利用转基因植物修复汞污染环境的新技术_secret

1、PAGE PAGE 利用转基因植物修复汞污染环境的新技术摘要：随着工业的发展，大量的重金属污染物不断地排放到环境中，造成了日益严重的重金属污染，其中汞污染已成为人类面临的最严重的环境问题之一。 作为植物修复技术的尝试，我们将细菌中的merA、merB、merT、merPHx基因经过序列改造，构建在植物基因表达载体上，转入高等植物烟草中，目的是促进土壤、水体和大气中汞污染物的控制。所获得的转基因植物分别吸收有机态、离子态和气态的汞，并且在植物体内转化其存在形态。通过多基因的联合作用，可以将高毒的有机汞转化为低毒的无机汞，也可以将不同形态的汞以离子态的形式积累在植物中。在营养液中附加不同浓度氯化甲

2、基汞（methylmercury chloride,CH3HgCl）培养大米草，测定汞胁迫对植物生长发育、质膜透性、MDA含量和SOD酶活性的影响。测试结果表明，大米草能够将有机汞转化为无机汞，并且在体内超积累汞。植物对汞污染物的吸收、转化和积累作用为汞污染环境的修复提供了一条新的有效途径。关键词：植物修复，重金属目前，世界许多地区的大气、土壤以及水体中重金属含量已达到致毒水平 （Nriagu 1988,Nriagu和Pacyna 1988）。重金属污染已日益成为威胁人类健康和影响人类生活质量的严重环境问题。自工业革命兴起以来,人类向环境中排放出大量污染物,目前全球每年的重金属排放量以指数级速

3、率增长。以汞为例，据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年有10,000吨汞排放到环境中（Jeanna，2000）。造成环境污染的重金属主要包括镉（Cd）、铬（Cr）、铜（Cu）、铅（Pb）、汞（Hg）、镍（Ni）及锌（Zn）等(USEPA 1997)，其中汞污染已成为人类面临的最严重的环境问题之一。几个世纪以来，由于在化工、造纸、国防、冶金、石油燃料、医药等领域的广泛应用，大量的单质汞（Hg0）及汞离子（Hg2+）以工业“三废”（废气、废液、废渣）的形式排放到环境中。这些毒性相对较小的汞物质在土壤、淤泥中沉积后，被其中的厌氧性还原硫细菌转化为剧毒的甲基汞化合物并在食物链中富集。甲基汞（CH3H

4、g+）极易被食物链传递并具有很强的生物放大效应，例如，经水生生物食物链富集后，顶级消费群中浓度增长可高达百万倍(Elizabeth和Marinus 2000)，但直到19世纪5060年代日本Minamata海湾地区由于甲基汞污染而引起水俣病的流行才引起了人类对其毒性的认识。汞中毒常表现为运动性共济失调、感觉异常、感观紊乱、心血管萎缩等病症并对患者的脑、肾脏及发育的胎儿造成严重的损伤(Raskin和Ensley 2000)。由于汞中毒所引起的损伤是无法治愈的，故而汞污染的治理已刻不容缓。另一方面，我国作为矿业大国，矿业“三废”（废气、废水和废渣）很多，生态环境的损坏非常严重。以贵州万山汞矿为例，

5、自1950年建成投产至1995年45年间，共排放含汞烟尘废气202亿m3，含汞废水5192万t，炼汞炉渣947万t，采矿废石263万t。其“三废”之一废气排放含汞浓度109304 mg/m3，废水含汞0.0911.86 mg/L，废渣含汞0.51.35 mg/kg，平均分别超标5449倍、236倍和214.5倍，通过“三废”形式排放到自然环境中的金属汞含量至少达250 t。境内炼汞炉渣和坑道废石堆积如山，且点多面广，又基本没有任何维护措施，自然堆弃于境内河流源头的沟谷间，在12.5 km2的矿区范围内，堆积体积达20万m3以上的渣堆就有8处，且均在海拔800 m左右处。每遇大雨或暴雨，近500

