低氧下再激活CD8+ T细胞表型开关作用于分泌IL-10,低增殖的效应细胞 翻译

1、低氧下再激活CD8+T细胞表型开关作用于分泌IL-10，低增殖的效应细胞RomainVuillefroydeSilly,LauraDucimetiere,CelineYacoubMaroun,Pierre-YvesDietrich,MadihaDerouazi和PaulR.Walker瑞士，日内瓦，日内瓦大学医院和日内瓦大学摘要CD8+T细胞必须处在氧气张力经常低,且不能高于在大气层以下的培养条件下才得以控制病原体或肿瘤的功能。然而,体内的T细胞功能一般为间接分析,或是从处于非生理性氧气张力下的研究对象中推断得出。在这项研究中,我们总结了在体外肿瘤特异性CD8+T细胞的活化和分化中生理和病理性

2、氧张力的作用。利用Pmel-1小鼠CD8+T细胞，我们观察到相当于在淋巴结的生理氧分数即5%02下活化的细胞毒T细胞（CTLs）的产生，导致比那些在大气氧气分数（21%O2）下产生的CTLs更高的效应信号。低氧（1%O2）没有改变细胞毒性，但在CTL和CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的激活剂之间降低氧气张力呈现剂量依赖型减少增殖，诱导免疫抑制因子IL-10的分泌，并且上调CD137（4-1BB）、CD25的表达。总体而言,我们的数据表明氧气张力是CD8+T细胞功能和分化一个关键调节器，显示IL-10释放可能是在大多数体内微环境CD8+T细胞介导的免疫反应一个意外的组份。关键词：CD8+TcellOxy

3、genHypoxiaIL-10T-cellreactivation引言在一个健康的生理环境内，在哺乳动物组织中氧张力有严格的规定，但仍有在组织之间和同一组织内显示出的显著的变化（支持信息图1A）1，3.然而，氧张力在不同病理条件下远低于生理值，大多数涉及炎症4，实体肿瘤5,6，和感染7。相反，充足的氧气供应（即常氧），氧气缺乏（即缺氧）导致的细胞反应涉及HIF（缺氧诱导因子）的稳定，转录因子是由诱导a亚单位（即HIF-1a、HIF-2a或HIF-3a）连同基本B亚单位（即HIF-邛、HIF-2B或HIF-3p）8一起构成。根据HIFs的稳定，HIFs与他们的启动子里HIF效应元件转录各种基因。

4、这些包括增加血管生成（如VEGF）和葡萄糖代谢（如葡萄糖转运蛋白）9。有趣的是，HIF-1a和HIF-2a可以有独特的，多余的，或相对的作用9，10。此外，HIF-1a低于2%O2时被描述为一种稳定和积极的急性方式，而HIF-2a低于5%O2时已证明是一个长期稳定的方式11，12。然而，虽然HIFs对许多缺氧反应很重要，确切的效应被证明是依赖HIF的13-15。有趣的是,HIF-1a在大气中的氧气分数（即21%O2）下也可以参与免疫细胞活化，比如巨噬细胞和T细胞（16、17）。缺氧是一种体内微环境的基本现象，而在体外研究和概括具有挑战性。在探索缺氧时，也必须和常氧状态比较。然而，大多数已发表的

5、出版物把AtO2当做了常氧1。这可能会导致误解，因为，例如，与在体外的02相比较发现次级淋巴器官中生理氧分数（physioxia）接近5%02并且可诱导特异性T淋巴细胞活化18-20。这个强调了不仅能使用生理氧分数作为参考点来研究在体外的缺氧影响，还可以通常分析细胞生理学的必要性。在各种组织中生理氧分数差别很大：如皮肤1.1%，脑4.4%，肺泡14.5%（支持信息图1A）3。作为生理氧分数在健康组织中的基线5%02以前用于评估淋巴细胞功能19;我们也为我们的研究选择这个保守值。在恶性肿瘤或感染的背景下缺氧和低氧诱导因子（HIF）的影响已被广泛研究，且常与发病机理呈正相关。癌症中，缺氧促进肿瘤细

6、胞干性，迁移，侵袭，转移，并且对放疗、化疗和对细胞毒性淋巴细胞（CTL）介导的杀伤产生抵抗10,21-25。在病毒感染中，缺氧增加病毒复制和基因表达26。至I目前为止，与抗肿瘤和抗病毒密切相关的的在T细胞上缺氧的影响没有被广泛的描述。大多数研究集中在CD4+T细胞，没有影响的共识。早期的研究表明，缺氧和活力或增殖存在正相关27，28，更多最近的研究则表明相反29，30。缺氧也能增加辅助性T细胞17（Thelpercell17,Th17）和调节性T细胞（Regulatorycell，简称Treg）极化31,32。关于细胞因子的产生，有分泌IL-2,IFN-y,IL-10和IL-邛的相互矛盾的结果

