动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别

1、 姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养弓细胞生死状态的鉴别学号动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别【实验目的】学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。了解动物细胞传代培养的实验方法。学习细胞生死状态鉴别的原理及方法。熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。掌握细胞计数方法，计算细胞存活率。【实验原理】（一）细胞培养细胞培养指的是在无菌条件卞，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理坏境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供

2、体获得组织细胞，在无菌条件卞，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、増殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对彖和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以

3、帮助人类揭开生老病死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。（-）细胞生死状态的鉴别细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在以下差异：细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过：而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤蘇红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙唳

4、或漠化乙唳等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题

5、目动物细胞培养号细胞生死状态的鉴别学号发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，枳累在细胞内，荧光显微镜卜显示有明亮的绿色或黄绿色荧光：而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色：死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。【实验材料】器材：解剖剪、解剖蹑、培养皿、纱布块、玻璃漏斗、量筒、

6、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、L型注射器、离心管等。上述器材需彻底洗净、烤干、包装好，灭菌，备用。超净工作台、倒置相差显微镜、C02培养箱、普通光学显微镜、离心机、血球计数板、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、解剖板、盖玻片等。试剂：培养液、PBS液0.4%台盼蓝染液、0.15%伊红染液材料：小白鼠【实验步骤】取材取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周鬧的脂肪组织，蹑起脾脏用PBS液自上而下冲洗1一2次。转入无菌玻璃培养皿，待用。分离脾细胞用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L

7、”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml,然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1一2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至lml,以3000r/分离12分钟。培养脾细胞超净工作台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml,并在皿盖上画上标记，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用“枪（200p1）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中

8、,用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37C、5%二氧化碳培养箱中培养。台盼蓝法鉴定细胞的生死状态（1）试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。（2）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l-2ml,静置3-5min,待见到姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号山东大学实验报告年月口山东大学实验报告年月口 姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号图1培养

9、液镜检结果（细胞总数-死亡细胞数）细胞总数取老师提供的细胞染色后置于显微镜下观察时，可见视野中有很少的带有浅蓝色的细胞，而透明细胞较多。中方格的位置（相对于视野的位置）死细胞数活细胞数细胞总数左k05353左下15657右上35457右下06060细胞存活率=X100%53+56+54+60=-X100%53+57+57+60=98.24%每亳升液体中细胞的数二（53+57+57+60）/4*16*10000=9080000注：细胞计数及存活率的计算结果均对应于老师提供的细胞。【思考与讨论】（一）实验结果分析活细胞边缘较明显，而使细胞脸维持正常的选择透过性，染料无法通过，所以呈现透明无色。死细

10、胞由于细胞膜不再具有生物活性，染料从细胞膜通过，将细胞染色，且死细胞的边缘不明显。将培养基刚从培养箱拿出来时，培养基的颜色应呈现无色（由于细胞的代谢产物为酸性以及培养箱中的二氧化碳浓度较高），过一段时间后渐渐恢复粉红色。姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养弓细胞生死状态的鉴别学号用倒置显微镜观察时，可以看到在黄色的背景下有一些透明的细胞。（-）注意事项在进行方格查数时要注意：数上不数下，数左不数右。实验涉及的台盼蓝染料有致癌危险，因此滴加染液时要小心，防止溅到皮肤上。动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或灭菌处理，才能在超净工作台中使用，整个实验过程都要有

11、无菌操作的概念，避免细胞被污染。在超净工作台内点燃酒精灯后，实验操作应在火焰的附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后要待其冷却才能夹取组织，经过培养液的用具不能长时河烧灼，以免烧焦形成碳膜。超净工作台内吸取溶液用的的各种吸管等不能混用，以免相互污染。在超净工作台中，组织细胞、培养液等不能敞开暴露过久，以免溶液蒸发和pH变化。器皿、离心管培养瓶等在离开超净工作台前必须将盖子或橡皮塞盖紧，以防止细胞污染或溶液漏出。（三）反思与总结做实验的时候由于显微镜的光线问题，死细胞的颜色有时不太明显，在观察的时候需要注意。将脾加入到培养基后，准备将其加入到培养箱培养时，检测一下培养基中是否有气泡