6、 m的落差使得大量的含汞废水、炉渣、废石进入河道，污染水源和土壤。中国大型矿山联合企业贵州汞矿，经过600余年的开采后，因资源枯竭，企业资不抵债，于2002年破产。我国贵州万山汞矿和陕西旬阳汞锑矿周围的老百姓深受其害，汞毒害的病例逐年增加。群众苦不堪言，怨声载道。贵州万山汞矿是我国众多矿山的缩影，大批矿山废弃地造成的环境污染问题严重地影响人民群众的身体健康，阻碍我国经济和社会的可持续发展，已到了非治理不可的地步了。汞是土壤、水和空气重金属污染的主要元素之一1，它以液态、蒸汽、离子、有机（如甲基汞）和颗粒态多种形态存在。在环境中，汞循环的途径包括物理化学过程和生物学过程。生物学过程在汞化合物的形

7、态转化中起决定性作用。有些细菌将甲基汞转化为离子汞,有些细菌将离子汞转化为单质汞并使之挥发，还有一些细菌将离子汞转化为HgS等沉淀物, 另外一些细菌将金属汞转化为离子汞。汞还能同粘土矿物、腐殖质、金属水合氧化物等结合为颗粒态汞。 从本质上说，汞形态的生物学转化由生物体内的酶和蛋白质来完成的。长期以来，人们试图通过研究污染物的迁移环节（来源、扩散、分布、循环等）和转化环节（形态、反应、归宿等）发现细菌转化汞污染物形态的机制。但是，多种生物因子和环境因子的相互作用和纵横交错妨碍了人们对污染形态转化机制的深入了解，而传统的化学及物理化学方法无法解释由生物体代谢所主导的生态化学过程。人们急需了解控制汞

8、代谢的内在动力和反应机制，包括酶促反应和影响酶促反应的调控机制。基因表达调控网络是生物体控制汞和其它污染物代谢的开关和调节器。近年来，随着分子生物学技术的发展，人们已经从众多细菌中陆续分离出与汞化合物形态转化有关的基因，如汞还原酶基因merA，甲基汞裂解酶基因merB，汞转运蛋白基因merT，金属硫蛋白基因MT。这些基因的发现和克隆为我们清晰、准确地了解汞代谢的生物化学机制创造了基本条件，同时也为汞污染物形态的生物学控制提供了科学基础。merA基因编码汞还原酶（HR），催化离子汞还原为金属汞的生物化学过程。merA基因的表达与否和表达强度直接关系到汞还原酶的有无和多少,而生物体内和介质中汞离子

9、（底物）的状态和含量以及其它环境背景因子都会影响merA基因的表达。这种影响常常以激活或抑制基因表达的方式进行。因此，merA基因表达的调控是汞还原酶酶促反应强度的决定性因素。与merA基因不一样，merT基因所编码的蛋白负责汞离子在细胞内的转运，直接影响生物体内汞离子的积累或富集。merB基因编码有机汞裂解酶的合成，催化甲基汞裂解为离子汞的降解反应。生物体内甲基汞转化为离子汞的过程实际上是甲基汞的修复过程。MerPHx基因是一种汞的氧化酶基因，能够将空气中的单质汞氧化为离子态的汞。虽然merA、merB、merT、merPHx基因的生物学功能已经清楚，但是这些基因在植物体内表达的调控机理及其

10、酶促反应机理还有待研究。植物是土壤中生物链的重要一环，利用植物潜在的修复作用治理已经污染的土壤是污染环境修复的重要方向。正因为如此，人们正在设法发掘重金属超富集的植物。遗憾的是，目前还没有汞超富集植物的报导。因此说，利用植物本身的修复功能对汞污染物进行修复还缺乏必要的物质基础。近年来，有人尝试将 merA或merB基因导入植物，采用基因工程方法创造转基因植物，目的是转化汞的存在形态，修复有机汞或无机汞污染的土壤和水体。Meagher博士领导的研究小组首先在模式植物拟南芥上转移merA和merB基因，获得抗汞和挥发汞的转基因植物4,5。此后，申请者采用人工改造的merA 基因和 merB基因分别

11、转化烟草，获得了高抗汞污染物和离子汞挥发的转基因烟草6。这些转基因植物对汞污染物有非常强的吸收能力，但是，merA 基因和 merB基因是如何调节植物对汞污染物的吸收目前还是一个迷。目前， merA 基因和 merB基因的转基因植物在美国已经进入实用阶段,这是迄今为止重金属植物修复方面最为成功的例子。植物对汞和其它重金属的吸收主要受土壤和本身特性的影响。根际是重金属由土壤进入植物体的主要界面，根际环境中pH和铁锰氧化物、根分泌物、丛枝菌根真菌等有关物质的特性对植物根系吸收重金属有重要影响。揭示重金属在转基因植物根际这一特殊环境中的行为及进入植物体过程的控制机制，并且利用植物本身的特性，定向转化

