木质素合成与梨石细胞

1、摘要:从木质素的分类分布，木质素合成过程中相关酶类，木质素研究方法及木质素与梨 果实石细胞形成的关系方面对木质素的研究进展作了综述介绍。并对木质素研究方向作了 展望。关键词：木质素；苯丙氨酸解氨酶；肉桂酸脱氧酶；过氧化物酶；水杨酸The metabolic relationship between Synthesis of lignin-related enzyme and phenolicDong QianwenAbstract： Lignin,which plays an important role in pulping industry, represents 15%36% of dr

2、y weight of wood and is amajor component second to cellulose. Lignin content and its related enzyme activity were highly correlated with plant growth，antidisease ability , adverse resistanceo The lignin in pasture also effect the ability to digest of plant-eating animals. In paper made industry， lig

3、nin dispose was the main source of environmental pollution. This article commented on the studies on the metabolic relationship between Synthesis of lignin-related enzyme such as Phenylalanine ammonia-lyase, Cinnamic acid-enzyme, Peroxidase and and phenolic such as salicylic acid .Also，the prospects

4、 for control the compound of lignin are put forward.Keywords:lignin;Phenylalanine ammonia-lyase(PAL) ; Cinnamicacid-enzyme(CAD);Peroxidase(POD); salicylic acid(SA)前言：木质素(Lignin)是维管植物进化过程中的一种结构产物之一，在细胞壁木质化过程 中，逐步渗入到细胞壁，填充于纤维素构架内，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支 持力或抗压强度,促进机械组织的形成,有利于巩固和支持植物体及水分输导等作用。同 时，由于木质素具不可溶性

5、及多酚类物质的化学特性，也增强了植物的抗病能力；对用作燃 料的木材来说，高木质素含量的木材能释放较多的热量 。木质素是膳食纤维(Dietary fibres,DF)中的.重要组成部分，它能够改变肠道系统中微生物的活性、降低肠运转时间、 降低血中胆固醇和高血糖含量、延缓营养吸收时间、降低结肠、抑制癌细胞活性，甚至具 有维持适当体重的生理和治疗功效。但从另一角度看，木质素对人类生产实践活动产生 一些负面影响，如木质素含量的牧草会影响草食动物的消化；而对造纸用木材来说，木质素 是影响造纸工艺和纸张质量的主要因素之一。因此有关木质素的研究受到许多学者的关 注，现仅就木质素合成相关酶、酚的代谢关系做一介

6、绍。1木质素1.1木质素的种类和分布木质素在木材中是仅次于纤维素的主要成份，是由三种醇单体或单木质酚如香豆醇、 松柏醇和芥子醇等合成的一种复杂的酚类聚合物。通常占木材十重的15%36%,贮存于次生 厚组织中，与植物的硬度和防水作用密切相关。木质素不是单一的结构，而是一组相关联的苯基丙烷单元称为木质素单体(monolignol),通过一定方式聚合一起的总称，是芳香类物质的高聚物，到目前为止尚未有 任何办法能从植物中分离出完全没有变化的原木质素。其单体主要分为：由香豆醇衍生的 对苯基单体(H型)、由松柏醇衍生的愈创木基单体(G型)和由芥子醇衍生的紫丁香基单体 (S型)等三类。H型主要存在于禾本科植

7、物中,S型主要存在于被子植物中,G型则广布于裸 子植物和被子植物中。木质素是属细胞壁的次生结构之一，主要贮存于细胞中，其结构方式和含量依不同的 种类、个体、组织、细胞类型、细胞层以及环境条件而变化的，在垂直分布上木质素含量 随高度的增加而逐渐降低;在径向分布上对针叶树是心材比边材少、秋材比春材少,而在阔 叶树中则没有显著差异。1.2木质素的作用木质素在土壤中降解为腐殖质，有利于改善土壤结构，提高土壤肥力，促进化学肥料 的有效利用，加速植物细胞繁衍，提高植物的生命活动，进一步达到促长、增产的作用。木质素在植物体的形态建成、抗性诱导等方面具有重要的生理功能，开展木质素合成 代谢规律及其调控的研究具

8、有十分重要的理论价值和应用意义。木质素及其生理功能的具体应用涉及到很多方面。利用木质素的抗性功能，可以使羟 自由基、壳聚糖等诱抗剂来诱导木质素的合成，从而提高植物的抗性。利用外源木质素对 植物生长发育的作用，可以制造新型生物肥料。利用生物工程手段生产低木质素含量的树 木，可望从源头解决造纸制浆过程中的工业污染问题。同事同时，利用纸浆中的木质素还 可以生产生物肥料，变废为宝，使治理污染走上良性循环的道路(Connell等，199959)。通过对木质素代谢基因进行调控来改造物种也具有广阔的前景。例如，在饲料生产上， 可以通过转基因手段降低木质素含量，提高饲草的适口性、营养价值和利用率49；在木 材