7、29，30，33-37。总体而言，尽管在这一新兴研究领域存在某些矛盾，然而基于CD4+T细胞相关的知识正变的更具综合性。而缺氧和氧气张力对CD8+T细胞的影响仅局限于一些有趣的研究17,18,38-42。无论如何，有关于已致敏CD8+T细胞（以下为CTLs）激活的许多问题，仍需要进一步调查。对于CTL缺氧反应的理解是非常重要的，因为，相对于一些Th亚群，这些细胞必须在身体最缺氧的部位行使职责（例如瘤床，感染部位）。在这项研究中，我们探讨了在5%02（许多健康组织的生理氧分数）或1%02（炎症或肿瘤部位发现的缺氧）低氧对CD8+效应T细胞激活的影响（支持信息图1B）。再激活CTLs的基因表达分析

8、强调使用生理氧分数替代AtO2作为参考的重要性，许多基因表达在缺氧条件下被调节已经在生理氧分数下被规定。我们在缺氧下免疫功能的调查透露,然而缺氧并不改变CTL杀伤能力，它在再激活基础上强有力地诱导IL-10分泌，并能显著降低CTL的扩增。结果生理氧分数下CD8+T细胞致敏增强效应信号我们使用从Pmel-1小鼠体内的CD8+T细胞携带转基因TCR针对肿瘤免疫显性表位/自身抗原gp100，让我们获得一个无性系种群的初始CD8+T细胞43。模型一个生理效应CD8+T细胞反应，我们首先要生成生理氧分数（5%O2）下的CTLs，如同在淋巴结（LNs）中发现的一样撚后把它们和在O2（即21%O2）下产生的

9、CTLs相比较。我们进行这项对比因为21%O2通常用于体外细胞培养为常氧对照研究缺氧的影响。我们分析了一组42个基因表达描述规定在缺氧条件下、免疫功能相关，或是参与细胞活性（支持信息表1）。相对于21%02，生理氧分数（5%02）被用来通过低氧增加产生CTL来上调不同基因描述的RNA表达。其中包括hifla基因外显子1.1（虽然弱表达，作为判断NanoString绝对RNA计数（数据未显示），hif2a,vegfa,glut1,entpdl（CD39）,galectin3,gelsolin,andtnfrsf9（CD137）。然而，hif1a,adora2a（A2AR）,和口hif1b没有被调

10、节,hif3a不表达，同时nt5e（CD73）下调11,44-50（图1A）。和CD8+T细胞活性和扩散呈正相关的几个基因表达上调，包括gata3,il2ra,andcd2851-53。然而，和增加细胞凋亡和免疫调节相关的maf和ctla454,55也被上调。值得注意的是，在生理氧分数下CTLs的产生显示较高的效应曲线，由blimp1和fasl表达上调和tcf7下调证明（图1B）。与这些观察结果一致，常氧下CTLs产生显示CD44+CD62L组分增加（图1c）和CD127（IL-7Ra）表达减少（支持信息图。1C,2A）。这并不是由于CD8+T细胞克隆使用,如来自C57BL/6小鼠的OT-IC

11、TLs和多克隆CTLs给出了相同的结果（支持信息图2B-D）。因此，在生理氧分数下CTLs产生与在AtO2下CTLs产生相比增加了杀伤能力（支持信息图2E）。我们接下来调查低氧（1%O2）是否可能会影响细胞毒性T淋巴细胞溶解能力。与在CTL产生期间使用氧气分数无关,缺氧对于细胞毒性测定期间没有影响（支持信息图2E）该法意味着短期低氧暴露（4小时），在进行测定杀伤前三天我们也预处理了CTLs。有趣的是，在AtO2下CTLs产生并且缺氧状态下预处理显示增加了细胞毒作用（图1D）。然而，在生理氧分数下CTLs产生并且在低氧下进行预处理并不增加它们的杀伤能力。颗粒酶B（GRB）通过在生理氧分数下产生的

12、CTLs与那些在AtO2下产生的CTLs相比优先表达（支持信息图2F-G）,与我们观察到的效应器对存储器分化的增加一致。然而当在缺氧下CTLs不管是否被预处理我们并没有观察到任何差异。因此r通过生成GrB的一个独立机制在AtO2下低氧会改善CTL杀伤能力。低氧减少再激活CTLs的扩增我们接着研究了氧张力对已致敏CD8+T细胞扩增的影响。对于CD8+T细胞抗肿瘤或抗病毒反应时缺氧的影响是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）再激活期间最重要的检查，如当在一个潜在缺氧微环境里，已致敏细胞迁移到非淋巴组织发挥其效应功能的发生。为了模拟这种情况，在生理氧分数下CTLs产生在生理氧分数（5%O2）或者低氧（1%O

