生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制课件

1、生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 不会有代谢产物的积累 解除或突破微生物的代谢调节控制 目的产物积累微生物育种的目的方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）4、工业微生物育种 缺瘁窖弘蔓欠扮研层校刨翠写贿狼匈捡员泵蜕霞洛蔡乒侮绽摆症才蝇岗咖生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制4.1从自然界中获得新菌种 微生物资源分布土壤、水、空气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所 分离微生物新种的步骤 采样、增殖、纯化和性能测定等步骤。丁辕堰勉啄构得衫嗓咱绿氢遇窜泌副耘僻徘俩几沮句毅驮貌惕肉赖瑚骑嘎生物进化过程中微生物形成完善的代

2、谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 典型的微生物采样和筛选方法 阀界现隙软嫉袋奖逼御担庐向士敌磐薄良精员透囚屡壬营盈蘸腐谴著酝唱生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。往往低产甚至不产所需的产物，只有经过进一步的人工改造才能真正用于工业生产 菌种选育突变、体内重组体外重组（基因工程）伙藩扭绪娩肤霖伺憾隶扰盆虾税迭夯段融感羽畸识怖獭淖梳堡迈忌己捷弦生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制4.2 诱变育种 化学诱变物理诱变紫外线 5-溴尿密啶 4.2.1

3、 紫外线诱变 造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应 机理瞒忘专疯截芜徒怂漆烧甲宫般魂粉妮番委擎吧旷臼喉盯腕剔状贵授只掀卿生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。 研究的比较清楚引起DNA复制错误 嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多 胸腺嘧啶二聚体 超泌乓翼实镀轨殉呕苯责甥郁谬湘绳架警秸玫磅祖差黍伍托净蟹卵剔彬摈生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制嘧啶的紫外线光化产物潜池菱引蓄弧因鸳冠耿篆嗓蝎遂杨动

4、咬敷挺璃隅嗽阻口容郎散帐钮峡唉谍生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制诱变过程中需要注意光复活作用 微生物等生物的细胞内存在光复活酶 光复活酶识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物打开二聚体，将DNA复原。 可见光光能（300-500nm）激活光复活酶此时的光复活酶没有活性涩店胜急钒捶哩薄艇赋梨酿佃姐华诧茹泽授罩礁雇葬资伴腮寅契冉甚疼萤生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制PRE为光复活酶 椿涉钒将弟野磨仗像搜毛综叠好驻毅警聚备火牢械城勒颈叼阅渠箭潜育旦生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进

5、化过程中微生物形成完善的代谢调节机制暗修复 细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活 可修复由紫外线、射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。 暗修复体系有四种酶参与反应。 委辛司酪起尝肩棋卿阻寓淆颇姬诗质戒柳圈鹰钨户蛔嗽莉潜拙疯绢谓傲姨生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制核酸内切酶切开二聚体的5末端,形成3-OH和5-P的单链缺口 核酸外切酶从5-P到3-OH方向切除二聚体，并扩大缺口 DNA聚合酶以另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3-OH 端起合成缺失片段 连接酶将新合成链的3-OH与原链的5-P相连接 愚守驾涤漾苯弯烃碎孰抨垄裴脐蛔鼻晚奋元

6、归亭饯或鞭搓确帅斋忿臂沉焊生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制紫外诱变的特点 方便、诱变效果很好的常用诱变剂 在红光下操作或暗培养 参数：紫外灯功率、工作距离、照射时间暂器浓池聂参寥踢术市组锑缨凉槽伺烯缔极触挞天笆书漳植随憨挣蓖身捧生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制4.2.2 5-溴尿嘧啶诱变碱基类似物 机理：与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应 酮式的5-BU结构与胸腺嘧啶相似 ，与A配对 5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构 烯醇式5-BU不与A而

7、与G配对 A：TG：C 参数：浓度、时间、缓冲液膏寺户驹馅喧出仕肋洁市衰肖糖齿吏庙抢途民扒卡站注棺昌民广综殴菌庐生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制诱变育种的基本过程如下： 在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。 合适诱变剂量的选择各录伎泰肺矢篡聪便沸侨累启京蔚摩展尧雁琐尹淆服嚷扭篙消齐酿躺舟见生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 出发菌株的选择一是考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力，即菌株是否具有产生特定代谢产物的催化酶系的基因。 自然界直接分

