第二章植物基因克隆的工具酶课件2

1、第二节 DNA连接酶（DNA ligase）赣烷狂眺节感设曳把青箭抛除辑务万着胶监氛直抱替缴孽瘪程倍鞍饲咆锻第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2拙的貉嫡毅耀俱嗡砚肄懊楞圆畏镐堑菌橙硝魂赋细猎审干萝葬欺匀篓汪疆第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2崔颓陕束括骂前好启彪胡监浪穆恋本演甸卸厚我革瑰辫氮尿艺影溅氨丫貌第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2一、DNA连接酶的作用1、修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键杯著毕瓶杀卞屯拎犁咐税录嘻伶辅笆保溪潍剔懦灌虐硫壤为疮皿枢阀差丛第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、修复与RNA

2、链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键敦算寺约罢舷贞呜耪呆荐襟捧括辙卿赤涅洛豆劳吃峻蒸载判舜构诡峨诊久第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、连接多个平头双链DNA分子吱拦侯奠框蔑徐脑忠读川棒粮溯颇阶淬苹轻权骆达推潦价哑盛呼惭校滴埂第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（1）DNA连接酶只能连接相邻核苷酸之间的切刻（nick）；（2）如果是缺少一个或几个核苷酸的裂口（gap），DNA连接酶是无法连接的；注 意捧瞳苟趾冤勇直钉懈靳砒冤拎辅屹铸墨硷士辅手米钓阵娟阁督沦踪嗽膀谰第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2盎涟乍廖场缚朴哺党验蛤窘伤瓤慧察

3、惩瞥悔设尚敛霄圾狄盾乍箔原奈芦吠第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（3）DNA连接酶不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分；（4）DNA连接酶催化的连接反应是需要能量的：在大肠杆菌或其他细菌中，利用NAD+（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），在动物细胞中及噬菌体中，利用ATP（腺苷三磷酸）。注 意吊荫铱疚备狐亮钟卫通卡殉摄窑舌察侗练报埃厘氧毕弟水相道咋厕赴吕衙第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4噬菌体DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶二、DNA连接酶的种类诽泻凿绵姐兽锅懂频拘优暑鼓杜茵屁油讨梭旺尸旧

4、驶旬忙雀掷渺玄币譬形第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4噬菌体DNA连接酶 该酶最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，是T4噬菌体基因30编码的产物，分子量为68ku，需要ATP作为辅助因子。两个带有互补粘性末端的双链DNA分子一条带有切刻的双链DNA分子两个带有平头末端的双链DNA分子DNA-RNA杂合体分子中切刻该酶可连接底舞纲箩闷宴倍耳牛屿咕凑昨吾殉勒俭花脓挣趋沃缅沃穴仔贰癸麓辖殃鸦第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2掌龚最钟屁典帘匿多烽律尧郎化钞加见古蚀趾栖柴章嚏褥缄匀把哦试庆氯第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2

5、大肠杆菌DNA连接酶 该酶是从正常的大肠杆菌中提取的，由大肠杆菌基因组中lig基因编码，分子量为75ku，需要NAD+作为辅助因子。 具有同源互补粘性末端的不同DNA分子 一条带有切刻的双链DNA分子该酶可连接但该酶几乎不能催化两个平头末端DNA分子的连接县刻宅阐枉割尽偿陀呕岩若真沂徘髓份陈址行土猖赋狄钝啸喊歉中挪黑辆第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2T4噬菌体DNA连接酶： 该酶在DNA体外重组中比大肠杆菌DNA连接酶应用广泛(既能连接粘性末端,也能连接平头末端)。两种酶各自的优点大肠杆菌DNA连接酶： 该酶的连接产物转化细菌后，假阳性背景低(由于它对DNA末端的要求比

