53种常见缓冲液配制方法及胶体金试剂资料

1、53种常见缓冲液配制方法乙醇一醋酸铵缓冲液(pH3.7)取5mol/L醋酸溶液15.0ml,加乙醇60ml和水20ml，用10mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000ml，即得。三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)取三羟甲基氨基甲烷12.14g,加水800ml,搅拌溶解，并稀释至1000ml，用6mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0，即得。三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)取氯化钙0.294g,加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40ml使溶解，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100ml，即得。三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)取三羟甲基氨基甲烷6

2、.06g,加盐酸赖氨酸3.65g、氯化钠5.8g.乙二胺四醋酸二钠0.37g,再加水溶解使成1000ml,调节pH值至9.0,即得。乌洛托品缓冲液取乌洛托品75g,加水溶解后，加浓氨溶液4.2ml,再用水稀释至250ml,即得。巴比妥缓冲液(pH7.4)取巴比妥钠4.42g,加水使溶解并稀释至400ml,用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4,滤过，即得。巴比妥缓冲液(pH8.6)取巴比妥5.52g与巴比妥钠30.9g,加水使溶解成2000ml,即得。巴比妥一氯化钠缓冲液(pH7.8)取巴比妥钠5.05g,加氯化钠3.7g及水适量使溶解，另取明胶0.5g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。然

3、后用0.2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500ml,即得。甲酸钠缓冲液(pH3.3)取2mol/L甲酸溶液25ml，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75ml，用水稀释至200ml,调节pH值至3.253.30，即得。邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6)取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900ml,搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6,加水稀释至1000ml,混匀，即得。枸橼酸盐缓冲液取枸橼酸4.2g,加1mol/L的20%乙醇制氢氧化钠溶液40ml使溶解，再用20%乙醇稀释至100ml,即得。枸橼酸盐缓冲液(pH6

4、.2)取2.1%枸橼酸水溶液，用50%氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，即得。枸橼酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)甲液：取枸橼酸21g或无水枸橼酸19.2g,加水使溶解成1000ml,置冰箱内保存。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液61.45ml与乙液38.55ml混合，摇匀，即得。氨一氯化铵缓冲液(pH8.0)取氯化铵1.07g，加水使溶解成100ml，再加稀氨溶液(1-30)调节pH值至8.0，即得。氨一氯化铵缓冲液(pH10.0)取氯化铵5.4g,加水20ml溶解后，加浓氯溶液35ml，再加水稀释至100ml，即得。硼砂一氯化钙缓冲液(pH8.0)取硼砂

5、0.572g与氯化钙2.94g，加水约800ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液约2.5ml调节pH值至8.0，加水稀释至1000ml,即得。硼砂一碳酸钠缓冲液(pH10.811.2)取无水碳酸钠5.30g,加水使溶解成1000ml；另取硼砂1.91g，加水使溶解成100ml。临用前取碳酸钠溶液973ml与硼砂溶液27ml,混匀，即得。硼酸一氯化钾缓冲液(pH9.0)取硼酸3.09g,加0.1mol/L氯化钾溶液500ml使溶解，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液210ml,即得。醋酸盐缓冲液(pH3.5)取醋酸铵25g,加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml,用2mol/L盐酸溶液或

6、5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5(电位法指示)，用水稀释至100ml,即得。醋酸一锂盐缓冲液(pH3.0)取冰醋酸50ml,加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH值至3.0,再加水稀释至1000ml,即得。醋酸一醋酸钠缓冲液(pH3.6)取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20ml，再加水稀释至250ml,即得。醋酸一醋酸钠缓冲液(pH3.7)取无水醋酸钠20g,加水300ml溶解后，加溴酚蓝指示液1ml及冰醋酸6080ml,至溶液从蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至1000ml,即得。醋酸一醋酸钠缓冲液(pH3.8)取2mol/L醋酸钠溶液13ml与2mol/L醋酸溶液87ml,加每1ml含铜1

7、mg的硫酸铜溶液0.5ml,再加水稀释至1000ml,即得。醋酸一醋酸钠缓冲液(pH4.5)取醋酸钠18g，加冰醋酸9.8ml，再加水稀释至1000ml,即得。醋酸一醋酸钠缓冲液(pH4.6)取醋酸钠5.4g,加水50ml使溶解，用冰醋酸调节pH值至4.6,再加水稀释至100ml,即得。醋酸一醋酸钠缓冲液(pH6.0)取醋酸钠54.6g,加1mol/L醋酸溶液20ml溶解后，加水稀释至500ml,即得。醋酸一醋酸钾缓冲液(pH4.3)取醋酸钾14g,加冰醋酸20.5ml,再加水稀释至1000ml,即得。醋酸一醋酸铵缓冲液(pH4.5)取醋酸铵7.7g,加水50ml溶解后，加冰醋酸6ml与适量的