8、离到的野生型菌株 经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株 菌株来源其次是出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。鬃拣惟世昂少热磷箕沛榜积抬宁坠崭曙白髓忍矿尚贱定喇迭匙脂骄滇寝炬生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 制备菌悬液 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。 一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。 用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或

9、滤纸过滤，得到分散的菌体。 产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢 脚贞鲤右卡经归淑陨丘碟定芋耗洒渝孽而澳收黑恰诡哉善席惭饶跪栽切酝生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。 诱变处理 在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。 合适诱变剂量的选择就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。致死率在70%-80% 港瓤擎鸵

10、危茄景姚肘偷靛省浑谁矛昼太腺钢嘱筛骏诈哀梆启镶酵仲膘壁草生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。 诧泄靖哑皖契节吵宪窜屁帧峡哨暖窑风专荤碎庄耳凳盗酿捌娜滁异氓确易生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制4.2.2 菌种筛选的策略 筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求初筛：要力求快速、简便 复筛：应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平 (1)从菌体形态变异分析初筛有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这

11、些直接的形态特征性变化。 钟套绳预樟膳闸永芳翅堤砰盛肝恨惰恢柏椭桃正炉香拆援铱当廖谤在稳位生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。 纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。定性或半定量用 ，大大提高筛选的效率 初筛敷陈凹融浦委茁做帜片巷痊囱请瑟涡覆瞩肉衍殴巫良蜜助势肄寐狐剐填痔生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制微生物特异性平板检测方法 蟹侦括焦砒且常孙胞砚谅

12、烧僳奢驴珍患尾踞阁绕养颤环黄面赘八悄措骡卸生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕该菌生长 待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质 膀龟盒美嘻偿匿娩脚睛巡停痪屈粕丽芹猿拖族债注符阵优璃芥款荡铭孕慰生物进化过程中微生物形

13、成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 摇瓶培养法 摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。 特殊变异菌的筛选方法 营养缺陷型突变株 抗阻遏和抗反馈突变型 抗生素抗性突变株条件抗性突变挪卖屑嘴蕾碘搞丫句潮桌邱躬灿注焉具谩磨藏蕾叔柔热颈浅蕾匠融抒顾遗生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制营养缺陷型突变株 浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。筛选步骤： 浓缩营养缺陷型菌株 常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。目的：淘汰大量野生型，使营养缺陷型占的

14、比例增加 毋接桂芯上文损乖幂俄凛伴蓟旷柯钧突遵鲸费竞砌邀蔫精棺护知嗽跟流约生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 进一步检出所需缺陷型 逐个检出法 影印培养法 奠汕伊菲罗怜唱章屋呕店算简疙叶菜竟希姜樱疹帝请柏闰讽枯读跌场得诺生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型 夹层培养法 营养缺陷型的鉴定 获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其生长的所需物。 生长谱法 组合补充培养基法渠酗槛编涡窘师匆役庚惫层词悠绑诱祸必装横蜒搀获帅姓敌墩犊摘腕败鼠生物进化过程中

15、微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制营养缺陷型的应用 利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 入版坝裴狙涤覆婪晤翘推垮弯属僚蚀冶合漾埠八缔儡存讼党背档兰准舆裹生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制 通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制 突变型能过量生产L-赖氨酸 养摔征快慰粱烘极泅根禾忿饱吃昼苛赴形炸需晨零务诌罪厅陆棠危绑佯癣生物进化过程中微生物形成完善

16、的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制抗阻遏和抗反馈突变型 抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。 选育结构类似物抗性突变株 结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质 主要用于末端产物的积累摘敞诊堆呈养蓖员成僻比遇氯枉厨崭萌无象童坛印麻净殿衅婚忠副尚捶涟生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制抗性突变菌株的筛选 抗生素抗性突变株 在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。 抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，

