一种分离培养及鉴定小鼠牙龈间充质干细胞的方法

1、一种分离培养及鉴定小鼠牙龈间充质干细胞的方法陈丽玲徐振健徐安平【摘要】目的探讨建立一种新型、简便易行的小鼠牙龈间充质干细胞 （GMSC）体外提取及培养方法。方法选择C57BL/6小鼠，使用IV型胶 原酶消化分离其牙龈组织，种板培养并传代。利用细胞增殖及细胞毒 性检测试剂盒（CCK-8法）观察小鼠GMSC的增殖规律，流式细胞术 检测小鼠GMSC的细胞表面标志物，进行成脂、成骨诱导分化实验， 观察所提取GMSC的多向分化潜能。结果CCK-8试验显示小鼠GMSC在 培养第34日增殖活跃（第25日相邻时间点间，P均0.05）,第 5日开始增殖进入平台期（第58日的相邻时间点间比较,P均0. 05）。

2、流式余田胞术结果显示，与小鼠口腔黏膜上皮细胞相比，GMSC高表达 CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105 （P 均 0.05）,几乎不表达 CD34、 CD45 （P均0.05）；多向分化诱导实验中，GMSC成功分化为对应的组 织细胞，证实了 GMSC的多向分化功能。结论本研究成功提取小鼠GMSC, 首次发现了一种新的、操作简便的、对原代细胞伤害少且有较高细胞 获得率的科学提取GMSC方法，并鉴定了其细胞标志物和分化功能。【关键词】牙龈间充质干细胞;提取培养;诱导分化；鉴定【AbstractObjectiveToestablishanovelandsimplemethodfor

3、isolationandcul tureofmousegingivalmesenchymalstemcells（ GMSCs ）invitro. MethodsThegingivaltissuesfromC57BL/6micewereseparat edanddigestedwithtypeIVcollagenase, culturedinadishandpassaged. TheproliferationpatternofmouseGMisandboneerosionviaCD39-adenosinesignalpathwayinautoimmunea rthritis. EBioMedic

4、ine, 2022, 43： 620-631. llWuW ,XiaoZ ,ChenY ,etal. CD39producedfromhumanGMSCsregulatesthebalanceofosteocl astsandosteoblaststhroughtheWnt/B -cateninpathwayinosteopor osis.MolTher, 2022, 28 (6)： 1518-1532.12ChenM ,SuW ,LinX ,etal. Adoptivetransferofhumangingiva-derivedmesenchymalstemc ellsameliorates

5、collagen-inducedarthritisviasuppressionofThl andThl7cellsandenhancementofregulatoryTce11differentiation. ArthritisRheum, 2022, 65 (5)： 1181-1193.13ZhangW ,ZhouL ,DangJ ,etal. Humangingiva-derivedmesenchymalstemcellsameliorateStre ptozoticin-induced?IDMinmiceviasuppressionofTeffectorcelisa ndup-regul

6、atingTregsubsets. SciRep, 2022, 7 (1)： 15249.14DangJ,XuZ,XuA,etal. Humangingiva-derivedmesenchymalstemcellsaretherapeutic inlupusnephritisthroughtargetingofCD39-CD73signalingpathway .JAutoimmun, 2022, 113： 102491. 15XuX,ChenC ,AkiyamaK ,etal. Gingivaecontainneural-crest-andmesoderm-derivedmesench ym

7、alstemcells. JDentRes, 2022, 92 (9)： 825-832.16GuY,ShiS. Transplantationofgingiva-derivedmesenchymalstemcellsam elioratescollagen-inducedarthritis. ArthritisResTher, 2022,18 (1)： 262.17WangX ,SongH ,ZhaoS ,etal. Gingival-derivedmesenchymalstemcellsprotectagainstseps isanditscomplications. InfectDrug

8、Resist, 2022, 14： 3341-3355.18HuangF ,ChenM ,ChenW ,etal. Humangingiva-derivedmesenchymalstemcellsinhibitxeno-gr aft-versus-hostdiseaseviaCD39-CD73-adenosineandID0signals. F rontlmmunol, 2022, 8： 68.19AlBahrawyM , GhaffarK , GamalA , etal. Effectofinflammationongingivalmesenchymalstem/progenit orcel

9、ls, proliferationandmigrationthroughmicroperforatedmem branes： aninvitrostudy. StemCellsInt, 2022, 2022： 5373418.20NiX,XiaY ,ZhouS ,etal. ReductioninmurineacuteGVHDseveritybyhumangingivaltissu e-derivedmesenchymalstemcellsviatheCD39pathways. CellDeathDi s, 2022, 10 (1)： 13.21ZhaoJ ,WangJ ,DangJ ,eta