12、，若有气泡的话，则应除去后再放置。用注射器的针头对小白鼠的脾进行穿孔时要小心操作，既不能刺得太狠将脾弄破，也不能刺得太轻使得到的脾细胞过少。注意进行无菌实验操作的规范，身体只有消过毒的部分才可进入超净工作台，防止身体的其他部分将细菌带入。注意用倒置显微镜观察培养基中细胞的正确方法。（四）思考题为什么要学习细胞生死状态鉴别的方法？试说明其实际应用意义。答：在细胞培养的实验室操作以及制造生物制剂时，有时需要确定某舟细胞的生存状态，以便进行下一步操作，因此选择恰当的细胞生死状态鉴别的方法是十分重要的。各种细胞生死状态方法的原理和判定特征是什么？答：原理主要是基于细胞膜的选择透过性和代谢上的差异。鉴别

13、方法主要是化学染色法和荧光染色法。化学染色法：活细胞的细胞脸是一层选择透过性膜，只允许物质选择性地通过，而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。因此一些化学染料能使死亡细胞着色，而活细胞不着色。荧光染色法：活细胞中新陈代谢作用强，一些酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸入，活细胞的酶有较强的活性，将其分解成能发荧光的荧光素该物质不能自由透过细胞膜，积累在细胞内，显微镜卜显示有明显的荧光：而死细胞内的新陈代谢停止，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下不发光。除此之外，鉴别植物细胞的死活还可以采用其质壁分离性质，将植物细胞放入高渗溶液中，观察其是否发生质壁分离。若发生，则为活细胞；若不发生，则为死细胞

14、。活细胞、坏死细胞和凋亡细胞的形态特征是什么？它们的主要区别有哪些？姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号答：活细胞的外形较规则，细胞膜的边缘明显，细胞中能够清晰地看到细胞核。坏死细胞的特点是：细胞质膜和核被膜破裂，细胞骨架和核纤层解体。细胞质溢出，影响到周禺细胞，发生炎症反应。细胞凋亡的特点：细胞质凝缩，细胞萎缩，细胞骨架解体，核纤层分解，核被膜破裂，核DNA分解成片段，出现梯形电泳图。细胞坏死指的是细胞收到物理、化学因素的损伤，如机械损伤、毒物、微生物、辐射等，引起的细胞死亡。而凋亡是“细胞的程序性死亡”，是个体发育、存活必需的正常秩序的一部分。细胞

15、凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件卞，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存坏境而主动争取的一种死亡过程。在动物细胞培养操作过程中，应如何加强无菌操作的观念以避免细胞污染？答：动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用整个实验过程都要有无菌操作概念，避免细胞被污染。组织块贴壁培养时，为什么要将贴有组织块的培养瓶先翻转过来培养？翻转培养瓶的时间不宜过长，为什么？答：为了使组织块略干燥能牢固粘于瓶壁上。时间过长，则组织粘得太紧，不方便培养。皮肤组织块培养时，要

16、静置培养并尽量减少晃动培养瓶，为什么？答：晃动培养瓶可能会影响细胞的生长，使刚生成的细胞膜破裂。加入培养液后，即可终止胰蛋白酶的消化作用，为什么？答：加入培养液后，细胞获得了足够的养分，也就解除了接触抑制的状态，因此胰蛋白酶的消化作用终止。在细胞传代时，将原培养液倒去后用D-Hanks工作液洗涤细胞2遍，再加胰蛋白酶，为什么？答：D-Hank*s是常见的平衡盐溶液之一，它是组织基本用液之一、在细胞传代时，要确保传代细胞的细胞的渗透压与培养液保持一致，因此需要用D-Hanks工作液洗涤，起到过度作用。【作业】（一）抑制肿瘤细胞増殖药物的筛选方法。MTT法（1）接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养

17、液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.（2）培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。（3）呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMS0,振荡10分钟，使结晶物充分融解。（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。荧光染色法第一种方法是定量的确定荧光强度，然后来半定量的说明细胞活着的数

