细胞工程学习指导-供参考

1、一、基本概念或术语：1、细胞工程,指在细胞水平上进行的遗传操作，即研究、开发、利用各类细胞的工程2、细胞培养 是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。3、细胞融合技术 两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。4、植物组织培养 是在离体人工调控的条件下，培养、研究植物细胞、组织、器官，进而分化、发育形成完整植株的技术。5、外植体 是指能被诱导产生无性增殖系的器官或组织切段，如一个芽，一段茎。7、细胞固定化 是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。8、植物细胞原生质体 是指去除全部细胞壁后剩下的仅由细胞膜及其包裹

2、着的细胞内含物质的总称，呈圆形，具有渗透破碎性，要在高渗液中才能维持其相对稳定。9、单倍体生物 是指细胞中仅含一组染色体的个体。10、孤雌繁殖途径 植物卵细胞不经受精而发育成单倍体胚，继而长成单倍体植株。11、孤雄繁殖途径 精子进入胚囊后不与卵细胞受精而独自发育成单倍体胚，再发育成株，卵细胞退化消失。12无融合生殖 精卵结合后，在受精卵发育的同时，助细胞或反足细胞也与受精卵形成的二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子。13、人工种子 即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。14、人工种皮 是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允

3、许内外气体交换畅通，又能防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏，还应具备一定的机械抗压力。15人工胚乳 是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主要成分，再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。16胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构，并具有萌发长成植株的能力。17、动物细胞工程 是细胞工程的一个重要分支，它主要从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需要，一方面深入探索、改造生物遗传种性，另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞或动物本身，以期收获细胞或其代谢

4、产物以及可供利用的动物。18、动物细胞培养 指的是离体动物细胞在无菌培养条件下的分裂、生长，在整个培养过程中细胞不出现分化，不再形成组织。19、动物组织培养 是取自动物体的某类组织，在体外培养时细胞一直保持原本已分化的特性，该组织的结构和功能持续不发生明显变化。20、微细胞 也叫微核体，它们由一至几条染色体、少量细胞质和完整的细胞膜包裹而成。微细胞介导的染色体转移由于供体信息简单、受体细胞被影向小、染色体受到细胞膜的保护而较少受物理、化学因素和胞内核酸酶的降解，不受或很少受损伤，成功率较高，因而已成了细胞株之间转移遗传信息的重要手段。21、干细胞(stemcell) 是动物(包括人)胚胎及某些

5、器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。二、基础知识1、根据研究操作的对象不同，细胞工程又可分为三类，即植物细胞工程；动物细胞工程；微生物细胞工程。2、细胞工程操作的主要对象是细胞。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。3、细胞融合的主要过程：制备原生质体；诱导细胞融合；筛选杂合细胞。4、20世纪初，德国植物学家Haberlandt就曾预言“植物细胞具全能性”。5、植物组织培养一般要经历以下五个阶段：预备阶段诱导去分化阶段继代增殖阶段生根发芽阶段移栽成活阶段。6、常见的固定化细胞培养系统有以下两大类：平床培养系统；立柱培养系统。7、植物

6、细胞原生质体的制备步骤：取材与除菌酶解处理分离洗涤鉴定。8、人工诱导原生质体融合的方法：化学法诱导融合、物理法诱导融合。9、1921年，Bergner首次在高等植物曼陀罗发现了单倍体植物。10、1924年，Blakeslee等提出了在育种中培植利用单倍体生物，然后加倍获得正常二倍体植株的的技术路线设想。11、1964年，Guha等率先人工诱导毛叶曼陀罗单倍体株成功。12、自发产生单倍体通常经有以下发育途径：孤雌繁殖途径；孤雄繁殖途径；无融合生殖。13、人工种子的结构人工种皮；人工胚乳；胚状体。14、制备人工种子的核心问题是诱导胚状体的同步化生长。15、褐藻酸钠是目前最好的人工种子包埋剂，其次是