9、生产上，可以通过转基因等手段来促进木质素的合成，提高木材的质量48；在作物育 种上，可以通过木质素正调控来产生新的种质，提高抗倒伏能力52;在果树生产上，首先 开展不同矮化型果树木质素代谢规律的研究，然后通过基因工程等手段调控木质素合成来 降低树高，这将为果树矮化栽培开辟新的思路。1.3木质素的生物合成途径木质素的生物合成虽然未完全清楚，但经过多年的研究，普遍认为大致可分为3个步 骤：(1)首先是植物光合作用后的同化产物到芳香氨基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等的合成 过程，称为莽草酸途径。(2)其次是从苯丙氨酸到羟基肉桂酸(HCA)及其辅酶A酯类,称为苯 丙酮酸途径。(3)最后是从羟基肉桂基辅酶A

10、酯类到合成木质素单体及其聚合物的过程，称 为木质素合成的特异途径。其中起主要作用和研究重点大都放在苯丙氨酸途径和木质素合 成特异途径这两个阶段。在木质素合成的过程中有很多的酶参与作用，参与第二阶段的苯丙氨酸途径中有：苯 丙氨酸基裂解酶(PAL)、肉桂酸4-羟基裂解酶(C4H)、香豆酸3-羟化酶(C3H)、香豆醇辅酶 A-3-羟化酶(CCoA3H)、咖啡酸5-羟化基阿魏酸0-甲基转移酶(COMT)、咖啡醇辅酶A-0-甲 基转移酶(CCoAOMT)、阿魏酸5-羟化酶(F5H)和4-香豆基辅酶A裂解酶等等。参与第三阶 段的木质素单体合成特异途径的酶主要有:香豆醇辅酶A降解酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(

11、CAD) 两种，但在多途径中还发现了松柏醛5-羟基降解酶(CAld5H)和松柏醛甲基转移酶(AldOMT) 等。最后，在过氧化物酶(peroxi-dase)和漆酶(Laccase)等的催化下,各种木质单体聚合成 为木质素。木质素单体的合成过程是在细胞质中完成的，然后转移到细胞壁中进行脱氢聚合形成 木质素。2木质素合成相关酶和酚的代谢关系2.1木质素合成相关酶的代谢关系木质素单体合成是经过苯丙酸途径开始进行的，首先由葡萄糖发生芳环化反应而形成 莽草酸，然后经过一系列经基化、甲基化与还原反应，生成三种基本结构。整个过程涉 及到许多酶系十分复杂。至今仍未明确其准确的合成途径，但它给我们指明了酶的活性

12、 与木质素前体浓度的关系，证明一些酶系控制着木质素含量变化。根据大量资料和木质素的合成途径来看，苯丙氨酸解氨酶(PAL ),肉桂酸脱氧酶(CAD), 过氧化物酶(POD)三种酶是木质素合成途径中的关键酶类。其中PAL处于苯丙烷类代谢的 起点，与类黄酮物质、黄酮、色素、木质素的合成有关。Taylor等利用白日菊叶肉细胞 诱导出不同分化类型的细胞管状分子。在诱导过程中，细胞壁上伴随有木质化的发生，同 时对木质化形成相关的酶类进行了测定。PAL伴随细胞木质化活性有增强趋势。而CAD 和POD是木质素单体形成过程中的酶，它们的活性变化更能体现木质素代谢的活动情况， 进而说明与之相关的导管分化和抵御病害

13、的防御机制。2.1.1苯丙氨酸解氨酶PAL催化L-苯丙氨酸直接脱氨产生反式肉桂酸，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶叭 此酶自1961年Koukol和Conn发现以来己在所有研究的绿色植物中找到眼11、以13、14、， 在真菌、细菌、藻类中也有发现。细胞中此酶定位于线粒体、白色体、叶绿体、过氧化酶 体、乙醛体等细胞器中。植物的不同组织和不同部位PAL的分布也不同，在萌发5天的黄 化水稻幼苗中，幼叶活性最高，其次为根和胚轴，胚芽鞘的活性很低，而胚乳中未检测到。 丛斌(1997)等us在小麦根尖分生区无法检测到PAL的活性。PAL活性随叶片的成熟度的增 加而降低，越嫩的部位PAL活性越高17。尹德明等