13、2）下被再激活。我们也拿这些结果同在AtO2下CTLs产生和再激活比较（支持信息图1B）。正如预期的，一天补充刺激HIF-1a的稳定化是由氧气分数负调控（支持信息图3）。然而，两天补充刺激在低氧气分数下它的水平下降了，而在AtO2下它是高度稳定的;从而证实了以前的结果显示HIFs涉及TCR信号。如发现CD8+T细胞的启动（数据未显示），缺氧显著减少再激活后CTL的扩增（图2A）。这是与减少细胞分裂和活性（图2B,C）相关联的，具有一种向着更多凋亡的趋势（图2D）。类似的扩增通过使用OT-ICD8+T细胞，也可通过来自C57BL/6小鼠的多克隆CTLs获得（支持信息图4AD）。与生理氧分数或大气

14、氧比较时，低氧不同调节基因的表达我们接下来确定缺氧通过激活CTLs对基因表达的影响。相比AtO2（图2E）,缺氧高度影响众多基因（25/42）。然而，相比于生理氧分数，缺氧在较小程度上影响它们（5/42）中的五分之一（图2F）。CTLs缺氧条件下活化两天显示增加il10和tnfrsf9（CD137）的表达，以及在较小程度上增加bcl2，hif2a，和il2ra（CD25）的表达。分析所有的基因中，il10是在缺氧条件下最多被调控的，独立于氧气分数作为AtO2下的参考。il10，ifng，tnfrsf9（CD137），il2ra（CD25），和hif2a的RNA表达动力学（支持信息图5A-E）指

15、示通过两天的后再激活RNA水平的强烈上调，然后下降，尽管hif2aRNA表达更稳定。对于所有这些基因，在氧气分数和RNA表达之间存在着负相关。关于bcl2RNA（支持信息图5F），从两天的后再激活其表达下降，但它是在缺氧条件下更稳定。为了知道这些调控是否是由于缺氧本身或一个缺氧和TCR刺激的组合引起，我们分析了在无刺激条件下，被CTLs培养2天的同一组基因的表达（支持信息图6A-D）。il10,hif2a,或il2ra没有上调，表明这些分子的缺氧驱动上调是依赖TCR刺激的。有趣的是，当我们分别取在1%和5%02条件下作比较时，被CTLs培养的tnfrsf9是上调的。通过CTLs的IL-10分泌

16、与氧分数成反比我们证实了关于在蛋白质水平的关键基因的结果。通过流式细胞术我们观察到，在缺氧条件下，在再激活CTLs（取自PmeI-1，OT-I和C57BL/6小鼠）上的CD137（4-1BB）和CD25（IL-2Ra）的增加，此与生理氧分数或AtO2相比（图3A，B，支持信息图7A-D）。虽然与AtO2比较时，缺氧条件下Bcl-2被上调，但当与生理氧分数比较缺氧对于Bcl-2的水平没有影响（支持信息图5G）。为了进一步探讨通过CD8+T细胞在低氧张力下IL-10未知的生成，我们通过再激活CTLs细胞分析了IL-10的生成。降低氧张力增加产IL-10CTLs的组分（图3C，D）中，IL-10阳性

17、部分也表达IFN-y。然而，尽管与AtO2相比，低氧增加IFN-y阳性部分，但与生理氧相比较，它却并没有显著的增加此部分（图3D）。分泌IL-10的分析指示在AtO2下弱分泌，生理氧下适度诱发，和在低氧下强力诱发（图3E）。使用来自OT-I和C57BL/6小鼠的CD8+T细胞得到相同的结果（支持信息图7E和G）。因此，这些数据表明，在生理氧下IL-10是CTL再激活后典型的细胞因子，并且在低氧下它的分泌进一步增加。然而,IL-10不是初始CD8+T细胞的初次激活之后的细胞因子，即使是在生理氧或低氧下的致敏CD8+T细胞（数据未显示）。接下来，我们测试了在低氧下IL-10分泌是否为减少细胞扩增的

18、原因；CTL再激活期间使用IL-10阻断抗体在低氧下不恢复扩增（图3F）。因此，缺氧影响CTLs的细胞因子分泌概要，但是至少对IL-10，无自分泌后果。我们没有观察到任何IFN-y,IL-2,或TNF-a表达的低氧相关增加（图3G-1,支持信息图7F和H）。值得注意的是，在CTL再激发后没检测到IL-4,IL-6,和IL-17（数据未显示）。正如体外低氧条件下，再激活CTLs中的IL-10,CD25和CD137被强烈的上调，我们在体内和离体使用的E.G7-OVA肿瘤模型证实了这些结果。为了表明在体内CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的确表达CD25,CD137，和IL-10,我们纯化了CD8+

19、TIL并且拿它们与取自脾脏的CD8+T细胞比较。然而在脾脏，CD25和CD137并没有表达，13%的CD8+TILS是CD25+而30%是CD137+（图4A）,大部分CD25+细胞共表达CD137。因为没有体外细胞的处理，IL-10蛋白质不能轻易的观察到，我们就研究il10RNA。同CD8+脾细胞相比较，CD8+TILS的表达更高一些（图4B）;此外，hif2a也过表达。如显示CD8+纯度与il10mRNA的相关性散点图所示（支持信息图8C），il10mRNA表达不是来自污染的非T细胞，比如肿瘤细胞或巨噬细胞。为了证明氧分数是一个CD8+TIL，CD25,CD137,和IL-10扩增主要的调

