检测送检流程临床送检思路第50页，共75页。基因检测流程步骤采样对象说明申请-申请人、医生签署知情同意书、收费。为便于实验室与临床医生交流，希望医生留电话号码和e-mail。先证者检测先证者先证者父母通常先证者的样本都是必须的。当先证者的样本无法获得时，也可以检测肯定携带者。例如，X连锁隐性遗传患者的女

19、儿。父母的样本仅作备用。当先证者结果为“未发现异常”时，不对父母的样本进行检测。家系研究先证者父母其他家属有针对性地检测父亲和/或母亲、其他家属的样本。根据实际情况收费，例如：测序项目仅需检测特定的位点，按位点数目收费；MLPA项目，同先证者的收费遗传咨询-建议凭检测结果到具有资质的机构进行遗传咨询第51页，共75页。基因检测的样本类型第52页，共75页。第53页，共75页。DNA提取PCR仪ABI9700琼脂糖凝胶电泳 (伯乐)毛细管电泳(ABI3500 xl)结果分析MutationInterpret样本处理数据分析 结果解释突变命名SNP查找未知突变分析 SplicePort: 剪接分析

20、Polyphen2: 蛋白分析家系研究Important ReferencesPubmedGeneReviewsOMIMClinical communicationMLPA 测序基因检测流程第54页，共75页。基因总样本数阳性样本数阳性率WT113215.4%NR5A1711/7NR0B1(DAX1)261350%LHGCR1011/10CYP11B1911/9HSD3B2311/3CYP17A116956.3%POR1033/10HSD17B3511/5SRD5A2722940.3%AR351542.9%STAR322/3CYP21A224512450.6%CYP21A2 MLPA181266.7%性别发育相关基因MLPA检测16531.3%2012年5月2014年5月性别发育障碍相关基因阳性率总汇第55页，共75页。遗传代谢遗传病新生儿糖尿病青少年发病的成年型糖尿病糖原累积症溶酶体贮积症肉碱循环缺陷相关基因黏多糖症线粒体相关疾病智力发育障碍过氧化物酶体