枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化

1、武汉工商学院酶工程技术实训论文学院：环境与生物工程学院专业： 生物工程年级：2014级学生： 学号：指导教师： 职称：题目枯草芽抱杆菌产中性蛋白酶的分离纯化2017年6月18日 TOC o 1-5 h z 摘要1关键词1 HYPERLINK l bookmark7 o Current Document Abstract 1Keywords 11中性蛋白酶2 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 1.1中性蛋白酶的来源2 HYPERLINK l bookmark13 o Current Document 1.2中性蛋白酶的意义2 HYPERLINK

2、l bookmark16 o Current Document 1.3枯草芽孢杆菌2 HYPERLINK l bookmark19 o Current Document 1.4枯草芽孢杆菌的产酶特征2 HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 1.5枯草芽胞杆菌的形态特征3 HYPERLINK l bookmark25 o Current Document 1.6研究目的32实验材料与方法3 HYPERLINK l bookmark28 o Current Document 2.1仪器设备和耗材3 HYPERLINK l bookmark31 o Cu

3、rrent Document 仪器3 HYPERLINK l bookmark34 o Current Document 耗材3 HYPERLINK l bookmark41 o Current Document 2.2枯草芽孢杆菌的筛选4 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 2.3粗酶液的制备4 HYPERLINK l bookmark47 o Current Document 2.4酶的分离纯化42.4.1硫酸铵饱和度的选择4 HYPERLINK l bookmark50 o Current Document 2.4.2蛋白酶活力测定52.4

4、.3透析及层析52.4.4蛋白酶性质的测定53结果与分析63.1蛋白酶活力测定6 HYPERLINK l bookmark53 o Current Document 3.2透析除盐7 HYPERLINK l bookmark56 o Current Document 3.3柱层析分析7 HYPERLINK l bookmark59 o Current Document 3.4 酶作用的最适 pH8 HYPERLINK l bookmark62 o Current Document 3.5金属离子对酶活的影响9 HYPERLINK l bookmark65 o Current Document

5、3.6化学试剂对酶活的影响94结论与讨论10 HYPERLINK l bookmark68 o Current Document 参考文献11枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化摘要中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛用于食品、酿造、医药、纺织、制革 等行业，本文对枯草芽抱杆菌的发酵产酶的提取质量条件进行了研究。利用硫酸铵 分级盐析，葡聚糖层析纯化后蛋白酶总活力为38694U，蛋白酶比活力为 4960.8U/mg。该酶的活力受到EDTA、异丙醇、乙醇抑制。钙离子、镁离子对该酶 有较好的保护作用关键词：枯草芽抱杆菌；中性蛋白酶；葡聚糖层析；分级盐析Extraction quality analysi

6、s of producing neutral protease from Bacillus subtilisAbstractKeywords:Neutral protease as a biological catalyst has widely for food, and brewing, and medicine, and textile, and leather, industry, will enzyme technology application to seafood condiment, hydrolyzed of production in the, can formed en

7、zyme method processing of unique advantages, makes fermentation products production cycle greatly shortened, and improve protein using, for, I on Bacillus subtilis spore Bacillus (Bacillus Substilis) of fermentation produced enzyme of extraction quality conditions for has research.Bacillus subtilis;

8、 neutral protease; Dextran chromatography;fractionation; salting out1中性蛋白酶1.1中性蛋白酶的来源蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛 分布于自然界的植物、动物和微生物中。例如木瓜蛋白酶主要来自于植物木瓜，胰蛋白酶来 自动物的胰腺，来自微生物的蛋白酶没有特定名称，例如有来自AS1.398枯草芽孢杆菌的蛋 白酶，有来自宇佐美曲霉的蛋白酶等等，其中微生物来源的蛋白酶数量与种类最多，也最具 研究、开发与生产价值。随着水解条件之一的pH值的升高，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性 蛋白酶和碱性蛋白酶