20、控因素，我们在体外在不同的氧分数下利用抗CD3/抗CD28包被的磁珠再激活了CD8+TILS（即21，图5，和1%）。正如我们先前描述使用体外生成的CTLs,扩增，活性与氧气水平呈正相关（图4C）。最后，证实我们的体外数据，我们观察到，CD25,CD137（图4D）,以及最重要的IL-10，与氧水平呈负相关（图4E）。重要的是，在缺氧条件下，这些分子的上调需要TCR连接酶加缺氧（图4D,E）的组合。此外，缺氧条件下IFN-Y勺分泌稍微降低（图4F）。讨论理解缺氧对CD8+T细胞应答的影响，代表一个重要的步骤去预测在体内的免疫功能，特别是在癌症和感染。的确，当开发基于T细胞的免疫治疗（例如疫苗，

21、过继细胞迁移）时，效应细胞将必须在缺氧环境中工作。在判断缺氧的影响的核心问题是选择合适的生理氧的参考点。在T细胞上之前的工作18令人信服地证明了相比于在AtO2，生理氧分数为2%的0256，或5%0219显著影响初始T细胞活化。因此，当大多数的研究选择比较低氧与AtO2（也可被视为高氧）下的回应时，在低氧和低氧气分数对于T细胞的影响几乎没有共识就不足为奇了27,29,33-35。我们的研究理念的目的是通过AtO2和生理氧（5%O2）的比较，让缺氧的影响更全面的提升。我们观察到生理氧下CTLs产生有一个主要的效应，而不是记忆表型，并且增加了GrB含量。此外，当Tcf7，一个和记忆CD8+T细胞5

22、8的持久性和分化相关的转录因子被下调时，Blimp1，-个和效应器分化57相关的转录因子则被上调。正如效应与记忆性分析一样，在生理氧下产生的CTLs比在21%O2产生的那些有更多的溶解，这表明在AtO2下CTL产生（如过继治疗）可能是次优的。这与先前关于在生理氧气张数下增加颗粒酶A的表达和T细胞再激活的细胞毒性的报道是一致的18,59。这也可能和在生理氧下增加HIF的活性有关，而HIFs被描述为增加CTL的效应功能17,41。我们的结果表明，生理氧（如次级淋巴器官中）促进有效的CD8+T细胞扩增和分化，并且，在体外AtO2下分析很难模仿在体内条件下的这些。特别令人感兴趣的是，八个重要基因被描述

23、为受低氧调节的，包括广为报道的Vegfa和Glut1基因，即便在我们选择生理氧（即5%）作为生理氧值下上述基因也是被调节的，同AtO2作对比。氧气张力的影响是有关理解在生理氧下T细胞活化18,19，即使初始T细胞很少进入缺氧区域如瘤床60,61。初始和效应T细胞将有望会有不同的活化刺激的敏感性，因为它们是不同的表型，并具有独特的代谢模式（例如葡萄糖和半胱氨酸的要求）17，62。对于效应CD8+T细胞，他们的再激活会时常发生在含氧不足，和经常低氧的组织，一个比活化期间更低的氧气分数。然而，在这种体内相关条件下，他们的生存，扩增和功能的关键问题很少被解决17,41。与之前的研究结果相一致38，40

24、,在短期测定里我们观察到缺氧不修改CTL杀死能力，不管用于CTL产生的氧张力。然而，我们注意到，在AtO2下产生的CTLs经过三天的缺氧预处理增加了他们的溶解能力.重要的是，我们发现，再激活后的CTL扩增在低氧条件下强烈的减少，同时减少的还有活性和增殖。我们假设潜在的缺陷可能与干扰IL-2R信号有关，最近关于CD4+T细胞研究显示30,对CD8+TILS添加外源性IL-2并没有恢复在缺氧下的增殖（支持信息图8D），尽管CD25表达升高。另一种解释可能是低氧诱导的通过腺苷A2AR信号的免疫调节46,63。然而，我们的研究结果（激活CD8+T细胞）更符合最近的出版物，它指出低氧诱导的独立A2AR减

25、少细胞扩增42，因为我们发现无论是CD25，还是FasI都不下调显示腺苷诱导的免疫抑制63,64。然而，在体内微环境，其中腺苷水平已被证明是高的，低氧诱导的依赖型腺苷和T细胞扩增的独立抑制可能同时存在。正如预期的那样，当低氧与AtO2对比时，CTL再激活期间的缺氧导致众多的基因强烈的调控（42个测试基因中，21个基因上调，4个基因下调）。然而，相比于生理氧，低氧更有效，42个基因仅有5个调控表达。然而，从空气到低氧条件，所有这些基因是和那些被认定为是被调控跟随开关细胞重叠在一起的。其中，上调基因中我们证实了在蛋白质水平过度表达的两种基因，nfsrf9（CD137）和il2ra（CD25），曾被