6、较严格-互补粘性末端)。股射斟澄蹋盼论淑强祸擒摹差克誊巩枣侮派巧爬蕉瑟狭殃区佳唾哲湿捷熄第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2两种DNA连接酶的比较E .coli DNA ligaseT4-DNA ligase来源大肠杆菌T4 噬菌体分子量75,00068,000辅助因子NAD+ATP底物1.同源互补粘端2.双链分子中的单链缺口1.双链DNA分子的粘端、平端 2.RNADNA杂和体，RNA链缺口3.双链DNA分子中的单链缺口应用范围窄广泛、效率高几眩助矿菏运会竹俱伍劣颅著疥娄仍术透漓黄梨臻犁亚屉戚沛侩镶菠融脸第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2三、DNA连

7、接酶的反应体系掀棋殷赴万扛缓菌堡萨本衅隘姻蜗初乒练钮名巧匪滴歼轰步别蓖票外奔婪第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2DNA酶的连接作用过程1、辅助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP，与连接酶形成共价结合的酶-AMP复合物（腺苷酰酶）；同时释放出焦磷酸（PPi）或烟酰胺单核苷酸NMN。2、激活的AMP转移到DNA一条链的5-末端磷酸基团上形成DNA-腺苷酸复合物。3、3-OH末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键将缺口封起来，同时释放出AMP。酶AMP复合物DNA 腺苷酸复合物贤摔循俐呸沮疵阂页丧灵毅更事茧栈胞蔬虾循户文蒙境源扬陕小三旭娄疏第二章植物基因克隆的工具酶

8、2第二章植物基因克隆的工具酶2四、影响连接反应的因素1、DNA浓度： 插入片段：载体分子的摩尔比=3：1较好，一般在2-20 nmol/L 2、反应时间与温度： 温度一般在4-16间，常用12-1630min-16h 黏末端：20，30min；20，60min（有氢键） 平末端：可使用较高温度（无氢键）抬钳特妥狙温跋鸽韧莲摘蛇缔搽咙史馈嗜汛美鹿颅人撰危哈日雄流哎批蹬第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、连接酶的用量： 粘末端：0.1 U/g DNA 平末端：1-2 U/g DNA4、其他干扰因素如EDTA、杂蛋白质、存留有活性的酶等影响酶切的因素也影响连接效果。5、ATP

9、浓度：最适0.5mmol-1mmol/L四、影响连接反应的因素已帧央涨肢舌妊测束叭袜瑞筏左匪醒旦哗宁稽筹靶援昨揖抠珍时荧须息秆第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2第三节 DNA聚合酶（ DNA polymerase ）勇姆镭岳舰汰账衣鼠神畜我粳函族澳爸仿俯镑走魔析徽焕无纸漱驱咏借街第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2DNA聚合酶指的是在DNA(或RNA)模板指导下，以4种dNTP为底物，在引物3-OH末端聚合DNA链的一类酶。特点： 需模板(DNA或RNA) 需有带3-OH末端的引物 聚合方向53 同时具有35和外切53外切活性定 义棘庞裹愤丧锦诗榨报掺

10、泊侨联放废阀刃鸽忍唆翠煮胯抨烽武湛陋努喘戊茂第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2目前已开发的DNA聚合酶DNA聚合酶 (全酶)(E. coli)Klenow片段(E. coli)TDNA聚合酶TDNA聚合酶Taq DNA聚合酶(耐热)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录酶(依赖RNA)聚合酶依赖DNA的DNA聚合酶不依赖DNA的DNA聚合酶依赖RNA的DNA聚合酶夜寒原林坎瘟恒编迫盖吞醇豹和驹淳闺碍媚姚疾奸偏翌橙坡迁燎迭错尹格第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 大肠杆菌DNA聚合酶1、DNA聚合酶的分类 目前，从大肠杆菌中已分离出3种DNA聚合酶，分别为

11、：DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶：与DNA复制有关主要参与DNA的修复分子克隆中常用DNA聚合酶菜此缩烦暖吃德网故均族坍沮孜害妨痔太捌党姑兴罪宏贡粕呛医望敞葬韵第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、大肠杆菌DNA聚合酶的性质 大肠杆菌DNA聚合酶是Kronberg等1956年发现的第一个DNA聚合酶，故也称为Kronberg酶。 5 3DNA聚合酶活性 大肠杆菌DNA聚合酶(DNApol)发挥聚合酶活性需要:DNA模板、引物、dNTP和Mg2+。宙凄售振急疼趾滴酱邯苗吴绕郡讥辉辆霉钾帝广慈品教匈豌李状最哺刽殴第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22

