瓜氨酸的发酵生产

1、湖北大学发酵工程与设备课程设计题目：瓜氨酸的发酵生产专业年级：11级生物工程学生姓名：学 号：指导老师：2014年5月 24日目 录1前言1.1瓜氨酸性质瓜氨酸(citrulline),又名氨基甲酰鸟氨酸(carbamyl ornithine) , L- 瓜氨酸分子式为C6H13N3O3，分子量175.19，纯品为白色结品或结品粉末，有酸味 微溶于水，不溶于乙醇和乙醚。瓜氨酸的熔点为222C，等电点为5. 92,比旋 光度为a D25 = 21. 0。瓜氨酸最先由右贺太郎等在1914年从西瓜榨汁中分离 得到，此后由和田光德确认为一种氨基酸。1除了西瓜汁中含有瓜氨酸之外，野 西瓜叶、核桃仁、核桃

2、幼苗及种子中都含有瓜氨酸。瓜氨酸是一种非蛋白质a - 氨基酸，它具有肽键形成的能力，但是很少参与蛋白质的合成，仅存在于人类的 少数几种蛋白中，包括丝集蛋白、中间丝集蛋白、人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)、 聚角蛋白微丝蛋白及一些组蛋白。瓜氨酸结构式：% T ，尹N C CH CH2 OHch2NH1.2瓜氨酸的应用瓜氨酸在人体内代谢途径:,“KCifrX,.g.MAg图14 JU就醛的生物代谢途径防治前列腺疾病瓜氨酸对防治前列腺疾病，包括前列腺炎、前列腺肿胀、前列腺肥大、前列腺增生症、前列腺癌作用明显。治疗L-精氨酸缺乏引起的相关疾病和提高男性性功能 研究表明， 瓜氨酸在体内转化为人体必需氨基酸L-

3、精氨酸和一氧化氮，产生的L-精氨酸可 以弥补食物中L-精氨酸的缺乏；一氧化氮会活化酵素，导致平滑肌舒张，使人 的血管获得松弛，在维持心血管正常功能也发挥着重要作用4，同时也可以用 于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍。抗衰老和增强免疫力 研究发现瓜氨酸有较强的抗氧化能力，能 够清除羟基，增加精氨酸合成所需的NO,可有效保护DNA及PMN免受氧化反应 的侵害，可以作为抗衰老、提高免疫力的保健品，也可作为女性美容化妆品， 具有护肤防皱祛斑抗衰老之功效。提高运动员肌肉力量与耐力精氨酸对于人体的运动机能有良好的促进作用，L-瓜氨酸作为合成L-精氨酸的前体，在许多组织中能转化成L-精 氨酸，服用瓜氨酸能

4、有效的改善人体的抗疲劳能力，维护健康的心肺功能，提 高脑力清晰度，降低压力和克服沮丧情绪，平衡血糖浓度，增强人体的肌肉强 度，提高体能，在运动保健方面具有良好的作用。其它作用除了以上应用，瓜氨酸还可以用作异体排斥效应指示剂,诊断类风湿关节炎6 等。与瓜氨酸相关的疾病 与瓜氨酸相关的疾病有类风湿关节炎，瓜氨 酸是RA（RA是一种以关节滑膜炎为特征，以多发性关节炎为主要临床表现，进 而导致关节畸形、功能障碍的常见致残性疾病）患者血清中抗丝集蛋白相关抗体 识别的主要抗原决定簇成分。瓜氨酸血症，瓜氨酸血症是因为尿素循环中的精 氨酸琥珀酸合成酶(ASS)缺陷所致,患者血、尿及脑脊液中瓜氨酸均升高，由于尿

5、 素循环受阻引起高氨血症。1.3瓜氨酸的国内外生产及研究现状瓜氨酸生产方法化学法 化学法是被最早应用的生产瓜氨酸的方法，目前为止 也是生产瓜氨酸最主要的方法。化学法生产瓜氨酸是指在碱性条件下水解L-精 氨酸得L-瓜氨酸，过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体DL-瓜氨酸，影响 产品质量，生产过程中产生大量废水，污染环境，化学法生产也因此受到限制。 国内还报道过以L-鸟氨酸盐酸盐为原料与碱式碳酸铜反应生成二鸟氨酸合铜保 护a -NH2,用尿素对a -NH2进行甲酰化，得到二瓜氨酸合铜，后用H2S除铜离 子得到L-瓜氨酸。提取法由于天然产物中瓜氨酸含量极其有限，因此提取法受到原料来源限制，生产规模

