药物的含量测定与分析方法的验证学习培训课件

1、第四章药物的含量测定与分析方法的验证基本内容一、定量分析方法的分类二、药物分析方法的验证三、分析样品的制备第一节 定量分析方法分类与特点一、容量分析法 （一）容量分析法的特点 几个概念：容量分析法、滴定终点、滴定误差 操作简单、快速； 比较准确（相对误差0.2%）； 仪器普通易得 常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选（二）容量分析法的计算 2.滴定度的计算 aA（待测物） + bB（滴定液） cC + dD a b T/M 1cT = ca/bMc：滴定液浓度 (mol/L)M：被测物分子量1.滴定度（T）： 每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质的质量(mg)用溴酸钾法测定异烟肼

2、M(C6H7N3O)137.14的含量时，溴酸钾滴定液的摩尔浓度为0.02mol/L（以KBrO3为单元），化学反应式如下：计算滴定度3C6H7N3O2KBrO33C6H5NO2+3N2+KBr+3H2O3.百分含量的计算 W：供试品取样量 设至终点时，消耗滴定液体积为V ml则药物理论质量为VT浓度校正因数（1）直接滴定法（2）间接滴定法1）生成物滴定法 药物 + A B 滴定滴定剂 2）剩余滴定法（回滴法） 药物 + A（定、过量） 剩余的 A + B （回滴）V 空白试验V0往待测物或待测物溶液中准确地入过量的标准溶液I，使之与待测物进行反应，待反应完成后，再用另一种标准溶液II滴定剩余

3、的标准溶液I，该方法又称为返滴定法。 （1）反应慢：如 HCl 固体CaCO3 （2）没有合适的指示剂：Ag+ Cl- 先加过量的Ag+，使Cl-完全沉淀，再用SCN-滴定剩余的Ag+ 滴定反应：NH4SCN + Ag+ AgSCN（白色）+ NH4+ 指示剂反应：Fe3+ + SCN- Fe(SCN)2+ (红色）W司可巴比妥钠=0.1022g，cBr2=0.05mol/L，cNa2S2O30.1mol/L；V1=15.73ml，V0=23.21ml；MC12H17N2NaO3=260.27，FNa2S2O31.038。司可巴比妥钠的含量测定1.计算滴定度；2.计算百分含量。光谱分析法 紫外

4、可见分光光度法 UVVis 原子吸收分光光度法 AAS 荧光分析法 二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法 灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特点 准确度高，RSD（%）为2% 5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广泛 2. 朗伯-比耳定律 A = ECL 吸收系数：摩尔吸收系数 研究分子结构 百分吸收系数 含量测定吸收光谱范围：紫外：200400nm 可见：400760nm 3.仪器的校正和检定 吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波 长处测定 ，应符合P160表1中规定 波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身 所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正

5、杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液， 规定波长处测定透光率，应符合P160表2 中规定4. 对溶剂的要求: 含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收它们的使用范围均不能小于截止使用波长 石英吸收池、空气为空白 (nm) 溶剂 + 吸收池A 220240 0.40 241250 0.20 251300 0.10 300以上 0.055. 测定方法确定波长 要求供试品溶液的A应在0.30.7 狭缝调整 供试品溶液的吸光度对照品溶液的吸光度供试品溶液的浓度对照品溶液的浓度5. 测定方法1）对照品比较法：条件：A. 待测物与对照品在相同条件下测定B. 待测物与对照品浓度相近制剂：原料药：稀释

6、体积取样量平均片重片粉量2）吸收系数法吸光度百分吸收系数液层厚度，cm，如无特别注明，L=1cm可在手册或文献中查到盐酸氯丙嗪（规格2ml:50mg)的含量测定（Ch.P2015）：精密量取本品适量（50mg），置200ml量瓶中，用盐酸溶液（91000）稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用盐酸溶液（91000）稀释至刻度，摇匀，在254nm波长处测定吸光度,按C17H19ClN2SHCl的吸收系数（ ）为915计算。计算其标示量。4）比色法 加入显色剂后，按照对照品比较法测定。 影响显色因素很多，故需注意平行操作。 空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理三、色谱分析法 特点：高

7、灵敏度、 高效能、高速度、应用广泛 按分离原理：吸附；分配；离子交换；排阻色谱分类 按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC 根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最有力手段。 1. 对仪器一般要求 固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变 其他均可适当改变 色谱图20分钟内记录完毕 2. 系统适用性试验 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分离度：R = 2（tR2 tR1)/(W1 + W2); 应大于1.5 重复性：对照液连续进样5次，峰面积RSD2.0 拖尾因子：T = W0.05h/2