18、目。山东大学实验报告年月口山东大学实验报告年月口 姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号第二种方法是取多视野拍摄荧光照片(细胞应该在培养皿上贴壁),然后用软件ImageJ来数出细胞数量，这样取平均数。WST-1法方法体外培养人鼻咽癌细胞至对数生长期.加入待检抗癌药物。继续培养48h后每组各取6孔加入一定量的WST-1试剂，然后测定0D5：。值，计算细胞相对增殖度RGR1,每组再各取6孔，加入5g/L结晶紫罗兰染色3min后，加入10g/L十二烷基磺酸钠，测定0D588值。巢蛋白法提供肿瘤的特定细胞株和培养条件鉴定上述肿瘤细胞株表达巢蛋白的表达加入待筛选的

19、药物培养48小时或更长的时间，检测巢蛋白的表达，检测结果与b步骤的结果进行比较，如果出现巢蛋白表达卜调的情形，该待选药物成为抑制肿瘤增殖和/或促进细胞凋亡的先导药物。诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物的筛选方法。方法：利用脂质体法转染质粒进入细胞，筛选稳定表达E2F-1的细胞克隆，通过North亡rnblotting法和Westernblotting法鉴定阳性细胞克隆中E2F1的表达水平以及相应PAC1的表达水平；应用荧光素酶法检测E2F-1蛋白对PAC1启动子序列的转录激活水平，并借助体内ChromatinIP法和体外EMSA法分析E2F1转录因子与PAC1启动子之间的特异性结合作用。分别应用Wes

20、ternblotting法，台盼蓝染色法和TUNEL凋亡检测法，鉴定高表达E2F1的细胞经药物4-耗苯基维胺脂(4-HPR)处理后其ERK1/2MAPK激酶的水平变化，细胞的生存率变化和凋亡出现的情况：建立高表达PAC1的稳定细胞克隆并检测PAC1本身对ERK1/2MAPK激酶磷酸化水平的影响和对细胞生长的抑制现象；通过小干扰RNA技术构建表达PAC1-siRNA的稳定细胞株，进一步检测PAC1在E2F-1介导的肿瘤细胞凋亡反应中的作用。利用脂体瞬时转染法构建细胞Saos-2/siE2Fl和Saos2/siPACl,应用Wresternblotting法比较细胞中经4-HPR处理前后E2F1和

21、PAC1的表达水平以及ERK1/2的磷酸化水平，并用台盼蓝染色法检测细胞在不同剂量的4-HPR处理下存活率的改变规律：在Saos-2细胞系统中，用Westernblotting法检测E2F1卜游相关靶分子，包括p73、加afT、caspase-9和caspase-3的蛋白变化情况；选择人成纤维细胞株NHF3作为研究对彖，通过检测细胞在不同剂量或不同时河的4-HPR处理下E2F.1、PAC1和p-ERKl/2的表达及细胞存活率的改变，探讨药物4-HPR对正常细胞的作用：应用其他几种临床常用的抗肿瘤药物，如依托泊昔Etoposide(5OpM)、5-氟尿喀唳5FU(30mM)、阿霉素Doxorub

22、icin(1.7pM)和【I弓|I1朵美辛Indomethacin(500pM),与药物4-HPR进行平行比较，检测高表达E2F-和PAC1的细胞在不同药物处理下的存活率。结果：在细胞MB435/E2F1-C2和MB135/E2F1-C3中有高水平的E2FT转录和表达，同时PACI的inRNA水平和蛋白水平也随着E2F-1相应升高；荧光素酶法结果显示，与对照组的空白质粒姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号相比，共转染E2F-1的表达质粒和含正常PAC1启动序列的荧光素酶报告质粒可以使检测到的荧光素酶活性增加约15倍，E2F-1町以通过激活PAC1的启动

