《基因工程作业》word版

1、 基因工程的载体和工具酶【教学时数】9小时【教学目录与学时分配】2.1 载体（6） 质粒载体 噬菌体载体 其他载体 穿梭载体与表达载体 2.2 工具酶（3） 限制性内切核酸酶 DNA聚合酶和Klenow大片段 DNA连接酶 碱性磷酸酶2.2.5末端脱氧核苷酸转移酶【教学目的】让学生掌握什么是基因工程的载体，有哪些典型的基因工程载体，哪些常用的基因工程工具酶，什么情况下使用工具酶等基本常识。【教学重点】常用基因工程载体的结构、工具酶的用途。【教学难点】基因工程载体的结构和使用【教学方式】多媒体讲解结合启发讨论式教学第一节 载体一、质粒载体（3）【教学重点】质粒载体的构建与标记基因；克隆质粒载体的

2、克隆过程【教学难点】质粒的结构【教学过程与内容】载体是指运载外源DNA有效的进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。作为载体必须满足的条件：有多种限制性内切酶的切点，但每一种酶最好只有一个切点；外源DNA插入以后载体在受体细胞中自我复制；有便于选择的标记基因；具有促进外源DNA表达的调控区。 质粒载体质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。它是闭合环状双链DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主复制，但要利用寄主细胞复制染色体的同一组酶系。有某些基因，如抗药性基因，对寄主的生长是有利的

3、。质粒的复制分松弛型和严谨型两种。松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色体的复制不同步，一般在一个菌体内能复制10-200 拷贝；严谨型质粒是指质粒复制跟细菌染色体同步，一般含有1-10 拷贝。一、质粒的基本特性1质粒的复制 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。 2质粒的拷贝数 质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 几个；松

4、驰型质粒拷贝数较多，可达几百。 3质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。4转移性 质粒具转移性。它是指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。二、标记基因（一） 选择标记抗生素抗性

5、基因是目前使用最广泛的选择标记。1氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） 氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记，绝大多数在大肠杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合并抑制其活性，抑制转肽反应。氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 -内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性。2四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） 四环素可与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由

6、399 个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 pBR322 质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外，还带有四环素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可与核糖体 50S 亚基结合并抑制蛋白质合成。cat 基因编码氯霉素乙酰转移酶，一个四聚体细胞质蛋白（每个亚基 23kDa）。在乙酰辅酶 A 存在的条件下，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 卡那霉素和新霉素

7、是一种脱氧链霉胺氮基糖苷，都可与核糖体结合并抑制蛋白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。在细胞中合成的这种酶可以分泌至外周质腔，保护宿主不受这些抗生素的影响。（二）筛选标记 筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。1-互补（-complementation） -互补是基于在两个不同的缺陷 -半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖 la

8、c 操纵子中的 lacZ 基因编码 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了编码 -半乳糖苷酶中第 11-41 个氨基酸的 lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码 N-端 140 个氨基酸的 lacZ 基因 （称为 lacZ） ，其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复 -半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。 在 lacZ 编码区上游插入一小段 DNA 片段（如 51 个碱基对的多克隆位点），不影响 -半乳糖苷酶的功能内互补。但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无

9、-互补能力的 -半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统中，lacZM15 放在 F 质粒上, 随宿主传代； lacZ 放在载体上, 作为筛选标记。 2插入失活 通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。三、质粒DNA的制备与注意事项：细菌的培养：从琼脂平板上挑取单菌落接入5ml含适合抗生素

10、的LB培养基中，于37摇床中振荡培养过夜。保种：取80%灭菌甘油300ul加入1ml菌种中冷冻保存。质粒提取：（1）1.5ml过夜培养物倒入EP管，5000rpm/10min，弃上清。（2）加入150ul冰预冷的solution，vortex，使菌分散重悬。（3）加入300ul solution，来回颠倒4-6次，冰上5min。（4）加入225ul solution，来回颠倒4-6次，冰上5min。（5）6000rpm/15min（或12000rpm/5min）。 （6）吸上清移入新EP管，等体积酚/氯仿抽提一次，vortex，12000rpm/15min。（7）吸上清移入新EP管，等体积氯仿