14、18研究水稻感染小球菌核病后，PAL 呈现先上升后下降的趋势，发现植物的抗病性与木质素形成有关。Kchrel和Wiermanlg 应用免疫化学定位法在郁金香花药中PAL主要位于花药绒毡层细胞中。通过硫酸钱分级沉淀、DEAF-纤维素层析、亲和层析等分离纯化步骤，PAL己在马铃薯、 玉米、芥菜、小黄瓜等f 一儿种高等植物中得到纯化，并系统地研究了其基本性质。PAL 的酶蛋白为分子量220000-330000道尔顿的酸性蛋白，其全酶由四个相同亚基组成四聚体 如。PAL的最适PH为8-9.5，水稻PAL最适PH偏碱，这和氨基酸成分一致。Butland等阪 发现班克松(P banksiana Lamb.

15、 ) PAL基因的多个成员(PALL-5)。Fukuda等用分离的 百日草(Zimnia elegans)叶肉单细胞研究了苯丙烷类代谢酶系与木质素形成、管状分子形 成和细胞分化的关系。管状分子与薄壁细胞的区别在于木质化次生壁的加厚，木质素是次 生壁结构材料之一，是木质细胞特有的组成，因此木质化作用可以作为管状分子分化的指 标。朱海英(1997)等23在丝瓜果实发育期间，发现PAL的活性高峰出现在木质素大量合成 的第5天。郑少泉(2001)等M以套袋后的解放钟批把果实为材料，果实中的PAL活性提高， 抑制果锈病的发生，可能与木质素加厚有关。复旦大学课题组在烟草、甜叶菊和丹参组织 培养产生愈伤组织

16、的工作中发现，PAL出现较早，木质素含量增加，随着分化进程的延续， PAL活性降低，在组织老化时甚至失去活性。随着生物技术的不断成熟，PAL的分子生物文章见于报端。Edwards(1985 )等加从豆 刺盘抱菌壁提取物诱导的菜豆获得PALmRNA，构建了 cDNA文库，然后筛选了 14个PAL基 因克隆。测序表明，菜豆至少含有3种PAL基因。Lois(I989)等26也发现皱叶欧芹至少含 有四种PAL基因，结构与菜豆相似。所有PAL基因启动子部位都存在两处AC富含区域， 该区域也存在其它苯丙烷代谢酶系基因中。Whetten (1992)等对火炬松木质部的PAL进行 纯化，利用抗体技术从cDNA

17、文库中得到PAL基因。这些表明PAL是一个多基因家族表达 系统。2.1.2肉桂醇脱氢酶(CAD)CAD是木质素单体形成过程中的酶，它们的活性变化更能体现木质素代谢的活动情况。 葛秀春(2002)等用苯丙噻二(BTH)处理水稻幼苗第3叶后，第3叶及其上位第4叶中CAD 活性显著提高，处理3天后，接种稻瘟病菌，2天内CAD增高更为显著，之后下降。朱海 英等zs发现CAD活性出现在PAL后，催化4 一香豆醛向一香豆醇的反应，形成木质素的 积累和导管的分化oMackay等发现火炬松酶系CAD的突变体，突变体的CAD活性及cadRNA 转录水平很低，而CAD酶作用底物累积水平很高。木材呈棕色(野生型呈白

18、色)，突变体的 木质素含量下降。Baucher等如从毛果杨X美洲黑杨后代中分离出CAD酶的cDNA通过农杆 菌进行有正义和反义转化到欧洲山杨X银白杨中，结果表明，3个反义转化和2个共抑制 的木质部组织CAD活性下降70%，在CAD活性少于60%的品系中，可检测到红色的木质部， 但木质部含量和组成与对照品系相似，并未下降。Halpin等在转基因烟草中使CAD活性 降为野生型的7%，但木质素含量仍未下降，因此，大多数学者认为，在木质素生物合成中， CAD虽然是化木质素前体合成的最后一步的酶，但并非限速步骤，可能极低的内源CAD活 性就能满足植物体木质素合成的需要。然而，在制浆试验表明，虽然抑制CA

19、D没有降低 木质素的含量，但木质素的组成和化学性质发生了改变，有利于脱木质素的制浆化学组成。2.1.3过氧化物酶(POD)PO D是一类血红蛋白，能利用过氧化氢氧化多种氢供体，如酚类，细胞色素c、亚硝 酸盐、抗坏血酸、吲哚、胺以及某些无机离子。过氧化物酶底物的这种广泛性表明了它在 植物体中的多样性。许多实验证明过氧化物酶对植物的生长和发育起着重要作用。木质素是所有维竹组织细胞壁的主要成分，是抵抗病原菌侵入和扩展的重要防卫手 段。过氧化物酶被认为是在木质素生物合成中催化最后一步反应的酶。李宗道32 (1984) 研究结果表明：茎鞘过氧化物酶的活性比叶片低，竺麻叶片过氧化物酶的活性前期低，后 期逐