10、l. Apreclinicalstudy-systemicevaluationofsafetyonmesenchy malstemcellsderivedfromhumangingivatissue. StemCellResTher , 2022, 10 (1)： 165.22KimD, LeeAE,XuQ,etal. Gingiva-derivedmesenchymalstemcells： potentialapplicationintissueengineeringandregenerativemedic ine一acomprehensivereview. Frontlmmunol, 20

11、22, 12： 667221.(收稿日期:2022-01-20)(本文编辑：林燕薇)SCswasinvest!gatedbyCellCountingKit-8( CCK-8 )assay. ThesurfacemarkersofGMSCsweredetectedbyflowcytometry , andadipogenicandosteogenicdifferentiationexperimentswerecar riedouttoexplorethemulti-directionaldifferentiationpotentia loftheextractedGMSCs. ResultsCC

12、K8assayshowedthatmouseGMSCsac tivelyproliferatedat3to4dafterculture( allPO. 05betweenanytwoconsecutivedaysfrom2ndto5thd ) , andbegantobecomesteadyonday5 TOC o 1-5 h z (allPO. 05betweenanytwoconsecutivedaysfrom5thto8thd) . Flowe ytometryshowedthatGMSCshighlyexpressedCD29 , CD44 , CD73 , CD90andCD105(

13、allPO. 05),butbasicallydidnotexpressCD34anclCD45comparedwithmouseoralmu cosalepithelialcells(bothPO. 05 ) .Muiti-directionaldifferentiationinductionexpe rimentdemonstratedthatGMSCssuccessfullydifferentiatedintoco rrespondingtissuecells,confirmingthemulti-directionaldifferentiationpotentialofGMS Cs.C

14、onelusionsInthisstudy,mouseGMSCsaresuccessfullyisolatedbyanewandsimplemethodforth efirsttime,whichcausesslightdamagetoprimarycel1sandyieldshighcellacqui sitionrate. Thecellmarkersanddifferentiationfunctionarealsoi dentified.LKeywordsJGingivalmesenchymalstemcell；Isolationandculture；Inductiondi fferen

15、tiation；Identification间充质干细胞(MSC)具有自我更新、多能分化和免疫调节的作用。 近年研究显示，MSC可在包括变应性结膜炎、变应性鼻炎、急性青光 眼、阿尔茨海默病和1型糖尿病等多种疾病中发挥治疗作用1-6。 MSC可以从不同的组织中分离出来，包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪组 织和人的牙龈7。牙龈MSC (GMSC)是一种从牙龈组织中获得的MSC 亚群，2022年Zhang等首次从人牙龈组织中分离出GMSC,并证实了 其表型及功能活性8。与其他MSC类似，GMSC也具有抑制炎症和调 节免疫反应的作用。小鼠和人源化动物模型研究显示，GMSC能够通 过减少效应性T淋巴细胞、树突

16、状细胞、巨噬细胞、破骨细胞和增加 调节性T淋巴细胞等治疗包括类风湿关节炎、1型糖尿病、SLE、动 脉粥样硬化等多种疾病7, 9-14 o既往文献提及的小鼠GMSC的提取 方法需使用多种酶及复杂的培养基等15-16。本研究以C57BL/6小 鼠进行实验，旨在建立更为简便、高效的GMSC体外提取及培养体系， 现报道如下。材料与方法 一、动物SPF级C57BL/6小鼠5只，雌雄不限，810周龄，体质量1520g, 购自广东省医学实验动物中心。实验过程中严格遵循减少、替代、优 化的伦理规范操作，做到充分考虑动物的利益，善待动物，防止或减 少动物的应激、痛苦和伤害，尊重动物生命，采取痛苦最少的方法处 置

17、动物。二、主要试剂包括：a包括：a-MEM培养基、青霉素-链霉素双抗溶液、胎牛血清(FBS),均购自美国Gibco公司；IV型胶原酶、地塞米松、甘油磷酸钠、抗 坏血酸、3-异丁基-1-甲基黄嘿吟（IBMX）、呻喋美辛、人胰岛素、油 红0染液，均购自美国Sigma公司；细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 （CCK-8法）购自美国APExBio公司；结晶紫染液、茜素红染液，均购自上海碧云天生物技术有限公司；抗小鼠流式抗体CD29、CD34、 CD44、CD45、CD73、CD90、CD105,均购自美国 BD 公司。三、培养液配制原代细胞培养液为a-MEM培养基+20%FBS。完全培养液为 a -MEM

