本科《食品酶学》课件第八章过氧化物酶

1、第七章 过氧化物酶2002.12.18第一节 过氧化物酶PEROXIDASEPOD属氧化还原酶类 , 系统命名为 EC1 . 1 1 . 1 . 7。研究意义果蔬中的 POD通常与新鲜产品或加工产品 (包括冷冻产品 )的风味和品质有关 。食品加工研究人员已将其活性列为果蔬加工的主要指标。了解果蔬中 POD所催化的反应、酶本身的特性及加工中怎样抑制其活性是非常重要的。一、分 类在自然界中分布广泛 。分类 :一是含铁 POD,二是黄素蛋白 POD。1）含铁 POD又分为高铁原卟啉 POD和高铁 POD。高铁原卟啉 POD为棕色 ,以高铁原卟啉为辅基, 存在于高等植物、动物和微生物中 ;高铁 POD

2、为绿色 , 以铁卟啉为辅基 ,但不同于高铁原卟啉 ,存在于动物器官和奶中 。2）黄素蛋白 POD以黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD)为辅基 ,存在于动物组织和微生物中。这 2组含铁 POD可用酸化丙酮处理来区分 ,它可从高铁原卟啉 POD的蛋白质部分除去高铁血红素 ,但对高铁 POD则没有影响。二、过氧化物酶催化的反应POD能催化 4种类型的反应 :(1 )过氧化反应 ;(2 )氧化反应 ; (3 )过氧化氢反应 ; (4)羟基化反应1 、POD主要催化过氧化反应此反应需要有 2个底物 :过氧化物和氢供体。过氧化反应表示如下：ROOH+AH2 -H2 O +ROH +A 其中, R为 H, CH3

3、, C2 H5; AH2 为氢供体还原形式 , A为氢供体氧化形式 。底物的影响过氧化物底物主要是 H2 O2 。高浓度H2 O2 又可抑制 POD活性, 用过氧化氢酶消除过多的 H2 O2又能使 POD恢复活性。 H2 O2对 POD抑活程度取决于酶和 H2 O2浓度 2个方面。马铃薯 POD活性最高时的 H2 O2浓度为 0 . 74 1 0 -2 mol/ L(p H 5. 0 ),辣根 POD则为 0 . 3 1 0 -2 mol/ L。羟甲基过氧化物既是辣根 POD的一个底物 ,又可抑制其活性 。可以认为 POD需要一个游离 HOO-基团 ,以利于与过氧化物反应。氢供体POD对氢供体

4、底物的专一性较低 ,可能是由于植物中存在不同形式和数量的 POD同功酶。许多物质都可以起到氢供体的作用 ,包括：酚类 (p-甲酚、愈创木酚、间苯二酚 )；芳香胺类 (苯胺、联苯胺、苯二胺、o-二茴香基二胺 )；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等。常见的是愈创木酚和间苯二酚。2、氧化反应POD在无氢过氧化物存在的情况下催化的反应需要有O2 和辅助因子。底物有草酸盐、草酰乙酸盐、酮基丙二酸盐、二羟基延胡索酸、吲哚乙酸 (IAA)等 ,NADH 和NADPH的氧化反应也需要辅助因子。反应具有定量关系，例如：二羟基延胡索酸+ O2 -二铜基琥珀酸+ H

5、2O反应经 2 3 min的诱导期后开始, 增加酶浓度和 H2 O2的量均可缩短诱导期。反应所需的辅助因子为 Mn2 +和某些酚类物质(通常为 2 ,4-二氯酚3、过氧化氢反应POD在无氢供体存在下可催化过氧化氢分解 : POD 2 H2 O2 - - 2 H2 O+ O2与过氧化反应及氧化反应的速率相比 ,此反应的速率可忽略不计。4、 POD的羟基化反应将单酚与 O2 反应, 产生 o-二羟基酚, 此反应需要有氢供体 (如二羟基延胡索酸等 )为酶作用提供必需的自由基 反应式为 : POD O2 +AH2 - H2 O+A被羟基化的物质有 p-甲酚、苯甲酸、水杨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等。三、过氧

6、化物酶的最适 pH1、POD的最适 pHPOD的最适 p H随酶的来源 (不同果蔬产品 )、同功酶的组成、氢供体底物及缓冲液等的不同而有差异。有些果蔬中 POD的最适 pH范围较宽, 原因是存在有不同最适p H的同功酶 ;另外 ,同一果蔬产品 POD的可溶性部分和化学结合部分的最适 p H值可能也不同。一些果蔬中 POD的最适 p H：葡萄 Malvasia， 5. 5 6. 0，愈创木酚底物番木瓜 5. 5和 6. 0，结合酶的可溶性酶葡萄 Gamay rouge， 4. 0绿芦笋 4. 2 5. 0葡萄 Gamay rouge 6. 0 7. 0，杨梅黄酮底物绿芦笋 4. 2 5. 0马铃