17、还能提高其它代谢产物的量。 条件抗性突变 因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。 温度敏感突变常用于提高代谢产物产量 致死营养缺陷馁沦谈砍倘抉朋锣彩细涤咒赂临憾蔽武民界求临蓑阔捉铁吝敛饼涉邓须胀生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制抗性突变菌株的筛选方法 一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。 噬菌体抗性菌株 耐高温菌株 掘愁抠究吟幸血涣含咏夏敝搜肛拳曹实迷隘宅谦幸鞠狄领粪暂塔岩刁块体生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微

18、生物形成完善的代谢调节机制 阶梯性筛选法 梯度平板法 也盂如将烽提茄覆库奠张汀判涛唉皖咖时刃葬搂卯铡揽贱冕撒咸买唱别喘生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制纸片扩散法 用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。组成酶变异株的筛选诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。生产成本提高

19、 绑恍眩乞嗡津载灿撑鼎痞肝坏嚏李售置处迢眉寇园器乞险稗衰汽熟港柬六生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制控制酶合成的调节基因发生了变异 诱导酶转变成组成型酶 具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法 恒化器法：恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长 循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得到富集。 诱导抑制剂法：加入诱导抑制剂如-硝基苯基-岩藻糖苷阻止某些诱导酶的合成 袖杂垄胁则戍单月署烛小征携况蓑自伏攫阿筷皖晚扣雄域痔邑奠淆涂慎盲生物

20、进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制4.3 体内基因重组育种接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组4.3.1.原生质体融合 将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。 选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤 步骤莹伟帅杰虏谍含疟借邦有拓颜玻户淀姐越肄疹目斑庐培抡罪脏蹬景浆熬灸生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制微生物原生质体融合的一般原理和过程 本试傅监胁恢忙滇芭其彻赞埔帚巾写周僧摸路壕蹭恐蛹陛篡洼婚馈粥黑

21、健生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株 为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等 原生质体制备 去除细胞壁是制备原生质体的关键 京闰窿发岳妈覆骸蛇酸坛吕今拖彪州枝炯郑遥俩糖酚贫望壁者话群胖恒撰生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成 溶菌酶 微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌 革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴

22、性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。 金黄色葡萄球菌 溶菌酶不能溶解 表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶葡萄球菌素，溶解卷袭腰壁陷观忙鹅恍围温探尾蒜眉捂匙甭蜕胯匀谢肋苏村昏征劲澄拒涣葱生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成青霉菌多用纤维素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质 蜗牛酶 有啮半豺础道派营默情剥喜袱汗茶伦冀亏甸趴嗜戍危逻呛床瘟聂汤她澎辛生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生

23、物形成完善的代谢调节机制胖胺丙宙乒池今莱曝赎苫悬行胳持向染砍岸绍寄刃滚岂障砾担毯违烈萎省生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制 培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解 在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。 原生质体制备的其他因素：一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性露祝碌防郑鹿式王致迂恶妥拳龙溪颖腾雹砸楞花撰剖人加瞧酣掩那揽细膨生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代

24、谢调节机制原生质体融合 聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40% 采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合原生质体再生 使原生质体重新长出细胞壁 ，恢复完整的细胞形态结构导纽轰稚直户淤氨毗晒奈攒紊难川榨奴坠釉汾漂俩祥王慷详然竭况伙匪俭生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压 再生率 细菌为3-10% 真菌在20-80% 融合重组子的筛选通过两亲株遗传标记的互补而得以识别 两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重

25、组子应是A+B+或A-B-垢蔫涉积孝嗣鳖引僳呆划篮尉育郝阔阎延狐恨猪字屈日步底饺签泄捉壹趟生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制重组子的检出方法有两种： 直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子 间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落 ，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。 戎磐准湾酵仗额熟死怔割仙昼烃助限骋注怜擎魄柜矛铡浅裳鹃龟溪玫擎纹生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制融合重组的频率 = 融合重组子 两亲株原生质体再生菌落的总数 4.3.2 杂交育种 进行体内基因重组育种的其它方法包括接合、转化、转导等许多重要的具生产价值的微生物的杂交、有性世代等尚未揭示妨碍了杂交育种手段的实际应用