26、报道是低氧调控的18，30，44。特别令人感兴趣的是，从整组基因分析，通过在缺氧条件下的CTLs，il10是最高度调控的基因。我们建议确认低氧影响与生理氧有关而不是AtO2，这是最好的通往去确认正确的低氧调控基因表达的方法，这是为了它们在体内的重要性而应该优先去进一步在低氧组织中探讨。关于细胞因子的分泌，CTLs在低氧下分泌较少的IFN-y，TNF-a和IL-2;这可能是缺氧条件下降低CTL扩增的结果。然而，尽管这样（但与RNA表达一致）在低氧和生理氧下再激发后CTLs和CD8+TIL分泌增加了IL-10免疫调节细胞因子的量，低氧是最有效的诱导剂。这只是观察效应CD8+T细胞，初始CD8+T细

27、胞在缺氧条件下的激活没有导致的IL-10的分泌（数据未显示）。因为我们观察到在AtO2下通过CTLs再激活的IL-10微量的分泌，我们的结果提示CTLs的这种能力通过体外常规的方法被低估了，但这可能会在体内很多组织内存在，如我们观察的表达il10的CD8+TILs。有限的报道里涉及到由CD8+T细胞产生IL-10，那也是我们意识到的，大多数是以感染为背景：冠状病毒诱发的急性脑炎，慢性结核杆菌感染和呼吸系统病毒性感染65-68。CTL生产的的IL-10已被建议作为反馈机制，以抑制免疫病理引起的过度的细胞溶解和炎症活动69。我们的研究结果支持这样的功能，因为缺氧是感染组织的一个特征7。然而，虽然I

28、L-10主要以其免疫抑制活性而被人所知，但有研究显示其有免疫刺激作用70。我们没有观察到在低氧下IL-10对于CTL扩增的任何刺激或者抑制的影响，但是在一个复杂的体内微环境里，它可以旁分泌方式作用于其他的免疫细胞，或肿瘤细胞。在恶性肿瘤中,IL-10的作用仍是一个争议的话题，不止被报道有促进肿瘤免疫监督的作用71，还和不良预后，增加肿瘤复发和转移有关72未来的研究以确定由肿瘤特异性CTLs产生的IL-10是否可以影响他们的治疗效果，这将是至关重要的。我们的研究揭示了在组织氧合的体外模型中，低氧张力对于效应CD8+T细胞的功能和结局的特殊影响。具有对配体相同的敏感性，使用单克隆CD8+T细胞排除

29、在多克隆T细胞里特定克隆的选择的潜在性缺陷，因为在已给的氧气张力下增加了适应度和亲和力。然而,我们的主要发现是类似于多克隆C57BL/6来源CD8+CTLS和CD8+TILS。我们的数据挑战使用了AtO2作为常氧，为了确定在体外低氧的的影响。总的来说,我们表明,即使缺氧不干扰CTLs的溶解能力，但它可以通过对CD8+T细胞结局的负面影响来减少体内抗肿瘤或抗病毒反应，并且诱导IL-10的分泌，以旁分泌的方式作用于其他免疫细胞类型或组织。如果在体内缺氧的组织中，通过CTLs释放的IL-10来抑制炎症反应，为了抑制在感染中的免疫病理，这可能是一种有价值的反馈机制，但是这也可能使肿瘤免疫监视作用或免疫

30、疗法变得迟钝。材料与方法小鼠Pem1-1小鼠（Jackson实验室）携带特异针对与鼠gp100（mgplOO）交叉反应的人SILV（hgplOO）转基因TCR。OT-I小鼠（CharlesRiver）携带特定针对卵白蛋白的转基因TCR。E.G7-OVA肿瘤通过皮下注射3.105个细胞被诱导。动物的使用是根据瑞士联邦动物保护法律（许可编号：1064/3717/2，GE/68/14，GE/80/14，GE/13/15）。细胞系EL-4和E.G7-OVA胸腺细胞系（ATCC）培养在含有4.5g/L的葡萄糖，丙酮酸钠和胎牛血清的细胞培养基中，补充了10的胎牛血清，青霉素和链霉素。白细胞离析为CTL产生

31、从Pmel-1,OT-1,或者C57BL/6小鼠的脾和淋巴结提取白细胞。Pmel-1和OT-1CD8+T细胞的分别被10nMhgp100或10nM的OVA7问激活。为了来自C57BL/6的多克隆CTL产生，CD8+T细胞被被否定选用分选CD8+T细胞分离试剂盒（94%纯度），并且在一个涂有10g/mLCD3和CD28的板里被激活。细胞在21%或5%氧气条件下，在含有4.5g/L葡萄糖，丙酮酸钠和Glutamax，补充有6%胎牛血清，HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）缓冲液，精氨酸，天冬酰胺，青霉素，链霉素，和20pMB巯基乙醇的细胞培养基里被培养。细胞使用50IU/mL重组人IL-2每两天分裂一