11、抽提，vortex，12000rpm/5min。（8）重复步骤7）1-2次。（9）吸上清移入新EP管，0.7倍体积异丙醇沉淀，vortex，12000rpm/15min。（10）弃上清，1ml70%酒精洗涤1-2次，12000rpm/5min。（11）弃上清，空气中干燥。（12）加入10-20ul灭菌ddH2O溶解。（13) 加入适量RNaseA，37温育。如果要用限制酶酶切DNA，缓冲液和限制酶可与RNaseA同时加入，同时进行反应。提质粒DNA时,溶液I,II,III的作用:n 溶液I: 溶菌液,含溶菌酶,使细菌壁溶解,裂解细菌; n 溶液II: NaOH-SDS液,强碱使质粒DNA和染色

12、体DNA变性, 而SDS使蛋白质解聚沉淀. n 溶液III, 酸性高盐溶液,使质粒DNA复性,但高盐使染色体DNA变性沉淀,从而使染色体DNA和质粒DNA分离.质粒DNA的纯化n RNA酶去RNAn SDS-蛋白复合物n 蛋白酶K去蛋白质n 酚-氯仿抽提n 纯化试剂盒n 紫外分光光度计测A260与A280值：18 或20 SDS的作用n 十二烷基硫酸钠，离子型表面活性剂n 溶解细胞膜上的脂质与蛋白n 解聚核蛋白n 与蛋白质结合成复合物n 有毒，是一种刺激物，避免吸入粉末酚与氯仿的使用n 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使

13、蛋白失去水合状态而变性，离心后沉淀在下层，而DNA 水溶液在上层。n 虽然酚比氯仿变性效果好些，但酚与水相有一定程度的混溶，而氯仿与水不混溶，所以混合使用酚与氯仿比较好。n 酚要用Tris-HCl缓冲液饱和，并调PH到8，使DNA更稳定，获得RNA含量较少的DNA样品。质粒DNA沉淀n 二倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的终含量占67%左右。室温静置30分钟。n 乙醇沉淀时，加NaAc or NaCl至终浓度为01-025M，是为了中和DNA分子在碱性条件下所带的负电荷，减少DNA分子同性电荷的相斥力。n 06倍体积的异丙醇沉淀，-20C半小时。DNA分离n 琼脂糖凝胶电泳n 聚丙烯酰胺

14、凝胶电泳n 氯化铯密度梯度离心DNA浓度检测n gn EB-标准DNA浓度比较: 1 ngn 紫外分光光度计测A260: 0.1-1 ideal, 0.05-1.5 accepted n 纯度:分光光度计不但能确定核酸的浓度，还可以通过A260/A280估计核酸纯度。纯DNA其比值为1.8，纯RNA为2.0。如比值高于1.8，说明DNA样品中含RNA，而样品中的酚和蛋白质将会导致比值降低。在紫外透射仪下看DNA时，DNA亮度与哪些因素有关？n DNA浓度n DNA大小n 波长n 纯度n EB量等有关 四、质粒载体的种类（一）克隆载体 克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片段，是最简单的载体。1

15、pBR322 pBR322质粒的大小为 4361bp ， GenBank 注册号为 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多个单一位点，具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr），其质粒复制区来自 pMB1。目前使用广泛的多质粒载体几乎都是由此发展而来的。利用四环素抗性基因内部的 BamH 位点来插入外源 DNA 片段，可通过插入失活进行筛选。 pBR322 质粒克隆外源基因的过程，见幻灯片课件中的图。2pUC18 和 pUC19 pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注

16、册号为 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ （MSC）来自 M13mp18/19。 这两个质粒的结构几乎是完全一样 的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 -互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 -互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。 （二）穿梭载体穿梭载体是指具有多个复制子能在两个以上的不同宿主细胞复制和繁殖的载体。(三)表达载体 表达载体是指能将

17、目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产的载体.表达载体的三个系统:DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗性基因目的基因的转录:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等.蛋白质的翻译:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.表达载体又分为完整蛋白表达载体和融合蛋白表达载体两类。 该类载体是在常规克隆载体的基础上衍生而来的，主要增添了强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。 【思考题】1. 质粒的克隆过程如何？2. 质粒克隆片段大小是多少？3. 质粒的克隆表现形式是什么？ 第一节