9、，这也同时划分了它们应用的领域有所不同。1.2中性蛋白酶的意义中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.07.5之间的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。 中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于生产的，由于其具有催化反应速度快，无工业污染， 催化反应条件适应性宽等性质和优点，被广泛地应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、 毛皮软化等行业错误!未找到引用源。2。生产中性蛋白酶可以从动植物组织中提取，以植物作为蛋白 酶的来源会受到一些诸如气候条件、可利用土地面积的大小等因素的影响，而以动物作为蛋 白酶的来源，其产量的大小主要依赖于可被屠宰牲畜的数量。由于从植物和动物中生产蛋白 酶具有局限性，为了满足当今世界市

10、场的需要，人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上。 本试验所采用的产中性蛋白酶菌株为枯草芽孢杆菌错误!未找到引用源。1.3枯草芽孢杆菌枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土 壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实 验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉 酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆 菌生产a-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重 要菌株。1.4枯草芽孢杆菌的产酶特征利用枯草芽孢杆

11、菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培 养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明 圈直径（旦和菌落直径（C）之比值（H/C）可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而 可筛选出高产酶活的菌株。1.5枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7X23 um，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链， 着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6X11.5um，芽孢中生或近中 生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在 麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。1.

12、6研究目的本次课题研究了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的分离提取过程中的因素影响。2实验材料与方法2.1仪器设备和耗材2.1.1仪器全温振荡培养箱（HZQ-Q东联电子有限公司）、全温振荡培养箱（HZQ-Q东联电子有 限公司）、超净工作台（SW-CJ-IF杭州净化设备公司）、电热压力蒸汽灭菌锅（LDZX-40SBI 上海申安医疗器械厂）、pH测量仪（PHSJ-4A上海精密仪器厂）、DEAE-Sephadex A-50阴离 子交换柱（上海宝曼生物科技有限公司）、SephadexG-100离子交换柱（上海宝曼生物科技有 限公司）、低温离心机（LG10-2.4A北京医用离心机厂）、电子分析天平（FC204上海

13、精密仪 器厂）、100ml锥形瓶、接种铲、小刀、棉塞、报纸、橡皮筋、拇指管、移液枪500ml烧杯、 培养皿。2.1.2耗材（1）固体培养基：牛肉膏 5.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl5.0g、琼脂粉 20.0g、水 1000mL、121Mpa 灭菌 20min， 备用。（2）牛奶平板：在普通肉汤蛋白胨固体培养基中加入最终质量浓度1.5%的牛奶。脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06Mpa,30min），铺平板前再与加热融化的肉汤蛋白胨 培养基混合。（按照1:1混合）液体培养基：牛肉膏 5.0g、蛋白胨 10.0g、NaCl5.0g、水 1000mL、121Mpa 灭菌 20min,备用。发

14、酵培养基玉米粉4%,黄豆饼粉3%,磷酸二氢钠0.4%，磷酸二氢钾0.03%,3mol/L氢氧化钠，调 节PH到9.0,0.1Mpa灭菌20min。250ml三角瓶的装瓶量为50ml。注意事项：玉米粉和黄豆粉不溶于水，培养基的配置过程中加热煮沸、PH调节及分装到 三角瓶等环节注意用玻璃棒不断搅拌，保证培养基均匀一致。筛选培养基：牛肉膏 0.3g，NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂 2.0g，水 100mL，pH7.68.0，0.1MPa 灭菌 30min1。2.2枯草芽孢杆菌的筛选培养：把活化后的枯草芽孢杆菌液在拇指管中分别稀释10-5、10-6、10-7三个浓度，分别 用移液枪吸取10U

15、L到平板上，并用涂布棒涂均匀。放在37C的恒温培养箱中培养24h。初筛：挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落接种到斜面培养基上，放入冰 箱冷藏。复筛：从冰箱中取出初筛得到的菌株，转接试管斜面活化,37C下恒温培养24h.各取1环， 接种到装液量为20mL基础培养基的50mL三角瓶中，在37C条件下摇床培养24h.分别取各菌 株发酵液10 L滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上(直径为12mm)，然后将培养皿放入37C的 培养箱中培养24h，取出后测量水解圈直径与菌落直径.重复此过程3次，取平均值，选取水解圈 直径与菌落直径差值最大的菌落为实验菌种，接种到斜面培养基上备用错误!未找到引用源。2