6、小，工艺较复杂，分离提取困难，产酸率低，成本高， 经济效益差等缺点都严重限制了提取法在工业生产上的应用。但相对于传统方法， 提取法能得到天然瓜氨酸，因此找到一种广泛生长的富含瓜氨酸的植物也是一种 很好的研究方向。发酵法 发酵法是生产天然瓜氨酸的一种比较普遍的方法。欧 美对于这方面的研究报道比较多，方法也较成熟。尤其是日本对这方面的研究比 较深入。Okumura 等用 Bacillus subtilis K-X-1 A-9(ATCC 15562)发酵生产 瓜氨酸；日本Kyowa Hakko Kogyo公司网培养能够利用烃类作为碳源的石蜡节 杆菌Arthrobacter paraffineus精氨

7、酸需求型的突变株发酵生产瓜氨酸。酶法 酶法生产瓜氨酸采用Streptococcus faecalis， Clostridium perfringens，Micrococcus pyogenes，Bacillus pyocyaneus， Baker s yeastu广13微生物生产的精氨酸分解酶，精氨酸脱亚氨基酶，由精氨酸 生产瓜氨酸。酶法合成瓜氨酸，大多采用一步酶促反应，因而可避免瓜氨酸全合 成途径中复杂的反馈调节作用，使瓜氨酸可以积累到较高的浓度。Chibata等14 报道 Pseudomonas putida ATCC4359， Pseudomonas fluorescen IFO 308

8、1， Pseudomonas ovalis IAM 1002，Leuconostoc citrovorum ATCC 8081 等可以生 产精氨酸脱亚氨基酶，以L-精氨酸或DL-精氨酸为底物，得到较高浓度瓜氨酸。 曹瑜等15利用粪链球菌精氨酸脱亚胺酶转化L-精氨酸制备L-瓜氨酸。进而有报 道采用固定化粪链球菌酶法连续生产L-瓜氨酸16，该法可连续化生产，大大提 高生产效率，降低了生产成本。化学-生物法刘毅等17用化学-生物法制备D-精氨酸和L-瓜氨酸，通过添加催化剂，快速消旋为DL-精氨酸。后以DL-精氨酸为底物，利用酶法同时制备D-精氨酸和L-瓜氨酸D-精氨酸参与组成的多肽，可抑制癌症扩散，

9、 治疗生长激素释放过多造成的紊乱，还具有抑制DNA合成、前列腺癌细胞增殖 等功能。表L L-感毓晚生产方式比救西瓜提取法化学法酶法发醇法主要原料西m精匏酸精览酸院萄辘产酸率W0.529100%m4%以上回攻率S况83.58080成本(町元/吨)18, 9以上15以上15以上1。以内主箜存在问题受季节，产量、地含有旋轮好映体尸瓜筑酸.穿响原料成本高，度精产酸率较低域等因素再皑产品质量生产速程中产生大量酸成本限制废水，污染坏舅综上所述，采用发酵法生产爪氨酸是最有潜力的爪氨酸生产方式，但国内原 来存在看菌.种产陵率虬 不稳定等缺点所以未能实现工业化生产，采用割思路 新手段对瓜饕酸发酵进行改造优化，可

10、以实现芟大规模生产。2发酵工艺瓜氨酸发酵可以采用Bacillus subtilis K-X-1 A-9(ATCC 15562)、粪链球 菌(Streptococcus faecal)或者能够利用烃类作为碳源的石蜡节杆菌 Arthrobacter paraffineus精氨酸需求型的突变株，传统上采用研究透彻的生 长条件易控制的枯草芽孢杆菌19或黄色短杆菌进行L-瓜氨酸发酵。本课程设计题目以枯草芽孢杆菌为发酵菌种进行探究瓜氨酸的发酵工艺。瓜氨酸发酵采用通用的微生物液体发酵技术，工艺流程及发酵设备也基本相 同。2.1发酵工艺流程空气净化处理发酵的施程主发酵产物分离豌化 I成品或源、缄渔、 无机盐等

11、营拆 物质I 扩大培养保藏菌种斜血活化2.2发酵设备酵2.3瓜氨酸的分离提纯分离流程发爵鲤一魅建龚涉鼻留耕临麟埴箜一戢成沮折堇引术野孩交予层寅亲惜吸电E生勰术下祯三晚的麒略除朋魅瓣瓜氨酸的分离纯化，工业上？3发酵机制及原理瓜氨酸发酵是根据瓜氨酸在微生物细胞内的代谢途径来确定的，在微生物 细胞内有两条代谢途径，两条途径的主要区别在于某些参加反应步骤的酶不同以 及在个步骤的反馈或阻遏不同，大体上都是从谷氨酸(Glu )反应生成鸟氨酸(Orn) 再反应产生瓜氨酸(Cit)、精氨酸(Arg)。因此要得到瓜氨酸就需要在瓜氨酸反应 生成精氨酸过程中截断，所以可以采用Arg-或营养缺陷性类似物抗性多重突变株