18、+10%FBSo 成脂诱导液为 a -MEM 培养基+10%FBS+200 口 mol/L 呻噪美辛+10mg/L胰岛素+1 u mol/L地塞米松+500 u mol/LIBMXo成骨 诱导液为 a -MEM+10%FBS+10nmol/L地塞米松+50mg/L抗坏血酸 +10mmol/L 8 -甘油磷酸钠。四、实验方法.小鼠GMSC的分离培养处死C57BL/6小鼠，取小鼠下颌骨，清除多余皮肤及肌肉组织，用含 有5%双抗的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗下颌骨多次。用注射器针头轻 轻分离磨牙区牙龈。收集分离到的组织于培养皿中，加入Img/LW型 胶原酶，于37中消化30min,加入含有FBS的a-

19、MEM终止消化， 离心，弃上清。将组织铺于6孔板中，每孔加1ml含20%FBS的a-MEM, 置于37C、5%C02培养箱中培养。待23d后细胞爬出，换液把剩余 组织块洗出，每孔加2ml20%FBS的a -MEM, 3d换1次液。细胞长满 板底80%后传代，传代后更换为含10%FBS的完全培养液继续培养。.小鼠GMSC的增殖能力检测按细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（CCK-8法）说明书进行操作，连 续8d在同一时间使用酶标仪测量450nm处的吸光度，根据结果绘制 GMSC生长曲线。.小鼠GMSC的表面标志物流式细胞术检测 将第2代GMSC （约1X106个细胞）细胞悬液用PBS洗涤2次，用 10

20、0 u 1PBS重悬后分别加入流式抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、 CD90、CD105, 4。（3避光蜉育20min后，PBS洗涤3次，流式细胞仪检 测上述细胞表面标志物的表达。.小鼠GMSC的多向分化潜能诱导 成脂诱导分化:取第2代GMSC接种于6孔板,每孔约3义103个细胞, 待细胞铺满板底70%,更换培养液为成脂诱导液，每隔3d换1次液。诱导21d后，PBS洗涤细胞1次，4%多聚甲醛固定30min,去离子水 洗涤2次后油红0染液染色20min,蒸储水清洗3次，干燥后倒置显 微镜下观察并拍照。成骨诱导分化:取第2代GMSC接种于6孔板,每孔约3X 103个细胞， 待

21、细胞铺满板底70%,更换为成骨诱导液，每隔3d换1次液。诱导 28d后，PBS洗涤细胞1次，4%多聚甲醛固定30min,去离子水洗涤2 次后茜素红染液染色30min,蒸偏水清洗3次，干燥后倒置显微镜下 观察并拍照。五、统计学处理应用GraphPadPrism8软件进行数据分析。数据均符合正态分布，以 表示，组间比较采用t检验，多个时间点的比较采用单因素方差分析, 进一步两两比较采用LSD-1检验。P0. 05为差异有统计学意义。结果 一、小鼠GMSC的分离培养结果培养23d后，普通光学倒置显微镜下可见原代细胞从组织爬出，贴 壁生长，细胞呈长梭状（图1A）。可见原代细胞培养至1014d时细 胞铺

22、满皿底80% （图IB、C）,可进行传代培养。二、小鼠GMSC的增殖能力检测结果CCK-8法结果显示，GMSC在第34日增长最快，在第58日增长变 得缓慢，出现平台期。普通光学倒置显微镜下可见GMSC在第34日 数量增长明显，在第58日数量逐渐到达最大值，并进入平台期。 各时间点的变化组间比较差异有统计学意义(F=339. 90, P0. 001), 其中第02日、第58日的相邻时间点比较差异无统计学意义(P 均0. 05。第25日相邻时间点比较差异均有统计学意义(P均0. 05), 见图2。三、小鼠GMSC的细胞表面标志物流式细胞术检测结果小鼠GMSC高表达CD29、CD44、CD90、CD

23、105,最高的表达率达90% 及以上，CD73最高表达率高于70%, CD39最高表达率为26. 3%,同时 结果显示所提取细胞几乎不表达CD34、CD45,表达率均低于5%,说 明所提取的细胞纯度较高。以小鼠口腔黏膜上皮细胞为对照细胞，可 见 GMSC 的 CD29 (t=2. 686, P=0.036)、CD44 (t=22. 582, P0. 001). CD73(t=3. 183,P=0. 019)、CD90(t=62. 944,P0. 001)、CD105(t=8. 590, P0. 001). CD39 (t=5, 799, P0. 001)的表逵均高于对照细胞,两者 CD34 (