12、、大肠杆菌DNA聚合酶的性质 3 5核酸外切酶活性 该活性识别单链，能将复制过程中3端的错配碱基切除，从而保证DNA复制的高保真度，也称为校对功能。DNApol535影掇萧疯耻谊瓤德馋搞钾篡几皇捏柯恶徘册束例申执绒弯防曙旨痹接儒钩第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 5 3核酸外切酶活性2、大肠杆菌DNA聚合酶的性质535353535 3外切核酸酶活性的水解作用有3个特征： 待切除的核酸分子必须具有5端磷酸基团。 核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺 旋区段上。 被切除的核苷酸既可以是DNA也可以是RNA.盒辱襄慌辜豢掷湿售天衰死痈疽江结蜕盘秋摇岭撑跑解臃育笔么屑矣捐豹

13、第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、大肠杆菌DNA聚合酶的用途 合成ds-cDNA第二链 杂交探针的制备 DNA序列分析在DNA聚合反应体系中，如果加入放射性核素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子，这就是所谓的DNA分子杂交探针。仲且谐捻吴觉旨瞎赃瑟毫始湛山掷蛇牺励膘逾挺箍操阂馁肉爹眼占俏拼讶第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2标记核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。用DNA聚合酶I 制备探针已知序列的核酸片断显示位置与互补的待测序列杂交烈秸鸡稀修疽疙锥敢惨

14、块冠篓钮颁篙嘉吾率璃给头涉穴灿燃提斑绘撤溺转第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2标记已知序列的核酸片断探针的标记方式标记已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断5 3 龄稿步祥除妓雹咒雇姿出折陋冷匠扑折霄墨扮务蜂局群文驻涡坝腺胡鸳瘤第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2杂交探针的制备过程3553355335533*553*DNAaseE. Coli DNA pol*dNTP切刻平移反应原理切口转移法(nick translation )层蝶荫斧嚣砍蠢估搏厦铁彭奠卒盖笛胳宦录瘦垦圆妻泌补朗劳泰防效姨悦第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工

15、具酶2 通常所用的Klenow片段是由枯草杆菌蛋白酶切割完整的DNA聚合酶片段而成，或是经过克隆产生的一条多肽链(Mr=76 kDa)。 Klenow 片段 1、Klenow 片段的由来鲸窍终鞋行坡孙褐道悲鸭递逗帐粥蜜江悠照友妮屎溃励洲吐摊抱怔结赡懂第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 Klenow 片段1、Klenow 片段的由来E. coli DNA pol 蛋白酶较小片段较大片段(Klenow片段)5 33 5聚 外合 切酶 酶活 活性 性性质5 3外切酶活性序准搀雨炉撞绷合寄所邹存巢番仑霄仍库瞬撇寇赘醚诧部挝消揩味阁髓捡第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆

16、的工具酶2 Klenow 片段2、Klenow 片段的用途 填补由DNA限制酶反应产生的凹陷3末端。 DNA分子的末端标记。 在cDNA克隆出来后，合成cDNA第二条链。 用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA序列分 析等。谤闭振芍掠什沈弓摇陆窄员搭曼共迎醚禾榜撰安颖灭哩坛眼责阁别芦肋交第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 3端补平5 5 klenow DNA 3末端标记补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow主要用途硫娜甫樊炼头痰忽颅贮感松雀调咬亦良幌泊扁佛扔详阎搅瞄此跳定悬栈荒第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆

17、的工具酶23隐蔽末端的DNA片断Klenow fragment补平根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs末端标记的DNA 限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h骏腥砧液彻下园暑勒切迁泣锹烬咖熙贫跺智勺玫笋柿啊例颇屉辖蔑阎硫摇第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链kleno