12、 发酵生产瓜氨酸。用EE”制财响vm 反 giaWl-4成虱酸很4物代谢途楠i1： N乙酰谷氛酸合成爵2； N乙酰答氮酸激牌；3, N-乙酰谷叙酸-Y 半藤基 脱氢酩4： N乙袱鸟氮酸 8以基料移帆5： N-乙酸鸟氨酸虹6：岛瓠成氨 基俄基牡修牌；7：精知酸琥弟合成线；：精？XIR琥珀酸倒3b N-心酰芥薰兼合成加条M N酰答氨愀瀚懈士 N乙眺谷氯隔T#整 基脱氢隔：L N乙酸俗氟或干氛婚移曲负N乙酰谷泌腿乙酰身裁展乙 戡基转移醇协冉疑酸敏甲基转却酵：7=珀城琥始合成丽：&捕藐琥幼酸酣4菌种的制备及种子的扩大培养4.1扩大培养的基本流程：保藏菌种一斜面活化一一级种子摇瓶培养一二级种子罐培养一发

13、酵罐4.2实验室种子及种子罐种子的制备菌种制备也称种子制备，是指菌种在一定条件下，经过扩大培养成为具有一 定数量和质量的纯生产菌种的制备过程。以作接入发酵罐中进一步扩大菌体量及 合成产物之用。菌种制备过程就是选用保存在沙土管或冷冻管中的生产菌种，接种到琼脂斜 面培养基上，在25C（不同菌种温度不同）下培养57天（或较长时间）。所得 孢子还需进一步用较大表面积的固体培养基以获得更多孢子。将培养成熟的斜面 孢子制成悬浮液，接种到扁瓶固体培养基上，于2528C培养14天。将成熟的 扁瓶孢子于真空中抽十，使水分降至10%以下，并放入4C冰箱中备用。一次制 得的孢子瓶可在生产上延续使用半年左右。所获得的

14、大量孢子可直接作为种子罐 的种子，接种量一般在10%20%。5培养基5.1培养基的组成及制备枯草杆菌：葡萄糖11-13%，亚适量精氨酸0.5g/L，NHCl作氮源，磷盐（KH PO424和 K2HPO4），黄色短杆菌（精氨酸缺陷型突变株赋予磺胺胍抗性）：在11%葡萄糖发酵液 培养基中，可生成瓜氨酸30g/L，而在含有3%葡萄糖、0.5%乙酸铵的初始培养基 中，流加乙酸和乙酸胺混合液进行培养，则可最终生产瓜氨酸47g/L。5.2培养基的灭菌按培养基组成配置培养基后，为防止杂菌的污染，需采用湿热灭菌法对培养 基进行灭菌，即利用饱和蒸汽灭菌。在高温条件下，微生物细胞内的重要蛋白质， 如酶等，会发生不

15、可逆变性，导致微生物死亡。培养基的湿热灭菌方式有两种： 间歇灭菌（分批灭菌、实消）、连续灭菌（连消）。间歇灭菌间歇灭菌就是将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将 培养基和所用设备一起进行加热灭菌，通常也称为实罐灭菌。开始灭菌时，应先 放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过空气管向发酵罐内的培养基通入 蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到 70C左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120C， 罐压为一个大气压时，打开接种、不料、消泡剂、酸碱等管道阀门进行排气，当 然，在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应

16、通入蒸汽，而 在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。 保温结束后，依次关闭个排汽、进汽阀门，待罐内压力降下来后，向罐内通入无 菌蒸汽，在夹套或蛇管中通冷水降温，是培养基的温度降到所需的温度，进行下 一步的发酵和培养。这种灭菌方法不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备、蒸 汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，所以是中小型发酵工厂常用的培养基灭菌方法。灭菌设备及方式:消株补酸济料戚发赫罐的管路布置两个撮及连接管的蒸汽杀留连续灭菌连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加 热、保温和冷却而进行灭菌。连续灭菌的基本设备包括配料预热罐、连消塔、维 持罐

