山羊基因克隆实验方案设计

1、 山羊基因克隆实验方案设计第五组提取DNADNA检测（电泳）目的DNA片段基因扩增（PCR）DNA检测（电泳）目的基因片段与载体连接大肠杆菌感受态细胞的制备导入受体细胞与蓝白斑筛选阳性克隆鉴定9.DNA测序一、DNA提取【实验目的】指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。【实验原理】组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。【实验步骤】30mg组织，用眼科剪剪碎，加入200TLbuffer+20uLPK,55C水浴1-3h。加入220uLbufferBL,振荡15s,70C放置10min,溶液变清亮。10000r离心2min,移上清液至新离心管。加220uL无水乙醇，充分振荡

2、15s,可能会出现絮状沉淀。将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000r离心30s,弃废液。向吸附柱加入500uLWB,12000r离心30s,弃废液。向吸附柱加入500uLwashbuffer,12000r离心30s,弃废液，空滤一次。将吸附柱转入干净离心管，加入50uLTE,放置5min,12000r离心2min,备检。二、DNA电泳检测【实验原理】琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.16.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，D

3、NA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。【仪器与试剂】琼脂糖、10XTAE电泳缓冲液（40mMTris,20mMNaAc,1mMEDTAPH8.0）、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）、凝胶槽、电泳仪【实验步骤】取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100C加热溶解。平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.51

4、mm）。铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50C左右倒入凝胶槽，胶厚一般为58mm。待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶23mm,小心拔出梳子。DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间）。电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。三、目的DNA片段基因扩增（PCR）方案1遗传

5、学实验31，PCR扩增基因片段方案2：【实验目的】了解多聚合酶链反应DNA扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。【实验原理】PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应是1986年由KallisMullis发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物

6、经酶促合成特异的DNA片段的体外方法，由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA得以迅速扩增，主要过程如图6。置待扩增DNA于高温下解链成为单链DNA模板；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72C将单核苷酸从引物3端开始掺入，沿模板53方向延伸，合成DNA新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR产物以指数方式增加，经2530次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqD

7、NA聚合酶缺乏53核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，不过InnisMA发现，错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。Unamplified“湫primersleitatureaftdprifttroilnatUJSand原理示意图aim电alprine1-5图3-1PCR原理示意图PCR技术应用广泛，不可能有这样一套条件满足所有的实验，但本实验所介绍的方法可适应于大多数DNA扩增反应，即使有的不适应，至少也确定了一个共同的起点，在此基础上可以作多种变化。不过下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。1、模板

8、：单、双链DNA和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料是RNA,须先通过逆转录得取第一条CDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng量级的克隆DNA，ug级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，TaqDNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。2、引物：引物是决定PCR结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3末端）的序列。（3）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3末

9、端重叠的序列。（4）引物的长度约为20个碱基，较长引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。（5）引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。3、缓冲液：PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCI2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP的浓度为0.2mM时），浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量降低。四种dNTP浓度通常每种都是0.05mM0.2mM。过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过

10、早终止延伸反应。另外dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变oTaq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是14单位/100ul,浓度过高，产生过多的非特异片段。4、循环参数：PCR循环是把起始材料加热到9095C,保持短时间使双链DNA解链；然后冷却至3755C，使引物与模板退火；再升温至7075C，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。用DNA扩增仪时，94C保持1min可使模板的起始物完全变性。若用低于94C的条件，则应适当延长时间。引物与模板退火温度由引物的长度及

11、G+C含量决定。适时间退火（12）min有利于产物的特异性。引物延伸在7075C保温的时间可根据扩增DNA片段的长短来调节。正常情况下，每min可延伸1Kb的长度，常规PCR一般为2540个循环，若循环加长，则由于酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易产生错误掺入，所以在满足产物得率前提下，应尽量减少周期次数。【仪器与试剂】一）仪器与器皿PRC扩增仪（PE2400）,琼脂糖凝胶电泳设备，微量取样器，一次性指形管，凝胶成像仪,玻片（二）试剂与材料琼脂糖凝胶电泳试剂：1）电泳缓冲液：Tris乙酸0.04mol/LPH8.00.002mol/LEDTA；2）加样缓冲液：0.