18、载体二、 噬菌体载体与其他类型载体（3）【教学重点】噬菌体载体的改建；柯斯载体与人工染色体的结构组成特点【教学难点】噬菌体与其他载体的克隆过程【教学过程与内容】（一） 噬菌体l噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 l 噬菌体基因组为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp （GenBank 注册号为：J02459 或 M17233）。在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5 末端带有 12 个碱基的互补单链粘性末端，叫COS位点。 12 个碱基的序列为 5-GGGCGGCGACCT-3。当 l 噬菌体 DNA

19、 进入宿主细胞后，COS位点两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。同时COS位点也是噬菌体包装蛋白的识别位点，包装范围在35kb51kb。l噬菌体的基因组可分为3个区域：右侧的DNA复制与调控及裂解相关区域，左侧是头部蛋白和尾部蛋白基因区域，中间为非必需区，可被外源基因取代。野生型 噬菌体基因组 DNA 为 48kb ，若用外源 DNA 片段完全替换可取代区，外源 DNA 片段的大小将在 9-23kb 范围内。 噬菌体的选择标记：lacZ 基因lacZ基因也可用于 噬菌体载体

20、，通过插入或替换载体中的 -半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。噬菌体载体的类型：噬菌体载体有两种类型：插入型和置换型。插入型噬菌体是由于改建后的噬菌体较野生型短，所以可插入外源DNA。而且缺失的片段越长，插入的片段越大。置换型噬菌体基因组分三个区域：左侧区域包括外壳蛋白基因，约20kb；中间区域18kb，为不重要的替换区，可被外源基因替换；右侧区域含有复制及裂解基因，约12kb。 DNA与外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。 （二）单链M13噬菌体：M13丝状噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，其基因组为单

21、链环状DNA分子，全长6.5 kb。M13 感染宿主菌以后，单链DNA转变成双链复制形式的DNA，当复制200-300拷贝以后，又只合成单链DNA，最后包装成单链噬菌体粒子。 M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成 （GenBank 注册号为 V00604） 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。M13单链噬菌体主要用于需要单链DNA做模板时，如DNA测序。M13噬菌体基因组中主要含有与复制有关的遗传信息，只有一段由5

22、07个核苷酸组成的序列可被替换，因此M13噬菌体载体只能插入约300-400bp的外源片段。 (三) 柯斯质粒载体：1978年由Collins和 Hohn改建的一种新型的大肠杆菌克隆载体，用正常的质粒与噬菌体的cos位点构成。一般长为4-6kb。含有Ampr和Tetr抗性基因。其上的cos位点可识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度上相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA片段的长度可大于40 kb，从而大大增加了载体的携带能力。粘粒的结构特征和用途 粘粒（cosmid）实际是质粒的衍生物，是带有cos 序列的

23、质粒。粘粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。粘粒载体的工作原理 粘粒克隆的主要原理类似 l 噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于 l 噬菌体载体的左右臂，cos 位点通过粘端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。当多联体与 l 噬菌体包装蛋白混合时， l 噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割两个 cos 位点，并将两个同方向 cos 位点之间的片段包装到 l 噬菌体颗粒中去。这些噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的

24、重组 DNA 就象 l 噬菌体 DNA 一样被注入细胞并通过 cos 位点环化，这样形成的环化分子含有完整的粘粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。因而，带有重组粘粒的细菌可用含适当抗生素的培养基挑选。通过这种方式，就将外源 DNA 片段通过粘粒载体克隆到大肠杆菌中了。 与 l 噬菌体载体不同的是，外源片段克隆在粘粒载体中是以大肠杆菌菌落的形式表现出来的，而不是噬菌斑。这样所得到的菌落的总和就构成了基因文库。 （四） 其他载体-人工微小染色体：随着基因工程应用的深入，越来越需要克隆大片段的外源DNA，而且也需要逐步把外源基因转入真核生物体内，而前面提及的载体显然不能满足需要，于是构建人

25、工微小染色体的设想提了出来。构建人工染色体必须包括染色体的4个基本要素，即基因，复制起点，着丝粒和端粒结构。首先构建的是酵母人工微小染色体（YAC）。它含有酵母的标记基因leu2，酵母染色体的着丝粒序列CEN3和自主复制序列ARS1，以及四膜虫的两个端粒序列Tr末端。YAC由质粒pBR322改建而来，本身为环状；但去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状的重组DNA分子，可以象天然染色体一样地复制和分离。天然的酵母染色体长度为150-1000kb，而YAC长为7-15kb，可以携带长度为1-2Mb的外源DNA片段。但是YAC的装载能力过大也有不利的一面，例如，必须进行亚克隆以及形成“嵌合体”等。