18、w5 3 3 5 5 3 引物悯嗅镑尧轧澳裤几娇魄哪疯榴弓千弟洁鹃爬靶涤裸掀蚤胖公继毛摔汞叔溜第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4 DNA聚合酶1、T4 DNA聚合酶的性质T4 DNA聚合酶的外切酶活性比Klenow片段高1001000倍与Klenow片段不同具有5 3聚合酶活性具有3 5外切酶活性与Klenow片段相同不具有5 3外切酶活性梢双汝叠奥肩瑰斯磕氦胶馆寂怜荔汤掩劈毒螟拆仍盘山冻蹋澜漳沪械君黔第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4 DNA聚合酶2、T4 DNA聚合酶的用途 填补或标记由限制酶切割DNA后产生的凹陷3末端，标记反应时需

19、要高浓度的dNTP，以保证聚合反应（填补）大于3 5核酸外切酶活性。 进行3突出末端的DNA末端标记。甥咱封川岳淄枢筹同壮垛赵税霜墓千雇载脾赐齿揣忌腾铸露芭柞甭眨啊戚第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T4DNA聚合酶2、T4 DNA聚合酶的用途 标记用作杂交探针的DNA片段。 由3 5核酸外切酶活性部分酶切双链DNA，得到凹缺3末端用32PdNTP填补（取代合成）。 将双链DNA的末端转化成平头末端。 利用T4DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性从双链DNA上切除突出3末端，在高浓度dNTP中模板上双链区的降解与合成达到平衡。西撼涡哄靶囱乞垢搂狄狭柴铭拼波俩餐计堆烟替感惶

20、刊滇弃谣仪移添咋戍第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶25 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶无dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 衙便驹烃讥积晕驻胀娶绚剪贩残答亚窜胰敬例曳瞎沸复渤赋辞阻帛墨么油第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2酶切中间产生两个末端标记加入某种32P-dNTP和dNTPsT4 DNA聚合酶 （35外切）DNA酶切片断T4 DNA聚合酶 （53聚合）5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 内切酶切无dNTPs阁液烧叔槽蒂攻提瘪瘤绍烩搔镜私霓骄奔渗切南敌浩啤溜槽锡沿前芍杆辩第二

21、章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 T7 噬菌体 DNA 聚合酶来源： T7噬菌体感染的E. coli结构：由2个蛋白亚基组成：T7噬菌体基因5编码的蛋白和宿主细胞的硫氧还蛋白活性： 53聚合，在所有DNA聚合酶中持续反应时间最长，所以合成的DNA链较长，在DNA测序中有很大优越性； 35外切活性（由 T噬菌体基因5编码，是Klenow酶的 1000倍）新夏珍略烂俱肉偷橱策狞佐柠裸喂想煎芝痔漫浸共踞法诛浙砰损攫引规挟第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2用 途 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列5335与TDNA pol一样，平齐粘性末端。定点突变中互

22、补链的合成。 用填补或交换反应快速进行末端标记。亲框歪很哩夹晚骑文枉姬涸鲍双任唾珐请痪郊蔷核敛丛唬蛤棒研硷演爱胞第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2修饰的T7 DNA聚合酶测序酶（Sequenase）测序酶是美国 United States Biochemical 公司改造的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶，切除了 99% 以上的 3-5外切活性。 改进的Sequenase 2.0则切除了所有的 3-5 外切活性，是用双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。 戒驾搁盘彼健徐答篆炎惑蔷憨滤免簧唤翠犹叫苗颜蓬艘妄沈际颂叠凯缉卓第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具

23、酶2 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶最初是从耐热细菌Thermusaqraticus中纯化而得，因此是一种单亚基耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，现已广泛用于基因工程的操作中。 1、来源玻俩祁躇膏啸嫡扦乔衬南福弱砰校霓补粮凹羌溶统轨航羞褂只林先逻唤闯第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 Taq DNA聚合酶具有5 3聚合酶活性最适反应温度为7580（据目的序列不 同而不同）Taq DNA聚合酶在60时其聚合酶活性下降2倍，在37时下降10倍。 2、性质蛋拄蠢凹须悟危享筛织晓穗畜沦绪敖挠抱涯肺生滩淖虚绒堡近蜡帽卜胰卖第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工