12、25%溴酚兰40%w/v蔗糖；3）溴化乙锭溶液：0.05mg/ml溴化乙锭/水；4）琼脂糖、TaqDNA多聚酶、5反应缓冲液：125mmol/LTris-HClpH8.2；10mmol/LMgCl2；0.5mg/mlgelatin；125mmol/L（NH4）2SO4；Formamide25%、混合dNTP液（dATPdGTPdTTPdCTP各2mmol/L）、DNA模板（每2ml中含有10fg待扩增DNA）、引物1（25pmol/L）,5加入EcoRI粘性末端碱基、引物2（25pmol/L）,5加入Hindlll粘性末端碱基、无菌水【实验步骤】按顺序在200ml指形管中加入以下试剂与样品。（

13、因购入的试剂批次不同，加样时有所差别，以预实验结果为准。总体积共100ml，也可以配成40ml的反应体系）表3-1PCR所用试剂样品及其用量试剂及样品用量/mLddH2O7410Buffer10MgC12（10Buffer如已加入MgC12，则不必加）6dNTP2引物12引物22模板2TaqDNA聚合酶22.在PCR扩增仪上按表3-2反应条件编入程序（以下为参考值，因扩增的DNA片段不同，各类PCR扩增仪程序设定各不相同，编程过程视扩增的DNA片段的要求及仪器而定）。表3-2PCR反应参数条件循环条件（30次）预变性变性复性延伸温度94C94C55C55C时间2min40s35s2min10s

14、延长延伸72C7min编完反应程序，置反应管于PCR扩增仪的反应孔中，开动机器，扩增循环反应开始。PCR扩增完毕，配2%琼脂糖凝胶，取15ml反应液及相适应的PCRmark分别点样，加样缓冲液应为40%W/V蔗糖，电泳观察结果。凝胶成像仪或紫外灯下观察实验结果，是否已扩增到实验设计的DNA片段。四、DNA电泳检测（具体方案见实验2）五、目的基因片段与载体连接【实验原理】克隆载体（T载体）：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连

15、接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产

16、物双链DNA每条链的3端加上一个突出的碱基AopUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3端带有一个突出的T。【pUCm-T载体（pUCm-TVector）是用于克隆含有A末端PCR产物的理想载体。】这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。连接反应的温度在37C时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16C，连接12-16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。【仪器与试剂

17、】旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。T载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌ddWater【实验步骤】采用胶回收试剂盒回收2%琼脂糖凝胶电泳检测后的目的条带（目的基因）。PCR产物与T载体直接连接：事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416C。取4个灭菌的200UL微量离心管，加入（需要调整）：4UL目的基因、1ULT载体、0.5ULT4DNA连接酶（TAKARA,350U/ul）、1UL连接酶缓冲液10 xbuffer、3.5ULddWater；总量10uL体系上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C干式恒

18、温仪（或14C水中）中保温过夜（12-16h）。4连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4C冰箱备用。六、大肠杆菌感受态细胞的制备【实验原理】细菌在0CCaCl2低渗溶液中膨胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。【仪器与试剂】旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50mL微量离心管，1.5mL微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp）,酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器E.coli菌种，LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液，无菌ddWater，L

19、B培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddwater，IPTG，X-gal。【实验步骤】在超净工作台中，将1mL大肠杆菌菌液加入100mLLB液态培养基（不含抗菌素）,37C摇床培养过夜。取0.5mL上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37C下250r/min摇床培养23h,测定OD590为0.350.4左右（0.40.6，细胞数108/mL,此为关键参数）。（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB培养液同时摇菌）将1mL菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min,然后于4C,5000r离心5min。将离心管倒置以倒尽上清液，加入1m

20、L冰冷的0.1mol/LCaCI2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。5.4C,5000r离心5min,弃上清液后，用100UL冰冷的0.1mol/LCaCI2溶液垂悬，插入冰中放置2h,可以直接用作转化实验，或立即放入-4C冰柜中保藏。七、导入受体细胞与蓝白斑筛选【实验目的】掌握目的基因导入受体细胞的方法、了解蓝白斑筛选法。【实验原理】细菌在低温下经CaCI2溶液处理，细菌细胞膨胀成球形，提高了膜的通透性，转化混合物中的DNA,形成抗DNase的羧基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面上，经42C短时间热冲击处理，会使受体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态。在此期间它们能够摄取各种

21、不同来源的DNA,如入噬菌体DNA或质粒DNA等。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。一些载体（如PUC系列质粒）带有B-半乳糖苷酶（lacZ）N端a片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS）,可用于构建重组子。这种载体适用于仅编码B-半乳糖苷酶C端s片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，a片段与s片段可通过a-互补形成具有酶活性的B-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由a-互补而产

22、生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏a片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。【仪器与试剂】（一）仪器及工具超净工作台，高速离心机，恒温摇床，恒温水浴锅，消毒离心管（EP管），玻璃培养皿，玻璃涂布器，标记笔。（二）试剂LB液体培养基：00mL去离子水中加入10g胰蛋白胨,5g酵母提取物，10gNaCI,待完全溶解后，定容至1000mL,高压灭菌后备用。LB固体培养基：取已配制好的LB液体培养基100mL,加入1.5g