8、水使成100ml,即得。醋酸一醋酸铵缓冲液(pH6.0)取醋酸铵100g,加水300ml使溶解，加冰醋酸7ml,摇匀，即得。磷酸一三乙胺缓冲液取磷酸约4ml与三乙胺约7ml,加50%甲醇稀释至1000ml,用磷酸调节pH值至3.2,即得。磷酸盐缓冲液取磷酸二氢钠38.0g,与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml，即得。磷酸盐缓冲液(pH2.0)甲液:取磷酸16.6ml,加水至1000ml,摇匀。乙液:取磷酸氢二钠71.63g,加水使溶解成1000ml。取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合，摇匀，即得。磷酸盐缓冲液(pH2.5)取磷酸二氢钾100g,加水800ml,用盐酸调节pH至

9、2.5,用水稀释至1000ml。磷酸盐缓冲液(pH5.0)取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量，用氢氧化钠试液调节pH值至5.0,即得。磷酸盐缓冲液(pH5.8)取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml,即得。磷酸盐缓冲液(pH6.5)取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml,用水稀释至100ml,即得。磷酸盐缓冲液(pH6.6)取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g,加水使溶解成400ml,即得。磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值

10、至6.8；另取胰酶10g,加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，即得。磷酸盐缓冲液(pH6.8)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。磷酸盐缓冲液(pH7.0)取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml,用水稀释至100ml，即得。磷酸盐缓冲液(pH7.2)取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液50ml与0.2mol/L氢氧化钠溶液35ml，加新沸过的冷水稀释至200ml，摇匀，即得。磷酸盐缓冲液(pH7.3)取磷酸氢二钠1.9734g与磷酸二氢钾0.2245g,加水使溶解成1

11、000ml，调节pH值至7.3，即得。磷酸盐缓冲液(pH7.4)取磷酸二氢钾1.36g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml,用水稀释至200ml,即得。磷酸盐缓冲液(pH7.6)取磷酸二氢钾27.22g,加水使溶解成1000ml,取50ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml,再加水稀释至200ml,即得。磷酸盐缓冲液(pH7.8)甲液：取磷酸氢二钠35.9g,加水溶解，并稀释至500ml。乙液：取磷酸二氢钠2.76g,加水溶解，并稀释至100ml。取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合，摇匀，即得。磷酸盐缓冲液(pH7.88.0)取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g,

12、加水使溶解成1000ml,即得。体外诊断试剂生产实施细则第五十三条规定：应当对每批产品中关键物料进行物料平衡核查。如有显著差异，必须查明原因，在得出合理解释，确认无潜在质量事故后，方可按正常产品处理。新版药品生产质量管理规范(二次征求意见稿)第一百八十八条规定：每批产品应检查产量和物料平衡，确保物料平衡符合设定的限度。如有差异，必须查明原因，在得出合理解释、确认无潜在质量风险后，方可按正常产品处理。第二百一十五条规定：在物料平衡检查中，发现待包装产品、印刷包装材料以及成品数量有显著差异或异常时，应进行调查，未得到合理解释前，成品不得放行。规范中多处提到物料平衡的处理，其重要性可见一斑。物料平衡

13、（massbalance,materialsbalance,reconciliation）:产品或物料实际产量或实际用量及收集到的损耗之和与理论产量或理论用量之间的比较，并适当考虑可允许的正常偏差范围。物料平衡的计算：产出量/理论量*100%（产出量=产出合格品量+废弃量+取样量）收率的计算：产出的合格品量/理论量*100%。二者区别：1.物料平衡与收率均以理论量作为基数，即计算的分母，差别在于物料平衡的计算分子不仅包含了合格品量，还有废弃量与取样量，而收率的分子仅是合格品量，相信大家不难理解。2理论上，收率可以100%;而物料平衡W100%。而在实际生产中：收率大多情况下V100%（100%

14、投料，不低限投料。），如果装量、含量同时在合格范围又偏下限的话，收率超过100%很有可能。物料平衡W100%。（涉及到印字包材时必须为100%）。特殊情况下，物料平衡也会100%，比如物料在车间出现引湿增重时。而在生产中必须注意收率和物料平衡的范围，一般设定为98%100.5%（根据验证及多批生产数据而得）合理性，这才是最关键的。3.物料平衡是GMP要解决是否有混药和差错的质量问题，是防止混药和差错的一项重要举措，而收率是企业生产成本的经济问题。选取不少于二家同类产品。要求该产品生产企业是目前国内市场中普遍认可的品牌，以其中最宽线性范围为基础，并征求专家意见，然后确定本公司该产品的线性范围。同

15、类产品的相关指标为：北京九强：250umol/L四川迈克：350umol/L取50ml容量瓶10个，500ml容量瓶1个，取基础液30ml于容量瓶中；准确称取相当于50umol的超纯品Hey,加入至小烧杯中溶解混匀，溶液倒入容量瓶内，反复用基础液冲洗小烧杯3次，洗液倒入容量瓶内。用基础液稀释定容至500ml,即得含量为100umol/L的Hey溶液。将该溶液用基础液分别稀释至60umol/L、55umol/L、50umol/L、45umol/L、40umol/L、30umol/L、20umol/L、10umol/L、5umol/L、2.5umol/L。c.将以上配制的各不同浓度的标准品分别平行