20、渐升高。不同品种间过氧化物酶活性有显著差异；凤凰青麻、雅麻、黑皮莞等品种细 根的酶活性较高，其纤维支数亦较高，浏阳白麻、湘兰一号酶活性较低，其纤维支数也低。 由此可见，细根中过氧化物酶活性大小与纤维质量有一定的相关性。朱海英(1997)等在丝 瓜果实发育期间，测定PO( I，II , III)的活性，结果表明PO( I，II)与木质化进程有 关PO.同工酶的电泳现象结果显示与木质化进行有关郭清泉(2000)等33、34、胡日生等35在 兰麻收获期测定10个品种的POD及其胶质，经相关性分析，POD的活性与果胶质含量呈负 相关，与总胶质、脂蜡质、水溶物、半纤维素、木质素含量呈正相关，只有POD活

21、性与木 质素含量的相关系数达极显著水平。郭兴启等36对番茄花叶病毒的抗性研究表明POD和PAL 活性值较高，但PAL活性变化与抗性无相关性。抗、感病品种病株过氧化物同工酶都比相 应健株酶带多，且抗性品种比健株多出2条酶带，而感病品种只多出1条酶带。唐明远等 37 (1982)报道过氧化物同工酶在兰麻不同品种之间存在明显差异，酶带种类不同，还有 量的差异。董建华(2000 )等38用6-苄氨基嘌吟预处理花生种子，促进了种子活力指数的 提高，可溶性蛋白和POD活性下降，POD同工酶及可溶性蛋白电泳谱带数及分布无变化。 Jorgen H.C.在白杨树木质部的研究中，分离出5种不同的木质部过氧化物酶，

22、该5种 过氧化物酶均糖基化，分子量为46Kda-54Kda, pI值为3. I-3. 8。其中PXP3-4和PXP5 能氧化木质素单体。由于这些同工酶在木质部中有选地表达，因此，PXP3-4和PXP5被认 为参与木质素的聚合。Monica Qu i ragas在番茄中的研究认为，番茄根系中分离出的5 种过氧化物酶同工酶中，其pI值在3. 6-9. 6范围内显示出最高的催化活性。结合转基 因表达和抗体识别技术，发现pI9. 6是番茄过氧化物酶基因TPX1编码。RNA原位杂交技 术揭示出TPX1的表达控制木质素和木栓质的合成。盐分胁迫可减少木质素和木栓质的合 成，这种胁迫使得TPX1的表达发生改变

23、，并诱导形成TPX1蛋白。因此，他们推断TPX产 物参与木质素和木栓质的合成。2.1.4肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)植物体内通过公共苯丙烷途径而进入木质素特异途径来合成木质素，这条代谢途径涉 及到许多酶的参与，其中肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质 素特异途径的第一个关键酶，可催化3种羟基肉桂酸的CoA酯的还原反应，生成相应的肉 桂醛。CCR是催化木质素特异途径的第一个限速酶(Lacombe et al.,1997)，可能对木质 素生物合成途径的碳流具有潜在的调控作用。自1972年以来，科学家们逐步推断并证明了 CCR参与木质素的生物合成，并从连

24、翘属、 大豆等植物中纯化了 CCR，研究了有关酶学性质。随着分离纯化的方法不断完善，除连翘 和大豆外，现已成功地从白杨(Sarni et al.,1984)、桉树(Goffner et al.,1999)等多 种植物中分离纯化得到CCR。关于植物器官和组织中CCR的分布特点的系统研究不多，在 桉树上发现CCR主要分布在木质部、厚壁组织中(Sarni et al.,1984)。Piquemal等(1998)通过降低烟草中CCR的含量，结果表明转基因烟草的木质素无论 是数量和质量上均发生了改变，木质素含量大幅度下降。Chabannes等研究表明，讲反义 CCR基因转入烟草中，木质素含量降低，CCR