26、因此现在在人类基因组计划中所使用的新型载体有 BAC（细菌人工染色体）, PAC（PI人工染色体）, MAC（哺乳细胞人工染色体）, Fosmid （一种类似于BAC，来源于大肠杆菌的F因子的载体）等,装载能力居中（80-200kb），又方便可靠。 1.酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes YACs） 在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。 YAC 载体主要是用来构建大片段

27、 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。当用BamH 切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。对于 BamH切割后形成的微型酵母染色体，当用 EcoR或 Sma 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的

28、。YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。 2. 细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs） 是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS，一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（ parA , parB, 和 parC ） 。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体

29、的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 第一代 BAC 载体，不含那些能够用于区分携带重组子的抗生素抗性细菌菌落与携带空载体的细菌菌落的标记物。新型的 BAC 载体可以通过互补的原理筛选含有插入片段的重组子，并设计了用于回收克隆 DNA 的 Not 酶切位点和用于克隆 DNA 测序的 Sp6 启动子、 T7 启动子 （Kim et al. 1996; Asakawa et al. 1997） 。 Not 识别序列，位点十分稀少。重组子通过 Not 消化后，可以得到完整的插入片段。 Sp6 、 T7 是来源于噬菌体的启动子，用于插入片段末端测序。 BAC 与 YAC 和 PAC（P

30、1 artificial chromosomes ， P1 人工染色体 ） 相似，没有包装限制，因此可接受的基因组 DNA 大小也没有固定的限制。大多数 BAC 文库中克隆的平均大小约 120kb ，然而个别的 BAC 重组子中含有的基因组 DNA 最大可达 300kb 。 【思考题】1. 噬菌体的克隆体现形式是什么？2. 粘粒载体的优势是什么？3. 人工染色体构建原则是什么？ 第二节 工具酶（3） 【教学时数】3小时【教学目录】1 限制性内切核酸酶2 DNA聚合酶和Klenow大片段3 DNA连接酶4 碱性磷酸酶5末端脱氧核苷酸转移酶【教学目的】让学生掌握基因工程常用的工具酶有哪些，这些工具

31、酶有什么用途，在什么情况下使用，以及使用有哪些注意事项等基本常识。【教学重点】限制性核酸内切酶、DNA聚合酶的性质与使用。【教学难点】限制性核酸内切酶的类型与使用注意事项。【教学方式】多媒体讲解结合启发讨论式教学 【教学过程与内容】第二节 工具酶在基因工程的操作中，通常要对目的基因或外源DNA片段以及载体DNA进行剪切，修饰加工与连接等操作，这些处理是通过工具酶来完成的。1. 限制性内切核酸酶(1) 限制性核酸内切酶的概念：限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶。是在DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键的核酸内切酶。能够识别特异的DNA碱

32、基序列， DNA碱基序列往往呈回文对称结构；并具有特异切割位点。在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。 1970 年，美国约翰霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 Hind 限制性内切酶。 Hin

33、d 限制性内切酶位点和切割位点如下： 5 GTPy PuAC 3 3 CAPu PyTG 5 从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。 EcoR 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下： 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5（2）核酸内切酶的命名：限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。物种属名第一个字母（大写字母）+菌种名前两个字母（小写）+菌株第一个字母+罗马大写数字。EcoR I 代表 Escherichia coli（大肠

34、杆菌）R菌株发现的第一种限制性核酸酶。如 Hind 限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ， 表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。 1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括 型、 型、 型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的

35、限制酶有 588 种，在 型限制酶中共有 221 种特异性。（3）限制性核酸内切酶的分类：根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为三类。 I类：识别特异顺序，序列外随机切割。基因工程中不用。II类：识别特异顺序，序列内特异切割，回文结构。基因工程中常用。III类：识别特异顺序，序列外特异切割，非回文结构。基因工程中特殊时候使用。 型（type ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相

36、应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.BstNBI 。在基因操作中，一般所说的限制酶