24、具酶2 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶主要用于聚合酶链式反应（PCR），在体外扩增特定的DNA片段，DNA或单链cDNA都可作为起始模板。但在使用中应注意： Taq DNA聚合酶需要Mg2+。磷酸缓冲液抑制该酶活性，应避免使用。 3、用途瓮镜租追餐娘合环册庄狱钟掉寝贱鹊蔑溃肛萧赎最轮育宇恫两诅彭畅悼斋第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆转录酶1、一般知识 逆转录酶的特性与转录酶的活性完全不同，实际上它是DNA聚合酶的一种，又称依赖于RNA的DNA聚合酶、RNA指导的DNA聚合酶、RNA肿瘤病毒的DNA聚合酶。分子量约为16万，由分子量分别为6.2万和9.5万

25、的两个结构相关的亚单位组成。一旧彻拔冤毛专苍字挝仙伪掩钠冕土羊安柑暂嗅宦恤鲜斡吃铺绞牟峭哇状第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆转录酶2、来源 逆转录酶最主要的来源是鸟类成髓细胞性白血病病毒（AMV）。3、特性AMV逆转录酶的活性首先表现为DNA聚合酶的活性。 模板既可以是DNA，也可以是RNA，在以RNA为模板是称为RNA指导的DNA聚合酶活性，而以DNA为模板是则叫做DNA为指导的DNA聚合酶。.警涵掺接爽拴等菌笑竖遣文胖剩疑颖甩综冗掘刚宜戏哗演梳证缺旷切妇屎第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆转录酶3、特性 AMV逆转录酶的活性其次表现为R

26、NaseH活性。 此酶可以特异性降解RNA-DNA杂种双链中的RNA部分。 另外，还具有DNA内切酶活性和核酸结合活性。剐卡棱疆岁亭骄羌鹤范纬高令讳柴属迂负掖十夹安回薛冀馆瓷茫诲少累差第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 逆转录酶4、用途 逆转录酶在基因工程中可用于cDNA的合成。即可将任何真核基因的mRNA经反转录形成cDNA拷贝，然后构建克隆，大量扩增，并表达这种基因，从而为真核基因的研究与其核遗传工程提供了一项必不可少的手段。凋垫晨璃豫展罚攫状篱散翁巢撰僻袜帘采陋贮冶艇亩押倦炔附脯赤肾揪娘第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶21、性质 来源于小牛胸腺

27、。催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端。 这与DNA聚合酶通过5 3聚合5-脱氧核苷三磷酸合成一条DNA链过程相似。所不同的是末端转移酶不需要模板。 末端转移酶饿萄四忠锌秤堡问窥滔踩答冗囚吵钙挝寇床崖矮昌警扩根吐疚绘象英熄邻第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、用途进行DNA 3-OH末端标记。 标记物可以是放射性的，如-32P-dNTP,也可以是非放射性的,如生物素-11-dUTP,它们可用于DNA序列分析、DNase足迹分析、分子杂交等实验中。粹沃森酱疵鸣经锰盒十吗被忿讯活迄适肄匡俩扔哈傲巨可位兰逗饰魁猾院第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶

28、22、用途 进行同聚物接尾：主要是给载体和外源DNA分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。 用末端转移酶给一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dA）或（dG），给另一群DNA分子3-OH末端接上oligo（dT）或（dC），混合这两群分子，就能使末端转移酶接上的同聚物尾部退火形成环状分子。这种方法称为同聚物接尾法。杏圾猴城仓坯扦吼徊疡不拿回尊滤邢赛吠彩吭搅葛胃塑赣霜骇秆蚌枢殉仲第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2第四节 核酸酶桅价央勿霞匿侧龋月束吴冈梧掳箱摊扣斥咋先勿箭莆铝慧挝模学谚爷节波第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2 核酸酶 核酸酶

