生化设计性试验

1、生物化学与分子生物学设计性实验牛血清白蛋白的提取与鉴定III一、实验目的掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法培养学生自主设计实验发现问题和解决问题的能力、提高学生的实验技能及创新能力督促学生学习实验方法，端正实验态度，培养良好的实验习惯。二、实验原理1由于血清中含有白蛋白、a-球蛋白、。-球蛋白、丫-球蛋白等在 半饱和硫酸铵中可以分离出来，且各种蛋白质由于氨基酸组分、立体 构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。 由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0,所以 在缓冲液(pH值8.6 )中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移 动。牛血清白蛋白是 牛血清中的简单

2、 蛋白，是血 液的主要成 分 (38g/100ml),分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析 法：根据硫酸铵在半饱和时主要沉淀球蛋白，血清白蛋白不沉淀，离心后白蛋白主要在上清液中。在全饱和时沉淀所有蛋白，用此方法则 可将牛血清蛋白与球蛋白分开，即将血清中白蛋白与其它球蛋白分 离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。进而牛血清白蛋白进行分清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量离与鉴定。III4点样线清蛋白%球1白 叫球蛋白 A-球蛋白Y球笙白.清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果(+)清蛋白球蛋白ala2P等申占4.885.065.065426.85-73相对分子量（X104）6.920309

3、1515.630含量（%）576725496.2 121220ill实验步骤（一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷 酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加TpH7.2半饱和硫酸 铵溶液2mL,边加边摇，充分混匀，然后静止放置10分钟，再离心（2000r/min） 10min,将上清液倾入试管中。（二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙）用玻璃棒悬在盛有半杯 蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透 析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸 馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4

4、+，观察颜色变化（有NH4+ 存在时呈黄色到橙色），直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试 管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）电泳（1）点样 取1张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿 中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的 缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5 cm处作点样线，将牛血清样品 与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处 不同位置点样。（2） 电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时膜条无 光泽面向下，点样端置于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电 泳仪的电压为160伏，通电60min,关闭电源后用镊子将膜条取出。（3） 染色将膜条直接浸

5、于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液I、II、III中各漂洗 5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4 ）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。实验仪器和试剂仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色磁盘、滴管、 玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜。试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水， 用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2 饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂 洗液、0.4N氢氧化钠溶液。注意事项离心时注意天平的配平，速度由慢到快，否则离心管易破裂。透析时应多次换烧杯中的水并每换一次水前检查袋外水中有无 NH4+点样时