32、次。生成的CTLs用于6-8天的后激活。CD8+TILs的离析E.G7-OVA肿瘤达到0.5厘米时收获和处理，以提取TILs。简言之，肿瘤被胶原酶D消化，白细胞通过淋巴细胞分离液分离，然后CD8纯化使用细胞分选CD8a（Ly-2）试剂盒（支持信息图8A，B）。CTL再激活CTLs被标记上10pMCFSE（英杰公司）用来跟踪细胞增殖。105CTLS或5.104CD8+TILS在21,5,或者1%02的条件下通过抗CD3加抗CD28包被的磁珠（免疫磁珠，英杰公司）以1:1（细胞对磁珠）的比例来被再激活。在100IU/mLIL-2的存在下，TIL的再激活被表现出来。一到四天的后再激活，收集上清评估细

33、胞因子。为了IL-10阻断，10g/mL抗IL-10抗体（克隆JES5-2A5;抗体）或相应的同种型加入到培养中。染色用于流式细胞术对所有的实验，活细胞用“live/deadyellow”标签（英杰公司）来被标记（支持信息图1C）。对表面标记表达，细胞使用CD8a-FITC,-PECy7,-APC,或-APCCy7（克隆53-6.7;Biolegend公司），CD127-PECy7（克隆A7R34;eBioscienee公司），CD44-AF647（克隆IM7;BDPharmingen公司），CD62L-PE（克隆Mel-14;Biolegend公司），CD137-APC（克隆17B5;eBi

34、oseienee公司），CD25-PECy7（克隆PC61;Biolegend公司）,GrB-PECy5.5（克隆GB11;Invitrogen公司），或者Bel-2-AF647（克隆BCL/10C4;Biolegend公司）抗体来染色，或适当的同种型对照。对细胞内细胞因子染色，CTLs在2-3天通过抗CD3加抗CD28包被的磁珠被活化，并且通过高尔基体插头（BDBioseiences公司）孵育过夜。得到的细胞用CD8a染色，随后细胞内IFN-y-PECy7（克隆XMG1.2;Biolegend公司）andIL10-APC（克隆JES5-16E3;Biolegend公司）染色（Fix/Perm

35、试剂盒；BDBioseiences公司），或者适当的同种型对照。为细胞凋亡测定，细胞用膜联蛋白V-APC（免疫工具）和碘化丙啶（PI;BDBioseiences公司）染色。碘化丙啶-膜联蛋白V+细胞被认为是凋亡的。平均荧光强度（MedFI）用Gallios流式细胞仪（BeekmanCoulter公司）来测定，标记物表达用MedFI标记物/MedFI控制同种型来计算。绝对细胞数通过标准化细胞/磁珠比例来测定。细胞毒性测定EL-4细胞用不同浓度的hgp100来被脉冲一小时，并且为了随后的EL-4分辨，把2.5pMCFSE标记其上。得到的细胞和CTLs在21,5，或1%的02条件下共同培养4小时，两

36、种测定法：通过与CTLs共同培养在活化后6天直接获得，或者与事先在21,5,或1%的02条件下预处理的CTLs共同培养，EL-4细胞的死亡通过带有“live/deadfixableyellow死亡细胞染色试剂盒”的流式细胞术来量化。CTL杀伤计算如下：特异性裂解%=（CTL诱导的细胞死亡-自发的细胞死亡）/（100-自发的细胞死亡）。在特异氧气分数下的细胞培养在21%02下培养的细胞被放置在一个具备AtO2,37C和8%C02条件下的经典的孵化器中。为了在5%02下CTL的产生，细胞被孵化于在一个处于37C,5%02和8%C02下的RuskinnInVivo2300工作站。所有细胞操作都处于这

37、些条件下以防止任何细胞的复氧化。低氧室（比卢普斯-罗森堡公司）充满了气体混合物，其组成为7%N2/8%C02/5%02或者91%N2/8%C02/1%02，而这被用于分别为5%02或1%02下的再激活CTLs的培养。所有细胞操作的培养基和缓冲液都有在4弋，且是在与随后的培养/实验条件相一致的气体浓度条件下预平衡过夜的。通过实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem，qPCR）分析RNA表达根据制造商的说明使用QiagenRNAeasy试剂盒提取RNA和DNA酶处理。等量的RNA（53ng）被用来合成cDNA（PrimerScri