16、检测四次，对检测数据进行离群值计算，测定结果大于G值G0.05=1.426的数据进行剔除，测定结果小于G值G0.05=1.426的数据进行保留，将准确度大于20%的浓度值予以舍弃。以真值为X轴，测定值为Y轴，做标准曲线，舍弃明显偏离直线趋势的数据，取线性良好直线段求得线性回归方程，稀释浓度（Xi）代入求出线性回归方程，计算Yi的估计值及Yi与估计值的相对偏差。线性偏差大于15%则认为超出线性范围。本文来自：医药社区（）详细出处参考：http：/redirect.php?fid=177&tid=55347&goto二nextoldset酶联免疫吸附测定的操作要点本文来自：医药社区（）详细出处参考

17、：http：/ HYPERLINK /redirect.php?fid=177&tid=15076&goto=nextoldset /redirect.php?fid=177&tid=15076&goto=nextoldset1标本的采取和保存可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自

18、然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4C,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈

19、振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。试剂的准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。3加样在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产

20、生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。4保温在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育（incubation）,有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结

21、合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有43C、37C、室温和4C（冰箱温度）等。37C是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37C经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43*进

22、行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4*更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）设计方案1产品概述、处方及规格1.1产品概述本试剂通过测定人体液中同型半胱氨酸（Hey）的浓度，主要是用于诊断心肌功能疾病。产品测定原理：同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌吟，氨在谷氨酸脱氢酶的作用

23、下，使B-烟酰胺腺嘌吟二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+,样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。1.2产品处方试剂为液体双试剂。校准品可使用朗道、罗氏等复合定标液。1.2.2产品所用主要原材料为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、B-烟酰胺腺嘌吟二核苷酸还原性（NADH）、三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP）、a-酮戊二酸、Hey甲基转移酶（HMTase）、谷氨酸脱氢酶（GLDH）S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶及腺苷脱氨酶（ADA）等。根据文献资料选用适当的缓冲液和稳定剂。1.3产品规格产品包装规格制定要考虑不同适用机型和不同客户需求，根据以往经验，拟制定规格：R1-8ml、R2

24、-2ml；R1-16ml、R2-4ml；R1-20ml、R2-5ml；R1-32ml、R2-8ml；Rl-40ml、R2-10ml；R1-2X40ml、R2-2X10ml；R1-4X40ml、R2-4X10ml；R1-2X40ml、R2-20ml；R1-4X40ml、R2-2X20ml；R1-8X40ml、R2-8X10ml；Rl-80ml、R2-20ml；R1-2X80ml、R2-2X20ml；Rl-4X80ml、R2-4X20ml；Rl-8X80ml、R2-8X20ml；Rl-60ml、R2T5ml；R1-2X60ml、R2-2X15ml；R1-3X60ml、R2-3X15ml；R1-8X

25、50ml、R2-2X50ml；R1-6X70ml、R2-3X35ml；R1-5X40ml、R2-50ml；R1-4X50ml、R2-50ml；R1-3X60ml、R2-45ml；R1-8X20ml、R2-8X5ml。2产品质量标准根据临床化学体外诊断试剂（盒）通用技术要求，应对试剂外观、净含量、试剂空白、灵敏度、准确度、批内精密性、批间精密性、线性范围和稳定性等做出要求和规定。应参考已上市产品并满足临床使用要求。2.1外观Rl、R2均为无色至浅黄色透明液体。2.2净含量不少于标示值。2.3试剂空白2.3.1试剂空白吸光度变化率以蒸馏水为检测样本时，每分钟吸光度变化值（A/min）的绝对值应不大

26、于0.100A。2.3.2试剂空白吸光度以蒸馏水为检测样本时，吸光度应不小于0.800A。2.4准确度以质控血清（如Roche公司生产的质控血清）为检测样本时，测定值在质控血清规定的可接受范围内。或用比对试验，相关系数r0.975,每个浓度点的相对偏差RW20%。2.5线性范围Hcy试剂在线性范围0-50umol/L内，a）回归系数r应不小于0.990；b）线性偏差应不大于15%。2.6分析灵敏度Hcy含量为10umol/L时，测定吸光度变化率（减掉试剂空白吸光度变化率）A0.002Abs/min。重复性测量精密度同一个试剂盒分别测定高低两个样本值所得的结果，变异系数CVW8.0%。2.7.2