23、琼脂粉，搅拌至溶解,高压灭菌后置于超净台冷却后备用。X-gal：用二甲基甲酰胺溶液溶解至浓度为20mg/mL的储存液，小份分装后用锡纸包裹贮存于-20保存备用。IPTG：用10mL灭菌双蒸水溶解100mgIPTG,滤膜过滤除菌，分装后冻存于-20保存。【实验步骤】在无菌条件下取将100感受态细胞置于无菌的1.5mL消毒离心管（EP管）中，加入目标基因5,轻轻旋转以混合内容物。置于冰上放置30min；将盛有连接产物的离心管置于42C恒温水浴锅中，热击90s后，冰上放置12min；在上述离心管中加入500的LB液体培养基；5.37C摇床以150r/min培养1.5h；取200涂布于含有IPTG（异

24、丙基硫代-B-D-半乳糖苷）和X-gal的LB琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀；室温放置10min后，倒置培养1216h至单菌落形成；挑取白色菌落接种于盛有1mLLB液体培养基的1.5mLEP管中，37C摇床培养过夜。八、阳性克隆鉴定【实验目的】学习大肠杆菌转化阳性克隆的鉴定，学习碱法提取质粒DNA的方法和技术【实验原理】重组质粒转化大肠杆菌宿主细胞后，还需要对转化菌落进行筛选鉴定。利用a互补现象进行筛选是最常用是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体（如pUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有B-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和B-半乳糖苷酶a肽链氨基端（146个氨基酸

25、）的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。这种载体适用于可编码B-半乳糖苷酶C端部分序列（s片段）的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。碱法提取质粒是基于细菌染色体DNA与质粒DNA的变性与复性特征而达到分离目的的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的质粒DNA两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒复性迅速

26、而准确，而细菌染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成网状结构，通过离心，细菌染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物以及细菌碎片等一起沉淀下来而被除去。【仪器与试剂】（一）仪器恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅等。（二）试剂上海生工生物工程技术服务有限公司的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒【实验步骤】1将培养好的12mL细菌12,000r离心15s,去上清。加100SolutionI,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。加入200SolutionII，立即上下颠倒510次，使细菌裂解，室温放置2min。加入350Solution

27、III，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置2min。12,000r离心，5min。将步骤5中的上清转移到套放于2.0mL收集管内的UNIQ-10柱中，10,000r室温离心15s。7弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一只收集管中，吸取500ylLWashSolution到UNIQ-10柱，10,000r室温离心30s。8.重复步骤7。9弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一只收集管中，10,000r室温离心30s以彻底去除WashSolution。10.将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5mL离心管中，加50DW（或ElutionBuffer），室温放置2min后，10

28、,000r室温离心1min。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA。九、DNA测序【实验目的】掌握双脱氧链终止法测定DNA序列的原理与方法【实验原理】DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3-OH末端上进行的。由于2,3-双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）的3-位脱氧而失去游离-OH,当它参入到DNA链后，3-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行，分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸

29、（dNTP）底物，其中一种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP（ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP），这样ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同（分子量大小不同）被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。由于：即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分

30、；A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。常用方法有如下3种（其中分析一种测序方法：双脱氧链终止法测定DNA序列）方法1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。差1个核苷酸的ssDNA,从而完成测序的方法。可直读DNA顺序。优点简

31、便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。实验步骤】1单链模板与引物退火用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44阴/mL)。取1.5mL微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10叫10；稀释通用引物2；退火缓冲液2,总体积14。2链延伸/终止反应稀释T7DNA聚合酶：取2叫或4叫冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5(或l)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽吸和排出而混匀，置冰浴中待用。另取4只微量离心管，分别用记号笔标明A”、“G”、“C”和“T

32、”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5分别加入这4只微量离心管中，置37C预温1min以上(说明：4种mix液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于500bp的DNA片段的测序，后者用于50-1000bp片段的测序。一般应用short即可)。标记反应：在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂：模板/引物14(已有)；标记用混合物(1abellingmix)31；已标记混合物(1abelledmix)11,T7DNA聚合酶稀释液21。总体积201。轻轻混匀，简短离心，置室温5min，立即接下步反应。从“标记反应混合物中，分别取4.5加于4只预温的反应液中(注意：每一次转移均应换用新的吸头)，轻轻混匀。简短离心，37C保温5min。向每只离心管中加入5反应终止液，混匀，简短离心。变性反应：在电泳前进行。在上述链延伸反应终止后，最好即时进行变性反应并电泳，如不能及时电泳，终止反应后样品可储于冰浴或4C。另取4只微量离心管，标好“A、“G”、C”和“T”。从上述每一链延长/终止反应的试管中取31，分别加入4只已标号的相应微量离心