24、t= 1.572, P=0.140)、CD45 (t=-1.643, P=0. 151)表达相似， 见图3O四、小鼠GMSC的成脂言秀导及鉴定结果小鼠GMSC经成脂诱导液培养21d后，分化为脂肪细胞并分泌出脂滴， 经油红0染液染色后，在光学显微镜下可见葡萄串状红色脂滴形成, 见图4。五、小鼠GMSC的成骨诱导及鉴定结果小鼠GMSC经成骨诱导液培养后，细胞逐渐从长纺锤形变为多边形， 并呈多层覆盖生长，可见陆续出现小的钙化。成骨诱导28d后，小鼠GMSC经茜素红染液染色后可见红褐色钙化结节，见图5。讨论近年来，GMSC在自身免疫性和炎症性疾病中的抗炎和免疫调节作用 越来越受到重视17。与其他组织来

25、源的MSC相比，GMSC具有易于 分离、便于获取、增殖快、不具致瘤性、同源性好、免疫调节作用及 再生功能强于其他MSC等优点18-20 o目前，小鼠等动物GMSC的提取方法为组织消化法或组织块法：组织 消化法使用胶原酶和分离酶消化分离的组织块，再通过过滤器获得单 细胞悬液进行种板，操作步骤繁杂，且多种酶的消化易对原代GMSC 造成损伤，导致细胞提前分化失去其生物学特性;组织块法则将冲洗 无菌的组织块直接种板，通过倒立培养瓶的方法获取原代细胞，该法 提取细胞数量少、效率低且成功率不稳定15。本研究将2种提取原代GMSC的方法相结合并加以改良，对分离的牙 龈组织仅用IV型胶原酶消化半小时，然后把消

26、化后的牙龈组织直接种 板，23d后可见细胞爬出。由此可见该改良方法具有以下优点： 步骤过程简单、易操作;仅用一种消化酶，减短了消化时间，不仅 减少了消化酶对原代细胞的损伤，而且节约了试剂成本;经胶原酶 处理的牙龈组织变软后再进行种板，更有利于种板后GMSC从组织中 爬出，短时间内有较高的细胞获得率，节约时间成本，同时通过换液、 传代可进一步纯化细胞;培养液成分更为简单。与组织消化法及组 织块法相比，新的提取GMSC方法更为简便、易行，见表1。本研究中小鼠GMSC生长曲线从一定程度上可反映GMSC的增殖规律, 第34日增殖活跃，第5日始增殖进入平台期，第78日由于培养 时间过长细胞生长过密，细胞

27、开始出现凋亡，数量有少许下降。本研 究所提取的细胞高表达CD29、CD44、CD90、CD105,最高表达率均高 于90%, CD73最高表达率高于70%,基本不表达造血细胞的细胞表面 标志物CD34、CD45,最高表达率均低于5%,符合GMSC细胞标志物特 性，同时提示所取取的细胞纯度较高。多向分化诱导实验中，小鼠 GMSC在各自特定诱导条件下成功分化成对应组织，证实了 GMSC的多 向分化功能。本研究表明，改良法提取的GMSC具有快速增殖的优点， 同时通过该法所分离的细胞有较高的纯度，且能表现多向分化的干细 胞特性，因此该法提取GMSC是可行的。对GMSC的相关研究表明，GMSC在伦理学、

28、获取方法和分化潜能等方 面具有明显优势，被认为是一种较好的MSC来源，在细胞治疗、再生 医学等方面具有重要的研究意义21-22 o本研究的动物GMSC提取技 术的研究与改良有助于促进各类疾病动物模型GMSC的自体移植的实 现，有利于深入研究GMSC对疾病治疗作用的可能机制。参考文献,1SuW ,WanQ ,HuangJ ,etaL Cu11uremediumfromTNF-a -stimulatedmesenchymalstemcells attenuatesallergicconjunctivitisthroughmultipleantiallergic mechanisms. JAller

29、gyClinlmmunol, 2022, 136 (2)： 423432.e8. 2FanXL ,ZengQX ,LiX ,etal. Inducedpluripotentstemcell-derivedmesenchymalstemcells activatequiescentTce11sandelevateregulatoryTcellresponsevia NF-k Binallergicrhinitispatients. StemCellResTher,2022,9(1)： 170.3SuW,LiZ,JiaY,etal. microRNA-21a-5p/PDCD4axisregulatesmesenchymalstenicell- inducedneuroprotectioninacuteglaucoma. JMolCellBiol, 2022, 9(4)： 289-301.4ShinJY , ParkHJ , Ki