27、批间差连续三批生产的不同批号的试剂测定同一样本，相对偏差RW20%。稳定性Hey试剂贮存于2-8、避光环境中，有效期为12个月。研制要求对试剂所用原料进行选择，试剂配方进行优化，确定所用原料的浓度，在保证产品质量的前提下尽量降低成本。对反应体系进行研究，选择最佳加样方案，兼顾反应的灵敏度和线性范围，并适合在全自动生化分析仪上应用。对生产工艺进行研究，以使研制的产品能够顺利进入生产程序。对试剂的分析性能进行评估，对产品质量标准中的各项进行实验评价并确定最终要求，据此拟定注册产品标准。实验确定该项目的正常参考值。稳定性研究：试制至少三批样品，在实际储存条件下保存至成品有效期后，检测各项性能指标是否

28、仍能达到产品质量标准的要求。进行临床研究，确定临床适用性和符合性。生产工艺流程（见附页）生产过程及工艺条件称量根据产品处方计算待配溶液所需各试剂成分量，用适当的称、量工具按顺序依次准确称量或量取各试剂成分。称量过程要求控制称量试剂成分的正确性和精确性，需根据所要称、量试剂的量选用适当的称、量工具。称量过程应有复核人复核。5.1.2配制在配液桶中加入预定体积90%左右的纯化水，然后依次加入准确称量的各试剂成分，注意在加入下一成分前，之前加入的试剂成分要已搅拌溶解。所有试剂成分加完并溶解后，用纯化水定容至预定体积。5.1.3过滤试剂配制完成后，用WIOum孔径的滤膜过滤。根据液量多少，可采用蠕动泵

29、过滤，液量过少时采用针头过滤器过滤。为减少酶或其他较大分子生物成分损失，可在加入这些成分之前进行过滤。过滤过程要避免溶液受污染，与溶液接触的器具应尽量专用，不能专用应保证洗涤彻底，以免造成试剂间的交叉污染。5.1.4配液检验配制完成的液体静置2小时以上，即可通知质检部取样进行性能检测，检测合格的试剂方可进入分装程序。如配液量很少，配制后即分装，此步检验可省却。分装可用蠕动泵调整液量后分装，也可采用称重法、量取体积法分装。装量控制分装程序要求对装量进行控制，不得低于标示装量。分装过程中对装量进行抽检，为避免损失溶液和增加污染机会，建议采用称重法进行装量检验。分装后检验分装完成后，通知质检部取样检

30、验。检验合格的试剂方可进入下一生产程序。如分装和包装程序连续进行，在溶液配制后已进行检验的前提下，此步检验可省却。5.3组装5.3.1组装程序领取半成品、包装盒、瓶签、盒签、说明书。标签打印在通用瓶签和盒签上打印相应内容：瓶签在绿色区域内打印产品名称和半成品规格；盒签在绿色区域内打印产品名称和试剂盒包装规格，并将注册号和产品注册标准部分打印完整。贴签瓶签贴到半成品瓶身指定位置，端正、居中；盒签贴于包装盒正面，端正，居中。叠说明书将说明书横向对折两次后再纵向对折一次，折好后的说明书边缘应整齐。装盒将包装盒折好，依次放入半成品组分和说明书，各组分位置应整齐有序。成品检验试剂组装好后，通知质检部抽样

31、检验。质检部检验合格后按批生产量发合格证给生产部，生产部将合格证贴于包装盒指定位置，即可进行成品入库。主要设备一览表序号设备名称设备型号生产厂家生产能力1电子分析天平AL104梅特勒-托利多称量范围:0.01g-110g；精度等级0.01gAR114电子天平DT-1000奥豪斯中国地区称量范围：0gT00g;精度等级0.0001g蠕动泵BT300-1F保定兰格恒流泵有限公司最大分配次数999次;分配液量0.1ml-99.9L标签打印机Cl408e/412eSATOAmericaInc300m走行半自动生化分析仪Microlab300荷兰威图科学公司/适用的法律、法规体外诊断试剂注册管理办法（试

32、行）体外诊断试剂注册申报资料形式要求体外诊断试剂质量管理体系考核范围有效覆盖判定原则及认定程序体外诊断试剂研制情况现场核查要求体外诊断试剂说明书编写指导原则医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定体外诊断试剂临床研究技术指导原则体外生物诊断试剂申报技术要求关键词：环境化学分析标准物质煤炭石油成分分析和物理特性测量标准物质工程技术特性测量标准物质物理特性与物理化学特性测量标准物质土壤标准物质1、酶联免疫试剂盒首先要说明反应原理。提供原材料的选择及质控要求：围绕反应原理，说明主要原材料的来源、研制过程、质控方法等。提供生产工艺确定的试验资料：包括酶标板的选择；包被条件的确定；封闭条件的确定，酶标抗体

33、/抗原的制备，显色条件的确定，反应时间的选择，一步法/二步法的选择（二者比较），加样量的确定，各种配套液体的配制等等。说明阴、阳性对照血清的选择，制备。提供临界值（Cutoff）值确定的试验资料。一般选择大于400人份正常人样本进行测定，求出均值（x）和标准差（SD）,给出全部的结果和分布图，一般Cutoff=x+35SD,保证99.9%阴性在Cutoff值以下，Cutoff值一般与阴、阳性对照联系起来，每次试验采用x阴+系数或x阳系数，其中阳性对照均值对试验室条件反应灵敏，所以其吸收度（A）值控制比较严格。Cutoff值确定以后，还要对已知的阴、阳性标本进行检测，验证其正确性。说明质控标准的