37、或修饰酶，除非特指，均指 型系统中的种类。II类限制性核酸酶特点：1. 内切酶活性与甲基化酶活性分开；2. 需要Mg2+激活，但无需ATP辅助因子；3. 特异识别，识别序列一般4-6bp长，偶尔7bp；4. 识别顺序往往有回文结构；5. 特异切割：切口有平切和错切两种类型。（4）限制酶产生的末端A限制酶产生匹配粘端（matched ends） 识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5 突出粘性末端，如EcoR ；若在 3-侧切割，

38、则产生 3 突出粘性末端，如Kpn 。 NNGAATTCNN EcoR NNG AATTCNN NNCTTAAGNN NNCTTAA GNNB限制酶产生平头末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 Hae（GGCC）和 EcoRV（GATATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。C同裂酶（isoschizomer） 同裂酶（同切点酶）：来源不同，识别顺序相同或相近，切割序列相同，产生相同或不同的粘性末端。或者说：不同来源的限制酶可以切割相同的序列。 n Sau3A I : 5-GATC-3n 3-CTAG-5n BamH

39、I: 5-GGATCC-3n 3-CCTAGG-5D同尾酶 同尾酶：来源各异，识别靶序列各不相同，但产生相同的粘性末端。 n Bgl II : 5-AGATCT-3n 3-TCTAGA-5n BamH I: 5-GGATCC-3n 3-CCTAGG-5（5）影响限制性核酸内切酶切反应的因素n DNA的纯度(蛋白质、酚、氯仿、EDTA、SDS、高浓度的盐离子等)n DNA的甲基化程度n 酶切消化反应的温度n DNA的分子结构n 限制性核酸内切酶的缓冲液ADNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等处理办法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶；加大反应总体积

40、；延长反应时间。B. DNA甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等。C 反应温度 反应温度大多数为 37 ，一部分为 50-65 ，少数 25-30 。高温作用酶在 37 下的活性会下降，多数仅为最适条件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反应温度为 65），在 37 只有在

41、65 活性的 10% ；Apo（正常反应温度为 50）， 37 只有在 50 时活性的 50% 。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。D 酶切反应的缓冲液：常规缓冲液一般包括提供稳定 pH 值的缓冲剂、 Mg+ 、 DTT（二硫苏糖醇）以及 BSA（小牛血请白蛋白）。 pH 经常为 7.0-7.9（在 25 时），用 Tris-HCl 或乙酸调节； Mg+ 作为酶的活性中心，由 MgCl2和 MgAc 提供； 浓度常为 10mM ；DTT 浓度常为 1mM 。有时缓冲液中还要加入 100mg/ml BSA ，但只是少数反应需要。不同的酶对离子强度的要求差异很大，并依次将限制酶缓冲液按离子强

42、度的差异分为高、中、低三种类型，离子强度以 NaCl 来满足，浓度分别为 100mM 、50mM 和 0mM 。 要对 DNA 进行双酶切时，如何选择缓冲液是相当重要的。一方面可选用都合适的缓冲液或通用缓冲液；若找不到共用的缓冲液则先用低浓度的，再加适量 NaCl 和第二种酶；或先用低盐缓冲液再用高盐缓冲液（DNA 可纯化或不纯化）。 2. DNA连接酶DNA连接酶负责双链DNA中相邻3-OH与5-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。只能连接切口（nick or nike），不能连接缺口（gap）。最常用T4连接酶。最适连接温度37。C，实际操作4-16。C。DNA连接酶既可以进行粘接（连接粘性末

43、端），也可以进行端接（连接平头末端），但粘接的效果比端接的效果要好许多倍。从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多.提高平头末端连接效率的方法包括：（1）加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） （2）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 （3）加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 （4）加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mMDNA连接酶的反应条件：Tris-HCl 50 100 mM pH 7.5MgCl2 10 mMATP 0.5 1 mMDTT 5

44、 mMVolume 10 20 mlT T 4 15 4 16 hr1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase）： T4 DNA 连接酶的分子量为 68kDa ，催化 DNA 5 磷酸基与 3 羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的 RNA （但效率低）或 DNA 。低浓度的聚乙二醇 PEG （一般为 10%）和单价阳离子（150-200mM NaCl）可以提高平端连接速率。 连接反应条件需要 ATP ，若在 16 反应，大约需 4 小时；若