7、薯 5. 0 6. 0猕猴桃 5. 2 5. 5 邻苯二胺底物黄瓜 7. 0 酶的粗提液番茄 5. 0 5. 2； 苹果 5. 0 6. 0； 草莓 6. 0香蕉 4. 5 5. 0；芒果 4. 75；香蕉 5. 0 6. 0，凝胶过滤后的酶环境 p H的升高或降低会引起酶活性的下降。酸化后酶活的减弱是由于蛋白质的结构变化造成的 ,它由天然状态转为可逆的变性状态 (从分子水平上观察是酶分子中的亚铁原卟啉脱离酶蛋白引起的 )。或者是由于在pH(2 . 5 4. 5)介质中 ,酶活性随pH而变化与酶分子结构有关。酶溶液酸化后 , -螺旋结构受到破坏 ,出现了-结构的光谱特征 ，酶蛋白和辅基在酸化后

8、就分离。四、过氧化物酶的最适温度也与酶的原料种类、果蔬品种、同功酶的组成、缓冲液的 p H、酶的纯化程度等因素有关。葡萄 47，品种 de Chaunac 40，品种 Malvasia猕猴桃 50，纯化酶草莓 3 0番茄 3 5品种 Walters茄子 2 0可溶及离子键连部分绿芦笋 50 p H4. 5菜花 40以愈创木酚为底物五、 POD的热失活由于 POD与果蔬产品及其制品的变色和变味关系密切 ,因此常常需要用热处理的方法部分地或全部地抑制活性。从酶分子本身来看, POD的热失活包括以下过程: (1 )全酶分子辅基的解离 ; (2 ) 脱辅基酶蛋白构象的变化 ; (3 )辅基的修饰或降解

9、。影响耐热性的内在因素使用等电聚焦技术已证明不同 POD同功酶的耐热性存在差异 。另外 ,同一果蔬产品来源的不同类型的酶 ,耐热性也不同 ,如可溶性酶比颗粒酶的耐热性差、阴离子酶比阳离子酶热稳定性低 ,但酸性和碱性酶有类似的热稳定性。酶的纯化程度也可影响其热稳定性 ,粗酶比纯化酶热稳定性差。影响 POD热失活的外部因素p H、温度、受热时间等。在 p H=7. 0时 ,抑活效率最低 ,p H=4. 0时 ,抑活效率为 p H=7. 0时的 8倍 ,而 p H=1 0 . 0时为 pH=7. 0时的 2倍。在给定 p H条件下 ,控制 POD热失活的主要指标是热处理的时间和温度在一定温度下 ,热

10、处理时间足够长时会使 POD的失活更完全。但长时间加热对保持果蔬的营养和风味不利。水分活度也可影响 POD的热稳定性。菜花 50 , 1 5min，活性减少 98%,一级动力学 96 . 3 , 1 min，品种 Indian Snowball 50 , 3 0 min，50 %抑活葡萄 80 , 1 0 min，品种 Ohane,活性丧失 90 % 85 , 5min，品种 Malvasia,几乎完全抑活番木瓜 70 , 1 min，可溶性部分 ,活性丧失 94% 70 , 1 min，结合部分 ,活性丧失 55%香蕉 1 0 0 , 1 1 min 抑活 96 1 0 0 %柑桔 80以上

11、抑活 75%球芽甘蓝 98 , 4 7min，与原料体积大小有关芒果 70 , 2 6 min，活性丧失 90 % 75 , 1 2 min，活性丧失 90 % 80 , 1 . 2 min，活性丧失 90 % 80 , 5min，活性完全丧失 75 , 2 0 min，活性完全丧失果蔬中 POD热抑活的方法主要是水漂烫。绿菜花于 95下漂烫 4min可降低总POD(包括可溶性部分和离子结合部分 )活性，绿豌豆于 97下处理 1 min是极为有效。微波、离子辐射的利用 :优点是可降低漂烫过程中的热负荷。马铃薯用 1 . 5min微波处理、3 min沸水漂烫以及微波与漂烫各2 min来抑活 PO

12、D; 微波处理减至 1 min及增加漂烫时间至 5min都不能使 POD活性完全破坏 ,但却使马铃薯软化。香蕉用微波处理的效果取决于果实成熟度。POD热失活后的恢复和再生本世纪初人们就开始认识到：许多果蔬 POD在热失活后会恢复部分活性 ,已被认为是该酶的性质之一。（从分子水平上说 ,血红素部分与脱辅基酶蛋白可以再结合, 形成活性酶。很可能是蛋白质部分和辅基部分在某种程度上并未完全破坏 ,导致酶活还能恢复。）POD活性恢复的因素与果蔬的种类或品种有关。菠菜和马铃薯的 POD复活能力较强 。酶复活的程度则取决于酶抑活的程度，热处理的温度和时间、抑活后酶的贮藏温度以及酶的纯化程度等。菠菜为例菠菜在较低温度下热处理 ,酶活能恢复;而在 1 2 1 1 43下热处理后未见酶复活。一定温度下 ,热处理时间愈长 ,酶复活愈少 ,处理时间充足能防止酶复活的时间 。在 3 0或室温下存放 ,POD可在几小时至几天内开始恢复 ;而在深度冷冻下 (-1 8 )需几个月才能恢复。化学物质可以抑制过氧化物酶作用机理：(1 )抑活 POD本身 ; (2 )与 POD底物起反应 ; (3 )与