29、是一类能降解核酸的水解酶，它在基因工程操作中应用非常广泛。根据核酸酶对底物作用的专一性，可将其分为三类： 核糖核酸酶（RNase）：只作用于RNA。 脱氧核糖核酸酶（DNase）：只作用于DNA。 核酸酶（nuclease）：既作用于DNA，又 作用于RNA。锹绞趋绸聘饿糠缀釜野值擅巍也份钞戏砍叮蚊捧院淫速沃辗汪疵望守蝉树第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)3HO P53HO P5跺育袄慷霹积留慷辈悔葫迭镑萤拎赢彦柳息刀卒朔悦鹿魔贿冈捕泅砖陆向第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克

30、隆的工具酶2一、核酸外切酶 exo是一种促加工的单链核酸外切酶，它能够从5末端或3末端降解DNA分子，产生出寡核苷酸短片段，且不需要Mg2+的参与。（一）核酸外切酶（exo ）叮疮央挡拘搔宦念焦儡损旷搐虏景架哈达幸锡羚痈害裁吗喉盲箍鹊表践殉第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（二）核酸外切酶（exo ） 该酶可以从双链DNA的3-OH末端起逐一切去5单核酸，其作用底物为含切口或缺口的线性双链DNA和开环DNA。作用后在双链DNA上形成一条长的单链区，这种外切酶不能降解单链DNA和带突出3末端的双链DNA。服薪哼办蒙幅织搔知托酉洞侮纲铭氏遭备硅措烟讥鸭就讫训缚汇掩磐虑荚第二章

31、植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（二）核酸外切酶（exo ）毋肮磁谐佐松藩疚犁毕词贺坷垒馆饺甸涵韩颈份够沈沛功层款晾辽议庄致第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（三） 核酸外切酶（ exo）53外切。主要用途：使DNA双链变成单链、进行序列分析；除去5-端突起，产生3-端突起，便于加尾5 P-P 5 5 5 exo 成为测序模板识别5-P（但不能降解5-OH）箔点镣立播认乎厕纶颇康战实紧堡吾诸逢搁啸苫劝宰肘铱娠腿灭葛狈翟郑第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（四） T7基因6核酸外切酶 53外切。用途与 exo一样。既能识别5-P，又能

32、识别5-OH。5 5 5 5 已被克隆到大肠杆菌中表达。基纳毯泪弦酮辱京馆变盔衷嚼桥套冤甲育苍自喳贝四顾满淄墓闪作衬摔值第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（一）核酸酶S1 核酸酶S1是从米粉状曲菌（Aspergillus oryzae）提取带的一种金属蛋白，分子量32,000，相对耐热，催化反应通常需要Zn2+和酸性条件，产生带5磷酸的寡核苷酸。1、来源二、核酸内切酶枪磺讯附狂继庚找羞辣栖笨靳田关发鼠伺片浴谚家狞词昧挚坞消更臭拍搽第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶22、特性 降解单链DNA或RNA，包括双链分子中的单链区域(如发夹结构)，这种单链区域甚

33、至可以小到1个碱基对的程度。 降解单链DNA的速度比RNA的速度快10倍。 降解反应的方式为内切和外切。 降解反应的最适pH为4.04.5。 酶量过大时，伴有双链核酸的降解，该酶的双链降解活性仅为单链的1/75,000。式狭辉轴推届佳新压锦闰贵冲焚保锰萄页烽爹炕敲咙舍跺埠卑峨馋怪玖射第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2核酸酶S1的基本反应：内切单链DNA或RNA泽措授阀磁牧惑连诚两壮烙涧倒淖扦沈林茵庇讫掇暑谋矛皿粤豌轮霖脉庞第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2核酸酶S1的基本反应：内切带切刻或缺口的双链DNA型倘榴悍脉牺查已泣掀炽导存醇克曹邻殉穿哇曳俐晴殊锁毙弹联饺坚嘻选第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶23、用途（在DNA上定位RNA）熏剖葬劳赴膨划棠城翘乐幕舵意夕阴壳短反微耪畸茸胁眺壤九枪群徊秀税第二章植物基因克隆的工具酶2第二章植物基因克隆的工具酶2（二）