38、ptRT;TakaraBio公司），然后，通过实时定量PCR（SDS7900HT仪；AppliedBiosystems公司）的actb（正向：CTAAGGCCAACCGTGAAAAGAT;反向：CACAGCCTGGATGGCTACGT）禾口eefa1a1（正向：TCCACTTGGTCGCTTTGCT;反向：CTTCTTGTCCACAGCTTTGATGA）基因，使用SYBRGreen母液（AppliedBiosystems公司），标准化评估il10（正向：CCAGAGCCACATGCTCCTAGA;反向：AGCTGGTCCTTTGTTTGAAAGAA）和hif2a（正向：TCCCAGTTCCAG

39、GACTACGGT;反向：GGCCACGCCTGACACCT）表达。下面的参数用于：50C2分钟，95C10分钟，和95C15秒-60C1分钟的45个循环。每次反应重复3次。原始Ct值用SDS2.2（AppliedBiosystems公司）获得。2Q方法用于标准化和线性化结果。数字式单分子基因表达谱（NanoStringnCounter）分析RNA的表达使用RNeasy试剂盒（Qiagen公司）从干式细胞沉淀中提取RNA。280ngRNA通过多路Nanostring探针进行杂交并且样品根据公布的程序73处理。探针针对47种不同的基因（Nanostring技术）的分析包括5种标准化基因（支持信息

40、表1）。背景校正通过从原始计数中扣除平均2的SD与阴性对照获得的计数进行。值1被固定1阳性对照作为质量评估:我们检查了样本中最高和最低的阳性对照之间的比率平均低于3。然后，利用选择三个参考基因（actb,tbp,eeflal）的平均值作为最稳定使用GE规范算法来计数靶基因使其规范化74。使用一个内部的Excel宏分析计数每个RNA种类，然后表示为计数（RNA分子/样本）75。细胞因子分泌分析取自初始和效应CD8+T细胞培养物中的细胞因子内容（IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-17,IFN-Y和TNF）通过使用“鼠Th1/Th2/Th17试剂盒”细胞计数磁珠测定法或对IFN-丫,I

41、L-2，或IL-10采用酶免疫分析法（EnzymeImmunoassay,EIA）（BDBiosciences公司）来测定。统计分析统计学显著性差异通过使用医学绘图软件对两组比较进行双尾t检验来评估，或为了RNA分析的三因素方差分析。RelativeRNA酣卩啊亂on%)RHA.(icoiarmli4hj-oo*fa-T30*%esffic-aa3瀬d*吒nEgLJ_wbon2ic4modu-le01StKlUA|ccwntssi.aly65穽ow&a-t电sxI-niTimepaaPungfdayjiIiriitrpostpririmtyUdyf010203040CTLiTumdirrati

42、oA*OT-ICTLsD10203040CTL:Turriorratio這”塁石JEo&dwDPmel-1CTLs21to21%曰21to1%*5to5%05to1%生理氧下CTLs的生成比那些在大气氧分数下产生的要有更高的效应曲线。（A和B）取自Pmel-1脾细胞在21%（黑柱）或5%02（灰柱）条件下产生的CTLs，并被用来分析RNA表达。结果表示（A）平均基因表达或（B）RNA绝对计数+五个独立实验的SEM（n=5）。棋盘格表示42个基因分析（仅基因调节超过30%,pv0.05,被红色或蓝色标注）。（C和D）来自Pmel-1脾细胞的CTLs在氧气分数下被产生作为指示，并通过流式细胞仪被用

43、来分析表达。（C）CTLs被CD62LandCD44染色，门控活CD8+细胞，在0天，3天，和第6天的后活化。散点图显示一个典型的不同天数的实验。线图显示在CTLs之间土SEMCD44+CD62细胞平均百分数，从至少四个独立的实验（n=4）（D）在21和5%条件下CTLs的产生在（21-21%）、5（5-5%）或5%（“21-1%”和“5-1%”）02下被预处理3天。由此产生的CTLs用来评估他们的杀死EL-4肿瘤靶细胞能力，通过在用于预处理的氧气分数下4小时的hgp100（Pmel-1；CTLs；n=4）或Ova肽（OT-ICTLs；n=3）的脉冲释放测得。结果表明从三个独立实验的平均土SE

44、M特异性肿瘤细胞的溶解。ns:无统计学意义,*pv0.05,*pv0.01,*p2元素方差分析;CQ：t检验）。AtoltitcgcNnumter机K3)6-TimepwbrsantiK如ttom(Ebv)IApopioticcells(%)dlriipot-reacliumlidHllfr-岂MeancelldavlslmnurrTtoe-rdipd*.UMga=el*n-质jdmlePM-t-TTMflitivazCBn-dwy)RelanweRNAexpAFsaon亠上三仝z时FdJtecboMgSgggggggggIIIII4+*/s#upreE1onno.modulad2251751