16、.3粗酶液的制备将斜面30C摇床培养48h后，按照2%接种量接入发酵培养基中，30C、180r/min摇床 培养于30C培养48h。将发酵液8000r/min冷冻4C离心后取上清。即为粗酶液，放入冰箱备 用错误!未找到引用源。2.4酶的分离纯化2.4.1硫酸铵饱和度的选择我们采用盐析法或有机溶液沉淀法来浓缩酶液，同时对酶有提纯作用。取7只25ml锥形 瓶分别加入处理好的酶液20ml，根据硫酸铵溶液饱和度计算表5，在粗酶液添加硫酸铵，分 别使终浓度分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。摇匀在4C条件 下静置过夜，等蛋白析出后用冷冻离心机12000r/min离

17、心20min，经缓冲液透析后测上清液 活力绘制硫酸铵盐析曲线错误!未找到引用源。表2-1硫酸铵盐析标准曲线L-酪氨酸浓度0102030405060吸光度A00.0500.1230.1920.2610.3310.4062.4.2蛋白酶活力测定按部颁行业标准QB1805.3-93，采用Folin法则测定错误!未找到引用源。1ml酶液在一定温度和 pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨酸的量为一个酶活力单位，以U表示。2.4.3透析及层析收集盐析沉淀，用缓冲溶液稀释，然后在透析袋中低温透析，不断更换缓冲液，透析过 程在低温下进行，一方面防止样品降解或变性，一方面也可以防止微生物的生长。每隔10h

18、 换一次溶剂，新的溶剂也要冷却。避免样品变性。用处理好的葡聚糖凝胶层析柱层析，并用 凝胶处理液洗脱，绘制层析曲线，根据曲线收集各个峰，检测峰蛋白有无蛋白酶活性。2.4.4蛋白酶性质的测定将纯化过的蛋白酶收集分别测定该酶的最适pH值、金属离子对该酶的影响、化学试剂 对该酶的影响。3结果与分析3.1蛋白酶活力测定取1ml酶液与40C预热4min的1ml 2%酪蛋白溶液混合，水浴40C条件下反应10min, 再加2ml的0.4mol三氯乙酸终止反应。从水浴中取出静置10min后12000r/min离心20min， 然后吸取上清液1ml加5ml 0.4mol碳酸钠溶液，再加1mlFolin试剂，40C

19、水浴孵化15min， 冷却后于660nm处测定其OD值。对照试验：先向1ml酶液中加入2ml 0.4mol/L三氯乙酸溶 液，然后加入2%酪蛋白溶液，其余步骤同上。以上均重复3次，取其平均值。1ml酶液在一 定温度和pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 ug酪氨酸的量为一个酶活力单位，以U表示。 测量结果见错误!未找到引用源。表3-1蛋白酶酶活力测定硫酸铵饱和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%上清液相对酶活力989588685843303226沉淀相对酶活力2512324257706874根据测定结果，以硫酸铵饱和度为横坐标，酶活为纵坐标，绘制曲线如图3-1。图3-1蛋白酶

20、盐析曲线)*力活酶对相由错误!未找到引用源。可知，酶在硫酸铵饱和度小于30%时，上清液酶活力基本保持不 变，沉淀的相对酶活力也微乎其微，说明硫酸铵饱和度小于30%时，基本上不能析出目的蛋 白；当硫酸铵饱和度在30%70%时，上清液的相对酶活力迅速下降，相反沉淀的酶活力迅速 上升，可知当硫酸铵饱和度在30%70%时目的蛋白被逐渐盐析出来；当硫酸铵饱和度大于70%时上清液和沉淀的酶活力基本上趋于平衡，说明当硫酸铵饱和度大于70%时析出的蛋白 基本上是杂蛋白。综上可知可以先用饱和度为30%硫酸铵盐析去除杂蛋白，然后向上清液中 补加硫酸铵使饱和度到70%进而达到盐析目的蛋白，这样通过分级沉淀可以获得更