12、汞污染物的形态，筛选超富集的转基因株系，以研究超积累植物修复汞污染的环境是本项研究的主要方向。转merB基因的烟草植株吸收毒性很大的有机汞，并且将有机汞转化为离子汞；转merA基因的烟草植株大量吸收离子态的汞化合物并转化成金属汞以汞蒸汽的形态挥发。这就带来一个有争议的问题，在用merA转基因植物吸收和降解土壤汞离子时，同时有金属汞的蒸汽挥发到大气中。尽管金属汞的毒性远远低于离子汞和有机汞，由转基因植物释放到大气中的蒸汽汞大大稀释，但是此举仍然会影响大气中汞的含量。为了高效控制环境中的汞污染物但同时防止汞形态转化过程中对大气环境所造成的负面效应，我们设计了一套汞污染物的控制方案：利用merA、m

13、erB转基因植物高效吸收土壤中有机汞和离子汞，并且将有机态的汞转化为离子汞，利用merPHx转基因植物使汽态的金属汞氧化为离子态汞，通过merT基因使汞污染物在植物组织内富集，成为汞的超富集植物。这样，通过超富集植物的大规模种植可以回收土壤、水体和大气中的汞污染物，达到缓解和控制环境中的汞污染。应当看到，人们对汞污染物生物修复的研究和应用还处在初始阶段，在确定汞污染修复途径和开发相关基因生物修复功能时，我们还需要回答许多重要问题：汞污染物在植物和土壤界面的存在形态，merA、merB、merT和MT基因表达的调控机制，基因表达产物-酶或蛋白质之间的相互作用，汞形态转化的酶促反应机理及其生物化学

14、反应，转基因植物控制汞污染的效率，提高汞超富集水平的有效组合。研究和回答上述问题将使我们明确植物控制汞污染物转化的生态化学过程，了解复合污染条件下植物降解汞污染物的机理以及修复新原理，为重金属污染物的植物修复和联合修复提供科学依据。材料和方法)植物材料.试验用烟草（Nicotiana tabacum）品种为革新一号.采用常规方法消毒烟草种子，在 MS培养基上播种.在组织培养条件下获得无菌苗，取25-30 d苗龄的叶片作为遗传转化的受体材料.() 菌种、质粒、工具酶.菌种包括大肠杆菌DH5,农杆菌LBA4404为本实验室保存；质粒R8310为吕玉平博士赠送，实验所用的克隆载体为T-easy(Pr

15、omega公司产品)、pBluescript KS(+)；植物基因表达载体为pJR1.限制性内切酶、修饰酶购自华美生物工程公司.() 引物设计、PCR扩增和载体构建.利用引物设计改造merB基因、merA、merT和merPHx基因的部分序列.在不改变其氨基酸序列的条件下增加A+T的含量. PCR产物克隆在T-easy载体中，随后亚克隆在pBluescript KS(+)质粒中.将基因片段插入pJR1载体中，构建成表达载体.采用冻融法转入根癌农杆菌LBA4404.() 遗传转化.烟草的转化参照叶盘法进行7.将过夜培养的农杆菌离心，菌体用MS液体培养基10倍悬浮.将烟草叶片切成0.50.5cm的

16、小块，放入菌液中浸泡10 min，吸干多余的菌液后平放在MS+6-BA 3mg/L的培养基预培养d.然后转接到分化和筛选培养基（MS+6-BA 3mg/LKm 50 mg/L羧苄青霉素Cb 500mg/L）上，在25下共培养.等芽长到2 cm高时，切下芽并转入生根培养基（1/2 MS+ NAA 1mg/L+ Cb 300mg/L）上进行生根.待根长出后移栽到盆钵内，温室内培养至开花.每个转基因植株标记为一个转基因株系，按每个果实分别收获种子并编号.() 转基因种子的卡那霉素抗性筛选. 从转化植株上收获的种子经表面消毒后播种在含有45 mg/L 卡那霉素(Km)的1/2MS固体培养基上筛选，21