45、2510)75-rs卩*卜6Ins丄T115to1%ve5to5%缺氧调节活化CTL的扩大和RNA谱。的CTL下21%（方形）或5%产生（圆圈）从PmeI位-1脾细胞的O2下21%O2（用实线封闭的正方形），5%O2（实心圆实线）或1%的激活的指示的时间O2（空心方块或空心圆用虚线）。结果显示（A）的平均细胞数，（B）的平均细胞分割数，（C）的平均细胞生存力，以及（D）是指凋亡细胞土SEM出至少三个独立实验（N3）。的CTL下（E）的21%或（F）的5%的氧气从PmeI位-1脾细胞生成的被重新用于下表示氧馏分两天。从CTL的不足21%，重新激活（E）RNA谱（黑网吧）或1%O2（灰色条）。从C

46、TL的不到5%,重新激活（F）RNA谱（黑色直方图）或1%O2（灰色直方图）。结果代表平均值相对基因表达+SEM出四个独立实验（N=4）。在棋盘代表的42个基因的分析（只基因与AP0.05的颜色为红色或蓝色调幅度超过30%）。要显示各条件下调制的共同基因，基因组成的棋盘被相同组织（以任意方式）。NS：无统计学显著，*P0.05，*P0.01，*P0.001（A-D:学生的t检验;E，F：三ODCojnt5&5望%-4IT罩(ouM:-X14-5-2亠占2亠歩csC-wnt5105攀卷誤-価ExpressionMF|)Q137(rVtiMFI)21to21%0.4%23齧1:i.二Q:.中可:雀

47、苕J?:-.“阴7晦1TFy亍IPu1.1IPKTla3w15to5%15.S%sa.70.7%-4勺25.14、.-/61.5%5101%-1T1叩B缺TPlFN-y1D0Q1234Timepwt*iwcliuatioriday)Q-1234Timeposlreactiwatiort(dayComparisonSltalVvsltoSl協*弓lol附西Jto弓附232JIL-1A*0.0006Don&G03661ft.0495IFNV0.1775000250.52050.0&25通过再激活CTLs,减少氧气分数促进IL-10生产。CTLs在21%02条件下产生和在21%(21-21%)或1%

48、02(21-1%)下再激活，或在5%02下生成和在5%(5-5%)或1%02(5-1%)下再激活。四天的后再激活细胞表面表达（A）CD137或（B）CD25被流式细胞术进行评估。（A和B）开放式直方图:对比同形像染色;封闭直方图:染色感兴趣分子。线图:平均荧光强度从三个独立的实验（n=3）。（C）散点:IL-10和IFN-Y从再激活两天的CTLs细胞内染色。（D）IL-10+或IFN-Y+CTLs的百分比，来自于产生在21%（正方形）或5%02（圆）下的CTLs,这是在21%（实心正方形带实线）下,5%（实心圆带实线）或1%O2（开放正方形和开放圆带虚线）下再激活，平均4-5个独立的实验的土S

49、EM（n=4）。那个表说明由双侧t检验计算得出的p值。比较在于，在21%CTLs产生和1%再激活对21%CTLs产生和21%再激活之间（“21-1%”对“21-21%”），或者在5%CTL产生和1%再激活对5%CTL产生和5%再激活之间（“5-1%”对“5-5%”）。平均细胞因子的分泌：（E）IL-10,（G）IFN-Y,（H）IL-2,（I）TNF-a土SEM用三个独立的实验（n=3）。*p0.05。（F）来自于四天的CTLs再激活的细胞产重对IL-10阻断抗体或同形像对比（封闭柱）,两个独立实验的平均+SD（n=2）。*p0.05（t检验）。4SpleenCDS1Tcells叩03%叭Tu

50、morCD8bTcells罢279%139%I8Q吉囈塞滾87Oxygenfraction(%)UnstmulatedOxv9nfrctian(%(-lulaujJNLLr.CD25,CD137，和IL-10是由CD8+TILs体外表达，并且是由缺氧再激活后正调控。脾和肿瘤CD8+T细胞从E.G7-0VA的小鼠进行纯化。（A）CD25和CD137表达用流式细胞仪分析。点图显示一个典型的实验。条形图代表来自六个独立实验（N=17）的平均值土SEM百分比的CD25阳性或CD137阳性的CD8+T细胞。（B）il10和hif2a表达，用qPCR定量。结果表明，从五个独立的实验（N=13）均值+SEM

51、表达。（C-F）CD8+TIL进行培养三天有或没有带aCD3/aCD28包被的磁珠。（C）结果表明从四个独立实验（N=8）的平均值土SEM绝对细胞数目和生存力。（D）CD25和CD137采用流式细胞仪分析开放式直方图：对照同种型染色;封闭直方图：染色为感兴趣的分子。线图（虚线：未刺激实线：aCD3/aCD28刺激）：从四个独立实验中值荧光强度中位数土SEM（N=8）。513.（E）IL-10和（F）IFN-y的分泌通过ELISA进行定量。结果显示从四个独立实验（N=8）的平均值土SEM细胞因子分泌。NS：无统计学意义，*P0.05,*P0.01,*P0.0001（t检验）。参考Ivanovic

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