23、子实现对PAC1的转录表达调控：体内ChromatinIP法和体外EMSA法的结果证实E2F1转录因子与PAC1启动子之问有特异性结合作用。在抗肿瘤药物4-HPR作用K，高表达E2F-1可以抑制ERK1/2MAPK激酶的活化并诱导肿瘤细胞发生凋亡；利用高表达PAC1的细胞进行一系列检测，结果显示PAC1本身也可以通过抑制ERK1/2MAPK激酶信号通路而诱导肿瘤细胞凋亡；进一步对PACl-siRNA细胞克隆的检测显示当除去PAC1的作用以后，E2F-1就不能够抑制ERK1/2激酶的活化，而且E2F-1也不能够有效地介导4-HPR作用卞的细胞凋亡反应，证明PACI是E2F-1凋亡通路中重要的介导

24、者，在E2F-1诱导的肿瘤细胞凋亡反应中起重要作用。对细胞Saos.2/siE2Fl和Saos-2/siPACl的检测结果显示在降低了内源性的E2F-1表达水平或PAC1表达水平后，其对ERK1/2激酶的抑制作用减弱，细胞对药物4-HPR的敏感性降低：检测其它一些与E2F-1凋亡功能相关的靶分子，结果显示4-HPR处理后的Saos-2细胞中，并没有看到这些分子被诱导表达的现彖，证实E2F-1/PAC1途径是一条特异性的传递凋亡信号的通路；将药物4-HPR应用在人正常成纤维细胞NHF3中，结呆证明正常细胞对该抗肿瘤药物4-HPR并不敏感：应用了其他几种常用的抗肿瘤药物后，结果显示药物Etopos

25、ide5-Fu和Doxorubicin并没有引起高表达E2FT和PAC1的细胞出现明显的凋亡，而药物Indomethacin处理后可以引起高表达E2F1和PAC1的细胞出现明显的凋亡现象，这种表现与使用药物4-HPR后类似。结论：PAC1是E2F-1的直接转录调控靶分子。E2F-1可以通过PAC1抑制ERK1/2激酶的活化并诱导肿瘤细胞发生凋亡。E2F-l/PACl/MAPKs通路是E2F-1介导I、的一条特异性的凋亡信号通路，药物4-HPR通过该通路对肿瘤细胞有特异性杀伤作用，对正常细胞的毒副作用较小，具有临床应用价值。（三）细胞冻存和复苏的方法细胞冻存（1）概述目前，细胞冻存最常用的技术是

26、液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体脸由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞脸上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰

27、晶的形成。采用甘油或二甲基亚枫作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度人，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号（2）细胞冻存操作步骤细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中

28、离心（1000r/min,10分钟）。制液：去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4C预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3X1061X107/mL之间分装:将上述细胞分装于安甑或专用冷冻塑料管中，安甑装11.5mL在火焰喷灯上対II,封II处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存口期，同时作好登记（口期、细胞种类及代次、冻存支数）。封II：用塑料瓶时拧紧瓶II即可；如用火焰封闭瓶II后，仔细检查，定要封严，必要时可浸入蓝色液中观察，为安全起见，把瓶缝入纱布小袋中，以防液氮浸入后，融解时因受热发生爆炸伤人；纱袋一

29、端系以线绳，末端扎有小牌，注明：细胞名称，冻存口期，以便口后查找。冻存：置于液氮容器颈II处存放过夜，次口转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安甑置入4C冰箱中23小时，再移至冰箱冷冻室内34小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安甑细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。（3）常用冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意：一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196C,使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免

30、引起冻伤。液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶II有双层焊接处，防止焊接部裂开。在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（121C蒸汽高压消毒），2mL安甑（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。复苏方法（1）细胞复苏的原则在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细

31、胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。（2）主要操作步骤从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。姓名系年级组别同组者科目细胞生物学实验题目动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号迅速放入盛有36C37C水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。剪开纱布II袋，取出安剖，用70%酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。低速离心（5001000转/分）5-10分钟，去除上清液后再重复用培养液漂洗、离心。加入培养液适当桶释，接种浓度1X109/L,再移装入培养瓶中，置温箱培养，次口更换一次培养液后再继续培养。观察生长情况。若细胞密度较