17、天后挑出绿苗移栽于蛭石和珍珠岩的人工土中，使其在人工气候室中生长.()汞抗性的测定.以醋酸苯汞（PMA）代表有机汞.在MS 培养基中加入PMA，配制成不同PMA、HgCl2浓度处理的培养基，将转基因的种子经表面消毒后播种在含汞的MS固体培养基上，在培养室内培养.能够发芽且长出绿色真叶的种子认定为抗性种子，不能萌发或发芽后心叶变白的种子视为不抗的种子.为了确认转基因植株在苗期对汞的抗性，在种有烟草转基因苗的土壤中加入PMA，根据幼苗的生长状况判断其抗性.() Southern 和Northern杂交.CTAB法8提取烟草转化植株总DNA，用EcoRI消化3小时后，在0.7%琼脂糖凝胶上电泳.将D

18、NA转移到尼龙膜（Amersham）上. 用XbaSal双酶切pJR1:merBhe载体，得到，以32p-dCTP为标记物合成探针，在42预杂交4小时， 预杂交缓冲液含有25% 甲酰胺、100 g/ml 变性的鲑精DNA、10 g/ml 酵母RNA、5Denhardts 试剂、50 mmol/L 磷酸钠 (pH6.5)、5SSC 和0.2% SDS.向预杂交缓冲液中加入经过变性的探针，在同样的温度下温育24 h.在室温下用漂洗缓冲液（0.05 mol/L NaH2PO4, 0.05 mol/L Na2HPO4 , 5SSC 和 25% 甲酰胺）漂洗杂交膜，然后在42下用2SSC/0.02% S

19、DS继续漂洗. 滤膜烘干后加增感屏对X光片曝光.从转基因烟草和野生型烟草的叶片中分别提取总RNA，以32p-dCTP为标记的merBhe基因片段为探针进行Northern杂交8，杂交温度为58.结果与分析1转基因烟草对无机汞的转化作用在农杆菌的介导下，采用叶盘法转化，不定芽诱导培养基为MS+6-BA 3 mg/LKm 50 mg/LCb 500 mg/L, 生根培养基为1/2 MS+ NAA 1 mg/L+ Cb 300 mg/L. 在卡那霉素筛选培养基上，转接14天后烟草叶片开始膨胀，增厚，叶缘开始产生皱褶，并有白色的愈伤组织生成.22天后可见芽的分化.此后，一部分再生芽变白而淘汰.培养绿色

20、再生芽至2 cm左右后，进行生根培养，1个月左右根系生长健壮，移栽到温室的盆钵中.本次实验得到120株再生苗，移栽成活86株. 每个转基因植株单独收种、编号.分别将人工改造的MerA（MerApe9）基因导入烟草（Nicotiana tabacum）。Southern杂交和Northern杂交的结果显示，两个基因已分别整合入烟草染色体中，并且得到了表达。MerApe9转基因植物的种子在50M HgCl2的培养基上能够发芽，移栽后能正常的生长，其中10-20%的转基因株系抗HgCl2，其种子在350M HgCl2的培养基上也发芽。与此不同，未转基因的对照种子在50M HgCl2的培养基上没有发芽

21、。利用汞汽测定仪测定植株对汞离子的转化作用，发现转基因植株汽化汞的速率高出对照植株5-8倍，根组织的汞汽化速率远高于叶和茎。这一结果显示，转基因植物的根系是汞汽化的主要部位，汞气不一定要通过维管束组织在叶面上蒸发。根系不仅是汞吸收的场所，同时也是汞汽化的场所。转基因烟草对有机汞的转化作用以质粒R8310为模板，采用上述正反义引物扩增，结果获得长度约为600 bp的PCR产物.将该PCR产物克隆在T-easy载体上，经测序得到与预测序列相同的merBhe基因,其中编码区为576 bp.由于两个引物序列中G+C的含量明显降低，所获得的merBhe基因的编码区更加符合真核生物的序列特征. 用Xba/