34、建立：一般包括敏感性、特异性、精密度等指标。定性试剂盒：敏感性质控品一般10份左右，确证为阳性，A值应包括高、中、低浓度的质控品；特异性质控品一般1020份左右，除正常人标本外，还应有相关疾病，可能引起交叉反应的样本，说明A值范围；精密度：不能是强阳性标本，以A值接近Cutoff值为宜，测定10次，变异系数（CV）V15%。定量试剂盒：标准品、标准曲线需标化，要有高、低值质控品。提供与国内外同类产品进行比较的试验资料。2、肢体金试剂首先要说明反应原理。提供原材料的选择及质控要求（同酶联免疫法试剂盒）。要对检测线、质控线加以说明。提供生产工艺确定的试验资料：包括膜的选择，说明孔径，吸水速度；胶体

35、金颗粒大小的确定；包被条件的的确定；金标记的条件及质控要求；各种配套液体的配制；生产工艺流程图；生产条件的要求等。说明质控标准的建立：包括物理形状（外观，条宽大于3mm）,灵敏度，特异性，显色时间（515min）,显色均匀性等。提供干扰试验资料。稳定性研究及研制报告需提供照片。提供与国内外同类产品进行比较的试验资料。3、体外核酸扩增（PCR）试剂盒PCR试剂盒是模拟体内DNA复制过程，体外在聚合酶作用下，进行特定DNA片段的复制，达到检测的目的。申报此类产品的技术要求如下：说明病原体靶核酸序列的选择依据。包括靶核酸序列的长度、序列、内切酶图谱及所处基因组位置等特点。选择单个或多个靶序列的理由及

36、靶序列的保守性和特异性。说明核酸引物和探针的特性。核苷酸碱基数，G+C百分比，碱基序列；制备方法，纯化方法，纯度，260nm和280nm吸收度比值；引物内部二级结构和末端互补情况，3端要避免碱基配对（避免6对以上连续碱基配对）；用于捕获和测定目的的连接物。提供扩增条件确定的试验资料：包括酶的来源、性质，扩增时间、温度、循环次数，核酸模板用量，终止反应的方法等。对扩增产物应进行测序，比较其正确性。说明扩增体系防污染的措施：应提供使用方法和有效性的数据。说明对标本的要求及DNA/RNA的提取方法：提供提取效率的试验资料。提供对扩增产物进行检测的方法学研究资料：目前一般采用荧光法、酶免法、膜杂交法进

37、行检测。说明3个对照品的确定及制备：包括强阳性，临界阳性，阴性对照。注意提供灭活的方法。说明临界值及灰区确定的试验依据。说明质控标准的建立：定性试剂盒：检测灵敏度必须明确，并提供特异性，精密度等指标的确定资料。定量试剂盒：要包括标准曲线，高、低值质控品确定的资料。提供与国内外同类产品进行比较的试验资料。4、基因重组抗原随着科学技术的发展，今天人们已经能够确定和获得许多病原体天然活性蛋白的编码基因，将其插入表达载体，引入宿主细胞后，有效地表达该基因产物，经分离、纯化，成为病原体检测试剂盒的原材料基因重组抗原。申报此类原材料的技术要求如下：提供病原体基因序列，说明所选择的抗原片断所处基因组的位置和

38、选择理由。提供表达载体的资料：包括基因的来源、克隆情况、内切酶图谱，表达载体的构建、结构等及宿主细胞的名称。提供插入基因的核苷酸序列（及推导的氨基酸序列）分析资料，提供测序的原始结果。说明表达所采用的方法及表达水平。提供生产过程的试验资料：包括主细胞库和生产细胞库的建立，工程细胞传代稳定性，目的产物提取及纯化工艺研究资料，3批产品的制检记录。提供终产品的质控标准及检定资料：包括纯度，相对分子质量，免疫活性（抗原性）检测，蛋白质浓度等等。纯度及相对分子质量的测定一般选择SDS-PAGF电泳方法（还原条件），要有适宜的Marker和扫描结果。纯度一般要求大于90；纯度检测上样量要大于5g。5、单克

39、隆抗体单克隆抗体作为试剂盒的原材料需提供下列资料：提供杂交瘤细胞的试验资料。亲本细胞试验应说明骨髓瘤细胞，免疫亲代细胞和免疫原（说明来源、鉴定、免疫剂量、注射方法、部位、次数，测效价的方法和结果）等。细胞融合试验应说明简单的步骤、次数、每次的结果、筛选的方法（ELISA）及结果。克隆化培养试验应说明方法、次数、结果。对单克隆抗体细胞株的检定资料：包括免疫球蛋白及亚类，亲和力，特异性，交叉反应等。对于双抗体夹心法试剂盒要进行识别位点的分析。杂交瘤细胞株体外传代3个月以上保持稳定分泌抗体的情况。提供建立原始细胞库，种子细胞库，生产细胞库的试验资料。提供单克隆抗体制备过程的试验资料：腹水法或细胞培养

