丙戊酸钠抑制HL60细胞增殖并诱导其凋亡与分化

1、丙戊酸钠按捺HL-60细胞增殖并诱导其凋亡与分化韩冬梅，陈协群，梁蓉，董宝侠，尹文【摘要】为进一步研究丙戊酸钠sdiuvalprate；VPA对白血病细胞HL-60的增殖、凋亡和分化的影响，接纳TT法检测差异浓度的VPA对HL-60细胞增殖的作用；细胞化学染色法不雅察药物作用后细胞形态的变革；NBT复原实行结合形态学作为不雅测细胞分化指标；应用流式细胞术检测差异浓度药物作用后细胞周期的变革及凋亡细胞的比例。效果表现：VPA能显着按捺HL-60的增殖；经2l/LVPA处置惩罚24-48小时后，HL-60出现胞浆空泡、核固缩、核碎裂及凋亡小体；AnnexinV阳性的早期凋亡细胞比例由2.9%升高到

2、17.1%；流式细胞术检测出显着的亚二倍体峰；G1期细胞由51.1%增长至84.6%，S期细胞由37.9%减低至14.4%。0.25l/LVPA作用1周后，促进HL-60细胞向中幼粒、晚幼粒阶段分化，NBT阳性细胞百分率为472%。结论：VPA能显着按捺白血病细胞HL-60的增殖，并诱导其分化及凋亡。【关键词】丙戊酸钠InhibitinfPrliferatinandIndutinfApptsisandDifferentiatinfLeukeiellLineHL-60bySdiuValprateAbstratTinvestigatetheinfluenefsdiuvalprate(VPA)npr

3、liferatin，apptsisanddifferentiatinfHL-60ellline，effetfVPAinvariusnentratinsnprliferatinfHL-60ellsasdetetedbyT；right-GiesastainingasperfredtbservetherphlgihangesfHL-60ells；NBTexperientasusedttestthedifferentiatinfHL-60ells；flytetryasusedtbserveellylesandanalyzetheapptsis.Theresultsindiatedthatthehang

4、esfthegrthurveshedinhibitinfprliferatinfHL-60ells.Aftera24-48hursultureith2l/LVPA，theellsexhibitednulearshrinkage，pyknsisfragentatinandappearenefapptsisbdies.TheperentageftheannexinV+/PI-ellshihereappttiinreasedfr2.9%t17.1%；hypdiplidpeakasbserved；theperentagefHL-60ellsinG1phaseinreasedfr51.1%t84.6%a

5、ndtheellsinSphasedereasedfr37.9%t14.4%.Afteraeekultureith0.25l/LVPA，theellsexhibitedharateristisfdifferentiatin.TheperentagefNBTpsitiveellsas(472)%.ItisnludedthatVPAaninhibittheprliferatinfHL-60ellshileinduingdifferentiatinandapptsisftheseells.Theehanisneedstbefurtherstudied.Keyrdssdiuvalprate；HL-60

6、ell；ellprliferatin；ellapptsis；elldifferentiatin组卵白脱乙酰基酶histnedeaetylase，HDA按捺剂在体外对付多种肿瘤细胞系有按捺细胞增殖、诱导凋亡及分化的作用。HDA按捺剂对肿瘤细胞有选择性细胞毒性，而对正常造血细胞无严峻毒性，且与多种现有化疗药物有协同作用1，在比来HDA按捺剂已经开始I/II期临床试验。丙戊酸钠(sdiuvalprate，VPA)是治疗癫痫的一种传统药物，毒副作用较校比来创造，其在药理学程度有着HDA按捺剂的特性性作用，可诱导肿瘤细胞分化与凋亡2。本试验以急性髓性白血病细胞HL-60为靶细胞，进一步探究VPA对白血病

7、细胞增殖、凋亡和分化的影响。质料和要领试剂VPA由连云港制药厂消费，西京病院药剂科惠赠，纯度99.4%，分子式为8H15Na2，以去离子水配制成0.4l/L浓度，过滤分装，贮存于-20。小牛血清购自民海生物工程。四氮唑蓝TT、佛波酯TPA为Siga公司产物。硝基蓝四氮唑NBT为华美生物工程公司产物。实行要领细胞造就急性髓性白血病细胞系HL-60泉源于AT，由第四军医大学病理学教研室惠赠。细胞造就于含10%灭活小牛血清的RPI1640造就液含青霉素、链霉素各0.1U/L中，置5%2饱和湿度、37造就箱中悬浮造就，2-3天换液1次，实行用细胞处于对数生恒久。TT比色试验取对数生恒久HL-60细胞接

8、种于96孔板，每孔接种1500个细胞。按照预实行设VPA浓度为4、2、1和0.5l/L，在雷同实行条件下，处置惩罚组中细胞别离参加差异浓度的VPA。每个浓度设4个平行孔，别离于加药后2、3、4、5、6天检测，于每次检测前4小时每孔参加TT溶液5g/l20l；37继承孵育4小时，然后停顿造就，离心、弃上清，每孔参加150lDS，充实溶解结晶物；此后选择492n波长在酶联免疫检测仪上测定各孔光汲取值，记载效果。试验重复3次，取均匀值。以时间为横坐标，光汲取值D为纵坐标，绘制生长曲线细胞形态学查抄2l/LVPA处置惩罚HL-60细胞2天，0.25l/LVPA处置惩罚HL-60细胞1周后，别离网络细胞