22、SalI酶切pBluescript载体，得到merBhe基因的编码序列，以同样的酶切位点插入到pJR1双元载体中，构建成pJR1:merBhe植物基因表达载体.用冻融法将该载体转化到农杆菌LBA4404中.分别从转基因植株的叶片中提取总DNA，以merBhe基因的DNA片段为探针进行杂交，结果在4个DNA样品中有三个转基因植株的DNA样品显示杂交信号. 其中MerBhe-13和MerBhe-14两个转基因植株中merBhe基因为单拷贝插入.从上述两个转基因株系和野生型烟草的叶片中分别提取总RNA，以32p-dCTP标记的merBhe基因片断为探针进行Northern杂交，结果在MerBhe-1

23、3和MerBhe-14两个转基因株系中均出现了杂交带.说明merBhe基因在该株系上得到了表达.由于植物表达载体含有植物选择标记基因NPTII(新霉素磷酸转移酶基因)，利用含卡那霉素的培养基筛选种子，可确定基因转化率和转基因植株.为了解转基因植株抗卡那霉素和抗汞是否同步，我们用含有卡那霉素、汞、卡那霉素+汞三种培养基筛选转基因种子.汞的筛选浓度采用烟草的致死浓度，转merBhe基因种子用PMA 0.5M筛选；卡那霉素的筛选浓度为50 mg/L. MerBhe-13株系的种子群体中，抗卡那霉素和抗汞的比例较高，几乎占所处理种子的2/3；MerBhe-14株系群体中，抗卡那霉素和抗汞的比率较低，还

24、不到所处理种子的1/3.在同时含有卡那霉素和PMA的培养基上，MerBhe-13株系中双抗幼苗的比例接近单抗的比例，而MerBhe-14株系的双抗比例明显低于单抗，说明有些抗卡那霉素的植株并不抗PMA，而有些抗汞的植株并不抗卡那霉素.合同时导入merBhe和NPT基因.当卡那霉素抗性和汞抗性不一致时，最好的解释是，有些转基因植株的merBhe或NPT基因没有表达或表达水平很低.在含有0.5 M PMA的培养基上，野生型的烟草种子没有发芽，而转基因株系MerBhe-13和MerBhe-14的种子发芽情况基本正常，并且能够正常生长. 当PMA浓度提高到1.0M 时,转基因种子虽然能够发芽和生长，但

25、下胚轴和叶片的伸展开始出现异常现象，表现在有些下胚轴短缩和倾斜，叶片变小和扭曲.随着PMA浓度的升高，幼苗生长的异常程度增加.经PMA初步筛选的MerBhe-13幼苗，移栽于盆钵土壤中，用含PMA的营养液浇灌.结果显示，野生型烟草PMA的死亡临界浓度均为0.1M，在此浓度下，幼苗培养5 d后叶片开始发黄并逐渐死亡.与此不同，MerBhe-13幼苗在0.1M PMA的条件下健康生长.随着PMA浓度的增大，生长开始受到不同程度的抑制，表现在叶片数的减少，株高的降低，叶色变黄，根系变小.其中2.0M时，植株的下部叶黄化死亡，但上部叶仍为黄绿色，新叶为淡绿色，可维持生长. PMA 浓度为2.5M时，全

26、部叶黄化，但若在黄化时转入不含PMA的培养基中，经1个星期后，新叶转绿，表明伤害可逆转.3.0M的伤害出现得早，也不可逆.因此，2.5MPMA是MerBhe-13 转基因株系的致死临界浓度，相比未转基因的烟草幼苗，抗汞性提高了25倍.植物对有机汞的转化作用在营养液中附加不同浓度氯化甲基汞（methylmercury chloride,CH3HgCl）培养大米草，测定汞胁迫对植物生长发育、质膜透性、MDA含量和SOD酶活性的影响。测试结果表明，大米草对有机汞耐性的阈值为2mol/L。植株体内同时检测到有机汞和无机汞， 其中47.5%的氯化甲基汞Hg被转化为无机汞，42.5%为有机汞形式存在。无机

27、汞和有机汞较多地分配在根系中，茎叶中无机汞含量为根系的70%，无机汞浓度也仅为根系的37.0%。根系中有机汞含量是茎叶含量的1.33倍，有机汞浓度是茎叶浓度的2.5倍。在汞的形态构成中，根系中无机汞含量与有机汞含量的比例是2.51，茎叶中则为2.31。结果表明，大米草能够将有机汞转化为无机汞，并且在体内超积累汞。有机汞对大米草植株的影响主要表现在植物生长发育、质膜透性、MDA含量和SOD酶活性的改变。随着营养液中有机汞浓度的增加，植株的地下部和地上部干物重都有不同程度的减少，大米草对营养液中的有机汞表现出较强的耐性。有机汞浓度为1mol/L时，植株的形态和生长状况无明显改变；当氯化甲基汞的浓度