40、法、抗体的收集方法、抗体的纯化方法、提供连续生产3批的生产制检记录。提供单克隆抗体质控要求及检定结果的试验资料：包括其外观，活性，纯度，蛋白质含量等指标。6、生物芯片试剂盒根据产品的反应原理可以分为基因芯片和蛋白芯片，基因芯片参照PCR试剂盒的申报要求进行，蛋白芯片参照酶免试剂盒的申报要求进行。另外需提供以下技术资料：载体的选择。连接物的确定。工艺过程条件的确定。生产设备的要求。样品预处理过程的确定。试剂盒中阴、阳性质控品的选择。产品的性能评价。检测设备的要求。成品质控系统的建立。关于生物芯片的制备工艺：因为影响工艺过程的因素较多，为了保证成品质量的稳定性，建议：对芯片制备工艺，芯片的选择、芯

41、片的处理（如：氨基化、醛基化）、点样等每一步进行质量控制，建立质量标准。点样的均匀性、样品的吸附性，包括芯片内各点间、批内不同芯片间、不同批的不同芯片间的点样均匀性和样品的吸附性进行质量控制，建立质量标准。对芯片内不同样本间的抗干扰能力进行质量控制，建立质量标准。对点样后的稳定性进行质量控制并建立质量标准。同型半胱氨酸校准品溯源、制备、赋值、验证说明根据目前生化体外诊断试剂的发展趋势及用户的要求，试剂生产商应尽可能提供与试剂配套的校准品，并对校准品进行溯源性研究。本公司根据同型半胱氨酸试剂的实际情况，对同型半胱氨酸校准品的溯源、制备、赋值进行了研究，内容如下：一、同型半胱氨酸校准品的溯源由于目

42、前尚没有这一物质的国家标准物质及标准品，本公司采用Sigma-Aldrich超纯物质同型半胱氨酸配制校准品。二、同型半胱氨酸校准品的制备1、基础液的制备称取超纯三羟甲基氨基甲烷1.21g,溶于100ml纯化水中，用1N盐酸调pH至7.400.10(25。0,加入优级纯NaCl0.9g,再加入人白蛋白40g/L,0.5%o的抑菌剂，经0.45um滤膜过滤除菌后混合，分装为50ml/瓶，-20*冰冻存放。制备过程中用到的天平、容量瓶、PH计等必须经有资质的机构检定或校准合格，并在有效期内。2、同型半胱氨酸校准品的生产根据生产量的要求，于28C复融合适量的基础液，加入容量瓶中至总体积的60%，称取一

43、定量的同型半胱氨酸，以基础液溶解并转移至容量瓶中，以基础液清洗小烧杯三遍并转移至容量瓶中，用基础液定容至总体积。容量瓶必须经有资质的机构检定或校准合格，并在有效期内。将以上配制的同型半胱氨酸校准品进行冻干，2-8C保存。三、同型半胱氨酸校准品的赋值鉴于同型半胱氨酸校准品没有国家标准物质，也没有可供参照的有证参考物质，本公司采用公认质量最好的Sigma-Aldrich公司的原料，以Sigma-Aldrich公司提供的数据为依据，确定同型半胱氨酸校准品的含量。该校准品与本公司生产的同型半胱氨酸试剂配套使用，并通过测定有证质控品或与同行公司的产品进行比对实验进行验证。1、校准品的赋值根据同型半胱氨酸

44、加入量和校准品最终体积确定校准品的含量。同型半胱氨酸超纯物质加入量校准品的含量=校准品总体积2、校准品赋值的验证采用如下两种方法对同型半胱氨酸校准品（批号：080824）的赋值进行验证：（1）以配制的校准品为样本，自配质控品为质控，按照已注册批准的其他公司生产的同型半胱氨酸测定试剂对本公司配制的同型半胱氨酸校准品分别平行检测15次，去掉2SD外的数据，剩余数据取平均值，计算各不同浓度校准品的准确度，结果表明其偏差小于15%，自配质控品检测值在参考值值范围内。（2）以本公司制备的校准品、试剂组成一个测试系统，与已取得注册证的同型半胱氨酸测定试剂进行比对试验，对三批同型半胱氨酸测定试剂盒（批号：0

45、80913、080914、080915）进行检测，两种试剂同时测定40个标本，进行数据分析，相关系数r0.975，每个浓度点的相对偏差RW20%,结果完全符合产品注册标准。四、校准品有效期的确定1、以本公司制备的校准品（批号：080824）、试剂组成一个测试系统，与已取得注册证的同型半胱氨酸测定试剂进行比对试验，对三批同型半胱氨酸测定试剂盒（批号：080913、080914、080915）进行14个月的稳定性试验，两种试剂同时测定40个标本，进行数据分析，相关系数r0.975,每个浓度点的相对偏差R20%,结果完全符合产品注册标准。2、以本公司制备的校准品（批号：080824）、试剂组成一个测