8、d1 应在0.95 1.05 （一）HPLC法（1）内标法加校正因子测定供试品中主成分含量对照品+内标物对照溶液，进样，测定，计算校正因子 3. 在含量测定中的应用供试品+内标供试品溶液，进样，测定供试品和内标物质的峰面积或峰高，计算含量 （2）外标法测定供试品主成分含量供试品供试品溶液对照品对照品溶液进样，测定，计算含量 缺点：不易准确控制进样量，宜用定量环进样1. 对GC仪器一般要求 载 气：氮气 色谱柱：填充柱或毛细管柱 填充柱：内径24mm，长110m，内装吸附剂 高分子多孔小球或涂渍固定液的载体 毛细管柱：内径0.20.5mm，长10100m，一 般为空心柱，内壁或载体经涂渍或交联

9、固定液检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕 （二）GC法色谱适用性实验、测定法：同HPLC第二节 药物分析方法验证均需对分析方法进行验证验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。起草药品质量标准生产工艺变更制剂组分改变原分析方法修订一、准确度是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度 1. 原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较2. 制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，

10、回收率计算同原料药向制剂中加入已知量的被测物进行测定与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较（二）具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3, 共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98.0%108.0%回收率试验精密称取盐酸小檗碱约40mg ，按处方比例加入其它组分和辅料，用适量沸腾的 0. 05mol/L H2SO4 溶解。放冷置室温，定量转移至250ml 量瓶中，并稀释至刻度。过滤，弃去初滤液，取续滤液 5.00ml 于100ml 量瓶中并稀释至刻度，按所选定的方法计算回收率。测定结果见下表。分光光度法测定连蒲双清片中盐酸小檗碱的含量 回收率试验取连蒲双清片粉适量（约

11、相当于盐酸小檗碱40mg)，精密称取，精密加入盐酸小檗碱约40mg ，用0.05mol/L H2SO4 溶解。放冷置室温，定量转移至250ml 量瓶中，并稀释至刻度。过滤，弃去初滤液，取续滤液 5.00ml 于100ml 量瓶中定容，按所选定的方法计算回收率。测定结果见下表。分光光度法测定连蒲双清片中盐酸小檗碱的含量 2. 相对标准偏差(RSD) 1. 标准偏差（SD或S） 二、精密度（一）精密度表示方法（二）验证内容 1. 重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2. 中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析 人员用不同设备测定结果的精密度。 3. 重现性 在不同实

12、验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限三、专属性指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性 鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性 （一）鉴别试验 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。 图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。 在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。 在杂质和降解物不能获得的情况下，可用已验证方法或药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方

13、法，比较两种方法。 四、检测限（LOD) 是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需准确定量，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC 2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N2或3时的相应浓度来确定检测限。 五、定量限（LOQ) 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。 杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。 六、线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被

14、测物浓度或量直接呈正比关系的程度。 回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好 可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出r。 如UV：制备一个标准系列，浓度点n =5 A=0.3-0.7 建立回归方程C = aA + b， r0.9999七、范围 如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%120%制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的20%。是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。 八、耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影

15、响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。 分析方法效能指标的具体应用：1. 用于鉴别试验：只要求专属性、耐用性和检测限2. 用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法： 用于定量：除检测限不要求外，其余指标均要求。 限度检查：只要求检测限、专属性、耐用性3. 原料、制剂的含量测定及溶出度测定：不要求检测限和 定量限，其余均要求。药物分析中常用的分析方法经有机破坏的分析方法不经有机破坏的分析方法 第三节 分析样品的制备 终点： 邻二氮菲

16、(+Fe3+)溶于热稀矿酸Fe2+铈量法Ce4+Fe3+指示剂:邻二氮菲(+Fe2+)红色淡蓝色（一）直接溶解法 例如：富马酸亚铁的含量测定（二）经水解后测定法 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O 1. 碱水解后测定法适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃例如：三氯叔丁醇的含量测

17、定 2. 酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定 （三）经还原分解后测定法 适用于Ar-I的药物 例如：碘他拉酸的含量测定 经有机破坏的分析方法凯氏定氮法 金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏药物分析中常用的有机破坏的方法有 干法破坏湿法破坏 (一)湿法破坏H2SO4-HNO3法H2SO4-HClO4法H2SO4-硫酸盐法H2SO4-H2O2,HNO3-KMnO4法等（二）干法破坏 2.氧瓶燃烧法适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中Se及砷盐的检查1. 高温炽灼法 加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以助灰化 1） 仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬质 玻璃锥形瓶 2）称样 固体样；液体样；软膏类样品要求3） 燃烧分解操作法 4） 吸收液的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.练习与思考1相对标准偏差表示的应是A准确度 B回收率 C精密度 D纯净度 E限度2表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A相关规律 B比例常数 C相