28、达到2mol/L时，培养7天的植株表现出轻微的失水萎焉状，当有机汞浓度增加到3mol/L时，培养7天就有明显的失水萎焉状，出现轻微的受害症状，生长减缓，培养14天后心叶呈淡绿色，老叶叶脉间有少量的黄色斑点；生长明显受阻，心叶面积减小，叶缘干枯，老叶均匀黄化。随着有机汞浓度的增加，受害加重，心叶停止生长，老叶逐渐干枯脱落，根系萎缩。4mol/L时地上部和地下部干物重分别只有无汞胁迫时的55.4%和65.7%，叶绿素含量只有无汞胁迫时的58.2%。在含2mol/L 氯化甲基汞的Hoagland营养液中培养7天后，取烟草和大米草各3株测定细胞膜透性（电解质相对外渗率）、MDA 含量和SOD活性。细胞

29、质膜透性增大、细胞内部分电解质外渗是非生物胁迫对植物伤害的主要表现之一。大米草的电解质相对外渗率小于烟草，表明其在PMA胁迫下所受的伤害小于对照。丙二醛（MDA）是常用的膜脂过氧化指标，大米草的MDA含量小于烟草，说明其在PMA胁迫下膜脂过氧化程度小于烟草，受害程度较轻。植物受非生物胁迫伤害，细胞代谢失调，同时，植物也有一些保护和适应机制。保护酶系统就是植物减轻胁迫伤害的机制之一。PMA胁迫下大米草的SOD活性高于烟草，也表明其自身调节胁迫伤害的能力强于烟草。因此，相比烟草，大米草在2mol/L PMA胁迫下的伤害轻，耐性较强。从各有机汞浓度处理间烟草地上部和地下部干物重以及叶片叶绿素含量的差

30、异显著性分析看，1mol/L与2mol/L有机汞浓度处理间差异达极显著水平（p0.01），因此，1mol/L可看作烟草对有机汞的耐性浓度。同理，大米草对有机汞的耐性浓度为2mol/L。大米草在含有1L 2mol/L氯化甲基汞的营养液中培养7天后，营养液的体积变为0.68 L，植株根和茎叶的干重分别为72.5g和136.4g，根冠比为0.53。根、茎叶、营养液中无机汞和有机汞浓度与含量见表2。开始培养时，营养液中的0.4 mg PMAHg是唯一的汞源，经过7天的培养，在营养液和根、茎、叶中不但检出了有机形态的汞，也有无机形态的汞检出。其中有机汞总量为0.17 mg，为开始培养时营养液中汞总量的4

31、2.5%，无机汞总量为0.19 mg，为开始培养时营养液中汞总量的47.5%。尚有0.04 mg未知形态的汞未检出，可能是被培养箱所吸附，也可能是因汞挥发而损失。由于营养液中氯化甲基汞是唯一的汞源，因此，大米草植株体内的无机汞是根系吸收的PMAHg转化而来，即有42.5%的PMAHg被转化为无机汞并分布在植株体内，其中根系中分配25%，茎叶中分配17.5%。可以看出，大米草把大部分的无机汞分配在根系，根系可耐较高浓度的无机汞，而茎叶中无机汞含量仅为根系的70%，无机汞浓度也仅为根系的37.0%。同样，有机汞也是较多地分配在根系中，根系中有机汞含量是茎叶含量的1.33倍，有机汞浓度是茎叶浓度的2

32、.5倍。在汞的形态构成中，根系中无机汞含量与有机汞含量的比例是2.51，茎叶中则为2.31。大米草培养7天后，营养液中也检测到0.03 mg/kg的无机汞，这部分无机汞可能是根系分泌而来。营养液中无机汞含量与有机汞含量的比例是51。讨论植物修复技术(Phytoremediation)是近年来发展起来的一种绿色生态技术，其中利用重金属超富集植物(hyperaccumulator)进行修复是当前环境生物学研究的热点领域，它是经济、有效的污染治理方法9.目前已有Cd、Co、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Zn和As等超富集植物发现的报道，但相对而言植物不易富集汞，目前还没有汞超富集植物的报道.因此，利