46、试系统，以公司制备的质控品为质控，通过对同型半胱氨酸测定试剂盒批号（090812）的一年留样观察试验，结果完全符合产品注册标准。以上实验表明：自同型半胱氨酸校准品（批号：080824）配制起（配制日期：2008年8月24日），至留样观察试验完毕（2010年8月12日），经过长达23个多月的实验，检测结果完全符合产品注册标准的要求；同时参照国际上著名校准品生产商的有效期，一般为四年（如RANDOX公司、Roche公司）；为确保校准品的有效性，将配制的同型半胱氨酸校准品的有效期确定为18个月。体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核计划目的：顺利通过体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核以及接踵而来的品

47、种注册原则：直达目的，避免重复劳动造成不必要的人力财力和时间的浪费计划人：说明：正文中的计划需要时间均按中等熟练程度一人工作量计，实际中会因熟练程度弹性调整。正文目录：一、目前状况的掌握（准备时间约一周）1二、人员及培训（约2周）1三、硬件及设备器具就位（随时）2四、验证和设备操作文件（按相关设备数量定，大约两个月左右）2五、体系文件的完成（约16-18周）2六、其他相关文件及记录设计（和体系、验证文件同步完成）2七、自检自查及问题整改（总计约需两周）2八、申报文件准备（预计两周）2九、现场检查2附件一：第一阶段所需资料列表2附件二：体系文件进度3计划正文一、目前状况的掌握（准备时间约一周）“

48、知己知彼百战不殆”，只有全面的了解了自己的实力和不足，然后有针对性的改善和补救，才有可能打赢“体考”这场硬仗。收集现有文件图纸和必须的资料，详细登记并按需求归档，必须有但缺失的资料及时补足；在考核准备工作进行中，随时发现需要补充的资料随时落实；体系文件、记录、批记录等的归档。目前我认为必须准备的资料见附件一二、人员及培训（约二周）人是整个考核的灵魂，无论从资格还是操作以及临检的能力都直接影响到考核的成败，文件编制人员对体考的理解直接决定文件的质量，现场人员对操作和管理文件的理解直接决定现场考核的成绩，充足的培训是通过考核的最有效方法。人员培训主要有以下几方面1.体系考核相关法规和流程的培训（1

49、天，参加体考工作的全员）2.体系考核评定标准培训（总时约1周，参加体考工作的全员）全员应多次反复学习，各部门要深入学习各自相关条款。卫生、安全、工艺及质量相关知识学习（至少约1周，岗位相应人员分别培训）可采取理论和自学结合，实际和文件结合的方式。以上培训均需登记培训记录，并进行考核及现场随时提问抽检。三、硬件及设备器具就位（随时）硬件和现场的改动是贯穿于考核过程始终的，随时发现不足随时考虑对策，同步的变更相关文件和制度。硬件方面主要包括以下几大块：1.生产车间布局改造目前正在进行图纸确定，最好找相关权威机构咨询确认后施工，以免造成不必要返工。2.生产设备定置（随时）结合设备台帐和工艺流程标识及

50、人物流现场布置（2天）在设备定置后，统一印刻粘贴标识；之后随时按照实际需求调整。检验室建设（由于目前不明确检验室需要条件，无法做出具体规划）清洁工作（随时）利用空余时间随时进行，在考核前彻底清洁。四、验证和设备操作文件（按相关设备数量定，大约两个月左右）1.水和空调初次验证理论需要2-3个月，实际文件整理约需2-4周。2.由于目前未确定生产设备和检验仪器数量，大约进度每天完成1-2个设备/仪器，验证和操作文件及岗位操作文件可同步完成。五、体系文件的完成（约16-18周）按照实施细则检查顺序建立管理文件体系，见附表二六、其他相关文件及记录设计（和体系、验证文件同步完成）岗位标准操作规程、设备标准

51、操作规程、检验标准操作规程（同工艺文件及设备验证同步完成）。各项记录设计同文件同步完成。七、自检自查及问题整改（总计约需两周）考核准备过程中发现的问题指定专人负责落实解决，随时发现随时解决。成立体系考核小组，制定自查周期和整改落实规，发现问题落实到个人，及时监控完成情况，确保尽量少的出现不必要的缺失。最后按实施细则形成合格通过的自查报告，报告存档备查，然可提出申请。八、申报文件准备（预计两周）1.申请书（三份）2.生产平面布置图、工艺流程图（标明主要控制点）拟注册产品的综述资料、主要生产工艺及反应体系的研究资料、产品说明书、申请注册产品的标准以上文件报送至市局，有市局5日内转寄国家局认证中心。