17、、冷却管。在灭菌过程中可以使用蒸汽喷射器，使培养基与高温蒸汽(140C) 直接接触，从而在短时间内可将培养基急速升温至预定的灭菌温度(126-132C), 然后短时间维持该温度灭菌，灭菌后的培养基通过一膨胀阀进入真空冷却器急速 冷却；也可以采用薄板换热器作为培养基的加热和冷却器，蒸汽在薄板换热器段 使培养基升温，经维持段保温一段时间后，培养基在薄板换热器的冷却段进行冷灭菌设备及方式：蒸汽 lTL冷却水却，从而可以使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程在同一设备内完成。与间歇 灭菌相比，连续灭菌最突出的优点是易于实现管道化和自控操作以及大规模生产， 因此连续灭菌越来越多的被用于培养基的灭菌。配料罐

18、泵 加热塔 维持罐冷却管灭菌介质保温段喷射加热连续灭菌流程原料介质 蒸汽T-140度L 3障板换热器连续灭菌流程韭持罐120 r出料35 UC1200蒸汽】47P进料 35 E 100 P120 UC发酵堵6无菌空气6.1无菌空气处理流程瓜氨酸发酵采用枯草芽孢杆菌作为发酵菌种，在发酵过程中需要无菌空气。 空气净化处理的目的是除菌，目前所采用的过滤介质必须在干燥条件下工作，因 此空气需要预处理以除去空气中的油、水和较大的颗粒，才能保证除菌效率。除菌的方法很多，如过滤除菌、热杀菌、静电除菌、辐射杀菌等，各种方 法的除菌效果、设备条件、经济指标各不相同。一般发酵工厂采用经济实用的过 滤除菌法，通过定

19、期灭菌的介质来过滤流过空气所含的微生物，而取得无菌空气 的。常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机、无机和 金属烧结材料等。无菌空气的制备大致包括以下过程：空气一高空取气管一除尘器一空气压 缩机一贮气罐一一级冷却器一油水分离器一二级冷却器一除雾气一加热器一总 过滤器一分过滤器一无菌空气。现在也有一些新型设备出现，比如以电脑式空气滤洁器代替高空采风塔， 以组合式空气除湿加热装置，代替分体式除油除水加热设备20 6.2无菌空气制备系统后空/罔思？到川空气压耶凯产生的热迎有大档】一-础iifli 槌日就跖SKiUJ-t一虹勺螂5-腮愚瑞8死卷航秒却衬； T 凋稼抠曹机】占一所她器

20、：，一削近谴雅椅一空弋嘛K塔空气0S L5-19 次冷郑和析水的空气曲处理源程1博室桀R 3粗过雄th 3空压机，4一詹蛔5- S析水喘I7忙气场|息一加热凯9一恩土泌器I 1。一分过涎器国1.5-2。二次吟却和析水的空气血姓理流程I一高空编凤I ?粗过携疆；3-空压机L 一冷却器5t 7折水髭I 8 1，堵19一抑焦器t 10空，总过展器* I】。空气分过渔器7发酵废物处理氨基酸发酵产生的废物主要有废水和尾气。7.1尾气处理发酵过程中排出的尾气中含有一些生产菌、杂菌以及噬菌体等，容易对环境 造成污染。国内外一些发酵企业对此的做法是把发酵罐、种子罐的尾气收集到一 只或数只装有杀菌药剂的回收罐中

21、，用泵进行循环吸收消毒灭菌，用蒸汽消毒残 液，并不定期更换药剂。207.2废水处理氨基酸生产过程中会产生母液和洗水两组废水，两种废水都含有浓度较高的 盐分和COD值。盐分主要为硫酸铵或氯化铵，COD则主要来自生产过程中氨基酸 产品和副反应等的残余物。处理技术的选择主要取决于废水的成分组成、要求达 到的处理效果及经济性。根据国内外工程实例及资料介绍，目前处理氨氮废水的实用方法主要有生物处理法、蒸馏法、折点加氯法、离子交换法及吹脱法、膜浓 缩法21以及活性污泥法。对于高浓度废水可以采用以下方法处理：提取菌体蛋 白后喷浆造粒生产复混肥；生产饲料酵母；生产家禽饲料添加剂。对于低浓度废 水目前主要采用厌

22、氧生物法处理。生产沈水康由CafOUlo PAW|牛产程锹撤水 I旅求盼知也M滩沉煌藏1一 q a = . |；顼W1侦学姓舞弟象：|出水观晚起围1溶水处理工艺流程固8参考文献刘娟，路欣欣，孟慧.瓜氨酸的药理作用及生产方法的研究进展J.药学 实践杂志，2011，29（3）： 173-216.王玉俊，赵虎.抗环瓜氨酸肽抗体检测的应用进展J.上海医学，2009, 32 （10）:931-934.Maritza J.R, Daniel H.P, Ruth B.C, et al. The rapeutic use of citrulline in cardiovascular disease J .

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