33、用汞的天然超富集植物来吸收富集，从而从环境中排除汞的可能性很小.本文通过merBhe的修饰和转移，创造转基因植物，结果得到对有机汞表现高抗作用的转基因系，这些转基因植物可用来吸收和转化污染环境中的有机汞，是汞污染土壤治理的有效途径.在转基因植物体内,merA基因的表达产物具有吸收和挥发离子汞的解毒作用，这一点在转基因拟南芥、北美鹅掌楸和烟草上得到了证实4，6，9-10；与此同时，在转基因拟南芥上merB基因将有机汞转化为无机汞5.然而，merB转基因植物无法使无机汞挥发.要使植物完成有机态的汞到气态汞的挥发，可以有两种选择：一是在该植物中同时导入merA和merB两个基因，二是将merA转基因

34、植株和merB转基因植株杂交，其后代的染色体组同时具有这两个基因.Bizily等人将merA和merB转基因拟南芥作为父母本杂交，所获得的杂交后代同预期的一样能够将有机汞直接转化为气态的单质汞11.到目前为止，大多数汞解毒的研究集中在转基因拟南芥上.由于模式植物拟南芥个体很小，不可能用于大规模的植物修复.要采用植物修复的方法处理土壤和水体中的汞污染，必须采用生物量较大的植物.在这方面，烟草是一种比较理想的植物.野生型的烟草植株由于缺乏外源merB基因，无法有效地转化醋酸苯汞，因此对醋酸苯汞表现出高度的敏感性，转基因烟草之所以对醋酸苯汞表现出抗性，是因为它吸收醋酸苯汞，并且在merB基因表达产物

35、的作用下将有机态的醋酸苯汞（有机汞）转化为离子态的汞.其结果是，植株体内的离子汞浓度增加，植株本身也成为汞离子的超富集载体。在我们的实验中，当醋酸苯汞浓度为0.5 M时，merB转基因烟草的出苗和生长是基本正常的，而野生型烟草不能发芽，说明此浓度下转基因烟草对醋酸苯汞表现出完全的抗性；随着醋酸苯汞浓度的升高，转基因植株虽然能够生长，但受到越来越大的抑制.这是因为，转基因植株体内累积的离子汞不断增多，对植物组织的危害程度逐渐增强.同时因植株吸收醋酸苯汞也使苯环的浓度增加.植物体内的苯环超过一定量后也有可能对生长造成危害.但是，在此类实验中，苯环的危害不是明显的.Bizily等人用甲基汞和醋酸苯汞

36、筛选merB转基因拟南芥，结果发现两者的筛选效果是一致的5.merBhe转基因烟草对醋酸苯汞的抗性高达3.0M，由merBhe基因作用所产生汞离子可以进一步转化为低毒的单质汞，这一过程有赖于merA基因的作用.在此之前，我们已获得merA转基因烟草，其植株对HgCl2的抗性高达350 M，汞离子汽化水平高达400。这些结果表明，mer基因的导入使烟草植株对有机汞和离子汞的抗性分别提高了至少30倍和7倍。将merB和merA基因的作用结合起来，就可以使有机汞直接转化为气态的单质汞。我们准备进行merB转基因烟草和merA转基因烟草的杂交，获得既含有merB 基因又含有merA基因的转基因杂种.这

37、样的烟草杂种既能够将有机态的醋酸苯汞转化为离子态的汞，又能够将离子汞汽化为单质汞，从而更有效地控制重金属汞的污染.参考文献1. Hassett-Sipple B, Swartout J, Schoeny R, Mahaffey KR, Rice GE. Mercury Study Report to Congress: Volume V: Health Effects of Mercury and Mercury Compounds. EPA-452/R-97-007. 1997, U.S. Environmental Protection Agency: Washington, DC. 5:

38、 1-349.2.Harada M. Minamata Disease - Methylmercury Poisoning in Japan Caused by Environmental-Pollution. Crit Rev Toxicol 1995; 25: 1-24.3.Summers AO, Biotransformation of Mercury Compounds, in Reducing Risks from Environmental Chemicals through Biotechnology, G Omenn, Editor. 1988, Plenum Press: New York.Rugh CL, Wilde HD, Stack NM, Thompso