52、九、现场检查现场考核3日前，国家局中心通知考核日期；3-5人组成考核组进行现场考核。从收到申请后50个工作日内完成现场核查，30个工作日内出具核查报告。附件一：第一阶段所需资料列表序号所需资料名称目的产品情况（名称、类型、规格、作用机制及组成、工艺流程、出厂检验项目）申报必填内容现有质量体系相关文件或其他同类企业体系文件模版新文件修改率非常高，借鉴参考文件可补足思维误区及减少工作量和工时工艺及检验方法的依据确定目前的文件的有效及权威产品设计的现行管理文件体系标准第四部分设计控制与验证现有物料及供货方清单、资质材料第五部分采购控制现有设备目录及档案资料必须材料，生产检验相关文件编写的先决条件附件

53、二：体系文件进度序号工作内容相关资料预计时间备注认证所需资料的收集整理分类需提供一周文件与记录控制管理文件（约5个管理文件）0.4周机构人员与管理职责部分管理文件（约10个管理文件）结合实际0.6周设施、生产环境和设备管理（约25个管理文件）结合实际2周设备标准操作文件（按设备数量确定）需提供待定、约2周设计控制管理文件（约5个管理文件）需提供待定、约0.4周验证相关管理文件（约5个）结合实际0.4周采购控制管理文件（约10个）结合实际0.6周品种工艺文件编写：工艺规程、岗位生产操作规程（含包装）、生产记录初步设计需提供一周至二周10生产相关管理文件的编写（20个左右管理文件）需提供两至三周1

54、1检验与质量控制相关文件（20个左右管理文件）需提供两至三周12品种检验文件编写需提供待定、约一周13产品销售与客户服务控制（约5个文件）需提供一周14不合格品、不良事件等管理（5-10个管理文件）需提供15以上文件相关记录文件完成后二周合计约150个管理文件、操作文件数量按实际情况16-18周ELISA试剂盒的包被用抗原与抗体包被用抗原用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取，一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取，蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中

55、提取等（例如AFP从脐带血或胎肝中提取）。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份，用于ELISA，在反应中可出现假阳性，因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培养成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量极微。目前检测抗HCVELISA中所用包被抗原大多为根据HCV的基因克隆表达而制备的重组抗原。在传染病诊断中，

56、不少重组抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得应用。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白质（BSA）等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。应用多肽抗原的另一注意点为他仅能检测与其相应的抗体。一种蛋白质抗原往往含有多个不同的能引起抗体产生的决定簇，因此在受检血清中的其他抗体就不能与该多肽抗原发生反应。另外，某些微生物发生变异时往往发生抗原结构变化，在这种情

57、况下，用个别多肽抗原进行包被可引起其他抗体的漏检。包被用抗体包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析

58、处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。布鲁氏菌纯蛋白衍生物制造及检定规程1基本要求生产、检定用设施、原料和辅料、水、器具、动物等应符合凡例要求。布鲁氏菌纯蛋白衍生物制造室必须与其他生物制品部门及实验室分开,原液生产全部过程，包括布氏杆菌的灭活，应在完全隔离的区域内进行,所需用具如高压锅、冰箱及玻璃器皿等，均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。2生产2.1菌种生产用菌种应符合凡例要求。2.1.1菌种名称及来源生产用菌种为猪布鲁

59、氏菌I型(S2)55007株。2.1.2种子批建立应符合“生物制品生产和检定用菌种、毒种管理”的有关规定。2.1.3种子批的检定染色镜检菌体染色后镜检应为革兰氏阴性小杆菌。生化特性1/1000三胜黄素作变异检查应为阴性，在硫堇培养基上能生长，碱性复红培养基上不生长，生长中产生明显的硫化氢，不需CO2。血清学特性检定用血清应符合“生物制品国家标准物质和标定规程”的有关规定。生产用菌种对布鲁氏菌诊断血清的凝集效价应达到1:800(+)以上。噬菌体裂解特性能被Wb噬菌体裂解。2.1.4种子批的保存及传代种子批的保存冻干菌种保存在28C,液体菌种保存在-70*以下。种子批的传代自工作种子批至菌体收集，

60、菌种传代总代数不应超过12代。2.2原液制备2.2.1生产用培养基用肝浸液琼脂培养基或其他适宜的培养基。培养基中应不含有对人体或动物造成毒性和变态反应性的成份。2.2.2菌种接种启开菌种后接种于肝琼脂斜面培养基上，在37*培养23天，视生长情况，可在肝琼脂斜面上再传代1次.生长良好的菌苔，供大量接种使用。2.2.3大量接种接种若干大管肝斜面或克氏瓶作为种子，37*培养2天，用以接种足够用的大管肝斜面或肝琼脂克氏瓶，37*培养2天。2.2.4杀菌和除菌培养终止，以生理氯化钠溶液洗脱培养物，121*30分钟进行杀菌处理。杀菌后离心除去菌体收集上清液。2.2.5滤液收集和合并上清液进行纯化或取样做无