45、在 4 反应，则需反应过夜。3. DNA聚合酶和Klenow大片段真核细胞有 4 种 DNA 聚合酶, DNA 聚合酶 a 位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用； DNA 聚合酶 b 是小分子蛋白质（4.4kDa），曾从小牛胸腺中提出，与细胞增生无关； DNA 聚合酶 g 为 100kDa ，利用 RNA 为模板的效率比利用 DNA 为模板的效率高；其它的还有线粒体 DNA 聚合酶，可以催化线粒体 DNA 的合成。 原核细胞有三种 DNA 聚合酶，都与 DNA 链的延长有关。聚合酶 是单链多肽，可催化单链或双链 DNA 的延长；聚合酶 则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；聚合酶 在细

46、胞中存在的数目不多，是促进 DNA 链延长的主要酶。（1）E.coli DNA 聚合酶 的活性 E.coli DNA 聚合酶 为单链多肽（109kDa），有三种活性。 5-3 DNA 聚合酶活性。反应底物为单链 DNA 及引物（带 3-OH 基）或 5 突出的双链 DNA 。 5-3 外切核酸酶活性。反应底物是双链 DNA 或 DNA:RNA 杂交体，它可从 5 端降解双链 DNA ，也降解 RNA:DNA 中的 RNA（RNase H 活性）。 3-5 外切酶活性。反应底物是带 3-OH 的双链 DNA 或单链 DNA ，其活性从 3-OH 端降解 DNA ，可被 5-3 聚合活性封闭，也可

47、被带 5 磷酸的 dNMP 所抑制。 交换（置换）反应。如果只有一种 dNTP 存在， 3-5 外切活性将从 3-OH 端降解 DNA ，然后在该位置发生一系列连续的合成和外切反应，直到露出与该 dNTP 互补的碱基。 总之，在没有 dNTP 的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的 dNTP 时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得双链 DNA 成为平末端。2E.coli DNA 聚合酶 的用途 利用E.coli DNA 聚合酶 的 5-3 外切核酸酶活性，可用切口平移法（nick translation ）标记 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应。 用于 cDNA

48、 克隆中的第二链，即单纯的 DNA 聚合活性。但由于具有 5-3 外切活性，现在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反转录酶。 对 3 突出端的 DNA 作末端标记（交换或置换反应），但是此反应用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果会更好 （2）Klenow片断Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影响。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment），或 E.coli DNA 聚合酶 大片段（E.coli DNA polyme

49、rase large fragment）。它也可以通过基因工程得到，分子量为 76kDa 。 Klenow DNA 聚合酶的活性与E.coli DNA 聚合酶 的活性是一致的。由于没有 5-3 外切活性，使用范围进一步扩大。 补平 3 凹端 DNA 。使用单纯的 DNA 合成活性。注意要加足够的 dNTP ；如果使用带标记的 dNTP ，则可对 DNA 进行末端标记。 抹平 DNA 3 凸端。在 3-5 外切活性作用下，可切除突出的 3 凸端。注意必须加足量 dNTP ，否则外切活性不会停止。但由于 T4 和 T7 DNA 聚合酶具更强的 3-5 外切活性，现在已经取代了 Klenow DNA

50、 聚合酶的这一作用。 通过置换反应对 DNA 进行末端标记。但是该作用也已经被 T4 或 T7 DNA 聚合酶代替；它还可以在补平 3 凹端的过程中进行标记。 在 cDNA 克隆中合成第二链。 随机引物标记。 应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序（已经被 T7 DNA 聚合酶取代）。 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链 DNA 。 （3）逆转录酶反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链以及双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。 以mRNA为模板合成scDNA。 需要模板，引物，底物 用于cDNA 文库构建等4. 单链核酸酶S1 降解单链DNA或单链RNA, 但对双链不起作用。 用于降解双链cDNA发夹结构 单链酶法获取目的基因 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍。降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。5. 碱性磷酸酯酶分子克隆中使用的磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称 CIP 或 CIAP ，也有来自细菌的碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase, BAP）。它们均能催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸的反应。通过去除 5 磷酸基团，可用于防止 DNA 片段自身连接，或标记（5 端）前