25、基因表达受到抑制。Chabannes等在烟草中分 别就爱你工地CCR和CAD的表达，证明尽管反义CAD基因转入烟草中降低了 CAD的表达， 但烟草细胞壁中的木质素含量并没有降低，只是合成木质素单体的各种成分有所变化，烟 草表现正常的生长。而反义CCR基因转入烟草后在降低了 CCR基因的表达的烟草中，细胞 壁木质素含量明显降低，植株比正常烟草矮小，如果把反义CCR基因的副本烟草与转入了 反义CAD基因的木本烟草进行杂交，子代烟草中的木质素含量明显的降低，烟草也表现正 常的生长。Goujon等(2003)构建一个拟南芥CCR基因全长cDNA的反义表达载体，通过 遗传转化抑制拟南芥的AtCCRl基因

26、的表达，拟南芥的表现型发生了很大变化，植株比野 生型矮小，木质素降低了 50%，木质素的结构和成分也发生了变化，显微观察发现细胞壁 填充不紧。大多数研究结果表明，如果CCR的活性受到影响，肉桂酰辅酶A酯转化成相应 的醛就受到影响，并影响木质素的生物合成。Hepworth和Vincent(1998)通过调节烟草茎 中的CCR含量，表明烟草的细胞壁中的维管束受到了很大的影响。Jones等(2001)研究 了 CCR突变的拟南芥植株，结果表明木质素的含量大约减少了 50%，突变植株更不易承受 机械压力，与细胞壁中缺少木质素的支持有关。综合国内外近年来的研究结果可以看出CCR 在木质素单体的一个重要关

27、键酶主导木质素的生物合成，而CAD这类酶也许起着协同作用， 辅助调节木质素的生物合成。2.2木质素合成相关酚的代谢关系酚类物质是合成木质素的前体，其含量和种类对木质素合成有重要影响，酚类物质自 身的氧化交联和形成的二聚体也可使细胞壁增厚，促进植物组织木质化is。Zarra等认为 植物组织木质化的生物化学机制是由于酚类物质与多糖残基的氧化交联造成的留。刘国强 等4研认为酚类物质是木质素合成的前体物质，贮藏果实中酚类物质参与木质素的合成，导 致酚类物质含量下降而木质素含量上升。肉桂酸、咖啡酸和香豆酸是参与苯丙烷类代谢途 径中木质素合成的3种主要酚类物质。水杨酸(salicylic acid，SA)

28、是植物体激素，为酚类物质，对一些重要的代谢起调控 作用。用SA处理黄瓜叶片，促进叶片POD活性迅速升高尊。水稻幼苗用SA处理后，迅速提 高PAI和与木质素合成有关的各种POD的活性，快速大量合成木质素使组织木质化。王媛 等在SA诱导拟南芥抗灰霉病的过程中，发现通过PAI和POD活性的提高进而引起木质素 含量的增加，是诱导拟南芥产生抗性的机制之一。在逆境胁迫中,植物会合成水杨酸等，并 传递到植物的各个部位产生系统获得抗性，使植物体内的抗病因子被激活,木质素合成关 键酶PAL活性上升,加速植物体内木质素的积累耶。3木质素研究的趋势木质素的生物合成是多条途径，途径间还存在相互交叉和替换的；参与的生物

29、酶系很多, 不同酶系之间有多种相互作用，其个体和种群间的遗传变异和环境因素等都对木质素含量 的变异有不同程度的影响。通过转基因技术调控植物木质素含量与组分，该项研究在国际上已成为热点，且木质 素生物合成途径的基础研究也日新月异，而我国尚属空白。木质素具有多种重要生物功能，决定了其合成酶基因表达方式与表达部位的多样性， 因此使该领域研究更为艰难和复杂。揭示木质素单体合成途径的基本轮廓已30多年，然 而其中许多细节至今尚未清楚，如木质素单体的完整合成途径、储存部位、如何被运输全 细胞壁及如何聚合成木质素大分子等。目前还有很多环节尚未清楚,但显然木质素合成是受多基因控制。利用基因工程技术对 某些酶系

30、如PAL, C4H, 4CL, CAD和CCR等进行改造，在一定程度上可以降低木质素含量。 目前已克隆到并用于基因工程的主要有PAL、C4H、4CL、CCR、CAD、COMT等十多个，表达 显示在降低木质素的含量上有很大差异。木质素含量研究中所使用的转基因植株尚处于小 苗阶段，还未有成林的田间试验作稳定性评估。所以在常规育种的基础上，有必要继续针对 木质素生物合成有关性状开展分子标记的研究。参考文献：付伟，廖祥儒,王俊峰，等.植物体内的木质素J.生物学通报,2004,39(2).陈永忠，谭晓风，David Clapham.木质素生物合成及其基因调控研究综述J.江西农业大学学 报，2003,25

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