9、悬液，离心，PBS液洗涤，甩片，通例right-Giesa染色，光镜下不雅察细胞形态。NBT复本来领测定HL-60细胞在分化诱导剂的作用下能成熟分化。分化细胞中的过氧化物酶能使外源性的NBT复原成难溶性的紫色结晶物，并冷静于细胞内有酶活性的部位，显微镜下可见阳性细胞有着色斑，未分化细胞那么呈NBT反响阳性。本试验以0.25l/LVPA处置惩罚HL-60细胞，375%2造就箱继承孵育，2-3天换液加药1次；1周后网络细胞，每管参加0.1%NBT溶液0.5l和TPA200ng，37孵育1小时；取细胞悬液甩片，right-Giesa染色后计数200个活细胞，胞质中蓝紫色沉淀者为NBT反响阳性细胞，计

10、数阳性细胞百分数，试验重复3次，取均匀值。流式细胞术AnnexinV是一种a2+依靠性磷脂结合卵白，能与细胞凋亡历程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。碘化丙锭PI是一种核酸染料，将Annexin-V与PI匹配利用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。正常细胞Annexin-V-PI-，早期凋亡细胞Annexin-V+PI-，晚期凋亡细胞和坏死细胞Annexin-V+PI+。本试验用2l/LVPA处置惩罚HL-60细胞24小时，取细胞悬液各1l1106个细胞，PBS洗2次，离心弃上清，Annexin-V、PI避光染色20分钟，用ELITEESP流式细胞仪Fulter公

11、司检测凋亡百分比；2l/LVPA处置惩罚HL-60细胞48小时，网络细胞2106个细胞，预冷PBS洗2遍，离心弃上清后参加1lPBS、2l无水乙醇4结实留宿，参加DNA-Prepstain染液后，同一仪器检测各组细胞的荧光强度，每份样品检测约5000细胞，用DNAultiyle软件Bekanulter举行统计学阐发，得到各组细胞周期时相。试验重复3次，取均匀值。统计学阐发应用SPSS10.0处置惩罚数据，组间率的比力接纳Yates一连校正卡方查验，=0.05。效果VPA对HL-60细胞生长曲线的影响实行表现4、2、1和0.5l/LVPA对HL-60细胞均有差异程度的增殖按捺作用图1。VPA对H

12、L-60细胞分化的影响0.25l/LVPA作用1周后，出现核染色质浓缩，核仁消散，HL-60细胞向中幼粒细胞、晚幼粒细胞分化，偶见杆状核和分叶核图2。经0.25l/LVPA作用1周后，实行组NBT阳性率为47%2，比较组为21%6，两组间有明显性差异(P0.001)。VPA对HL-60细胞凋亡的影响2l/LVPA作用48小时后，光学显微镜下不雅察可见：胞浆中大量空泡样改变，出现核固缩、核碎裂及凋亡小体图3。VPAfr24hursVPA对HL-60细胞周期的影响经2l/LVPA处置惩罚48小时后，G1期细胞由51.1%增长至84.6%，S期细胞由37.9%减低至14.4%P0.001，且出现显着

13、的亚二倍体峰，凋亡细胞占32.6%图5。讨论比年来研究创造，HDA按捺染色质布局非常调治所致的髓系分化相干基因表达，是急性髓系白血病发病的紧张因素之一。已有多种HDA按捺剂已经进入I期或II期临床试验，在治疗血液体系恶性肿瘤和实体瘤方面都有令人煽动的相干报道3-5。VPA不停以来用于癫痫的治疗，毒副作用较校它是短链脂肪酸的一种，也属于HDA按捺剂。如今，外洋有研究创造VPA通过半胱天冬酶依靠和非依靠两种途径导致白血病细胞凋亡6，而对正常造血细胞没有严峻毒性，有大概用于抗肿瘤治疗；同时VPA对P-gp和或RP1阳性的急性髓系白血病细胞同样存在按捺增殖和促凋亡作用1，以是VPA大概会对多药耐药细胞也有作用。别的，Kuendgen等7单用VPA治疗19例DS和继发于DS的AL，此中有8例显效。以是VPA是一个具有应用远景的药物。但是，VPA用于白血病治疗的临床试验还未见报道，并且VPA治疗白血病的作用机制及其临床疗效尚待进一步研究。为了进一步明白VPA的抗白血病作用，为VPA应用于临床治疗白血病提供有力的证据，我们以HL-60细胞为靶细胞，不雅察VPA对HL-60细胞增殖的影响和诱导凋亡、分化作用，TT法证明VPA对HL-60细胞具有增殖按捺作用，2l/LVPA作用于细胞，