21、好的目的 蛋白提取率3.2透析除盐收集发酵上清液，径30%和70%饱和度硫酸铵分级沉淀，离心收集沉淀，溶解于缓冲液 A （0.2mol/L硼酸缓冲液/1mol/L CaCl2/pH7.4）,并用相同缓冲液放在冰箱里保证温度在4C以 下透析除盐。用10% BaCl2溶液来检测是否透析完全。以滤出液滴入BaCl2溶液中无沉淀析 出为终点。在冷冻离心机中（10000rmp，10min，40离心，除去不溶的沉淀物，收集上清 液，测定上清酶活错误!未找到引用源。得到25ml的沉淀透析液，总酶活4.108X105U，总蛋白402g, 比活力1014U/mg。酶液经过沉淀透析过后，活力有所提高，这是由于硫酸

22、铵沉淀除去了一些对酶的活力有 影响的金属离子。3.3柱层析分析将透析脱盐后的粗酶液弃沉淀，上DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱用60mmol/L pH7.2 Tris-Hcl缓冲液及含不同浓度氯化钠的Tris-Hcl缓冲液，进行梯度洗脱，紫外检测器在波长图3-2DEAE-Sephadex A-50柱层析蛋白质含量和酶活力务活酶对相由图3-2可知枯草芽孢杆菌经DEAE-Sephadex A-50柱层析，紫外检测器在波长280nm 处测得3个吸收峰。测定三个吸收峰蛋白质含量和酶活力，可知第一个洗脱峰（920管）和第二个洗脱峰(2135管)基本没有酶活力，酶活力主要集中在第3个洗脱峰(

23、4459管)。将活性峰洗脱液收集，用70%硫酸铵溶液浓缩备用。将DEAE-Sephadex A-50得到的活性组分上SephadexG-100柱进行层析，紫外检测器在波 长280nm处检测吸收峰，测定蛋白质的含量和酶活力。务活酶对相由图3-3可知DEAE-Sephadex A-50得到的活性组分，经SephadexG-100凝胶过滤后共 分离出3个峰，通过酶活检测知道第一个洗脱峰(1027号管)是活性峰，收集酶活性峰后 用70%硫酸铵溶液浓缩，用于酶学性质的研究。3.4酶作用的最适pH以酪蛋白为底物分别采用柠檬酸柠檬酸钠(pH4.06.0),Na2HPO4NaH2PO4(pH 6.57.5),

24、 TrisHCl(pH8.08.5)，硼砂NaOH(pH9.012.0)组成的缓冲系统反应10min,用酪氨酸法测 酶在一系列pH下的活力。表3-2 PH对酶活力的影响PH相对酶活力()45857068578888498010761164根据测定结果，绘制PH对酶活力的图3-4：%步活酶对相由图3-4，可知该酶在pH=7时有最大活性，在pH6-9之间能保证较高活性。3.5金属离子对酶活的影响中性蛋白酶多是金属蛋白酶，其活力收到金属离子的影响，为了测定金属离子对酶活力的影响本文选择了 Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+等几种金属离子进行如下实验取稀释好的酶液，分别加入不同的金属盐使金属离子的浓度为0.001M，测定其活力为见 表表3-3金属离子对酶活力的影响：表3-3金属离子对酶活力的影响金属离子相对活力（）未加任何离子（空白）100.0Ca2+104.3Mg2+100.8Fe2+95.7CU2+66.4由表3-3可以看出Ca2+、Mg2+均对酶有一定的激活作用，而Fe2+和Cu2+对酶有一定的抑 制作用。3.6化学试剂对酶活的影响取稀释过的酶液分别加入不同的化学试剂，测得的酶活见表3-4表3-4化学试剂对酶活的影响金属试剂相对活力（）EDTA17.5异丙醇30.2乙醇26.4磷酸盐缓冲液58.7由表3-4可以得出，EDTA对酶活的抑制作用最强，磷酸盐缓冲液对酶活的抑制性