7、琼脂、白明胶等。16、1975年，Kohler和Milstein巧妙地创立了淋巴细胞杂交瘤技术，获得了珍贵的单克隆抗体，在免疫学领域取得了重大突破。17、1997年，英国Wilmut领导的小组用体细胞核克隆出了“多莉(Do1ly)”绵羊，把动物细胞工程推上一个新台阶。18、专用于大量培养哺乳动物细胞设计的三种方法：微导管培养法；微载体培养法；微胶囊培养法。19、动物细胞融合有以下三条途径：病毒诱导融合；化学诱导融合；电激诱导融合。20、哺乳动物和人体内主要有两类淋巴细胞：T细胞和B细胞。前者能分泌淋巴因子(如干扰素)，发挥细胞免疫的功能；后者能分泌抗体，具有体液免疫的作用。21、20世纪50年

8、代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)，从此开创了干细胞生物学研究的历程。22、1970年，Evans分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。23、1997 年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。24、干细胞基本上可分为三种类型：全能性干细胞（即胚胎干细胞）；多能性干细胞；专一性干细胞。25、开展干细胞研究一般要经过以下三个阶段：获得干细胞系；建立干细胞诱导分化模型；将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。三、判断能力1、细菌、放线菌等

9、的细胞属于原核细胞。原核细胞体积较小，DNA环状、不与蛋白质结合而裸露于细胞质中。胞内无膜系构造的细胞器。胞外由肽聚糖组成细胞壁，是细胞融合的主要障碍。原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA，易于人工遗传操作，是细胞改造的良好材料。2、酵母、动物、植物等的细胞属于真核细胞。真核细胞体积较大、内有细胞核和众多膜系构造的细胞器。植物细胞有以纤维素和半纤维素为主要成分的细胞壁。真菌细胞壁主要由各种葡聚糖构成网状纤维物，还有甘露聚糖、蛋白质和脂质填充其中。真核细胞一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也难于插入外源基因。诱导真核细胞同步化生长，对于成功地

10、进行细胞融合及细胞代谢物的生产具有重要作用。3、同一植物不同部位的外植体的分化能力；植物胚与幼龄组织、器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量愈伤组织；不同物种相同部位的外植体细胞分化能力可能大不一样。4、组织培养的第一步就是让外植体去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，培养基中一般应添加较高浓度的生长素类激素。去分化阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。但通常还是置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。5、去分化可以采用固体培养基(在培养基中添加琼脂0.81.0)或液体培养基。固体培养简便易行、占地面积小、可在培养室中多层培养。但外植体营养吸收

11、不均、气体及有害物质排换不畅，愈伤组织易出现极化现象。液体培养中，培养材料营养吸收及与环境的物质交换便捷，但需提供振荡设备，投资较大，且一旦染菌则难以挽回。6、将愈伤组织移置于含适量细胞分裂素，没有或仅有少量生长素的分化培养基中，诱导胚状体的生成。光照是必备的外部因子。根据实验需要，有时可不经愈伤组织阶段而直接诱导外植体分生、分化长成一定数量的丛生芽，然后再诱导其生成根。7、自然界中偶尔也能见到天然诱发的单倍体植株。自发产生单倍体植株的机率很低，小于千分之一。自发产生单倍体通常经有以下发育途径：孤雌繁殖途径 植物卵细胞不经受精而发育成单倍体胚，继而长成单倍体植株。孤雄繁殖途径 精子进入胚囊后不

12、与卵细胞受精而独自发育成单倍体胚，再发育成株，卵细胞退化消失。无融合生殖 精卵结合后，在受精卵发育的同时，助细胞或反足细胞也与受精卵形成的二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子。通过人工诱导，可以培育出大量符合需要的单倍体植株，用于育种。8、花药由花药壁和花粉囊构成。经过适当的诱导，花粉囊中的花粉(单倍体)可能去分化而发育成单倍体胚或愈伤组织，最终形成花粉植株。花药培养基大体有两种类型。对多数植物而言，在愈伤组织培养基中一般已添加适量的生长素类激素，如 2，4-D、奈乙酸或吲哚丁酸等，花药可以在这种培养基中去分化而长成愈伤组织，但通常不会长成单倍体植株；但有些植物，如烟草、曼陀罗等则只

13、需在简单的蔗糖和无机盐培养基上即可完成从花粉去分化、单倍体胚的形成乃至单倍体植株的长出这一完整的过程。无论哪种情况，在培养基中加入适量的脯氨酸或羟脯氨酸，对促进单倍体愈伤组织的形成都有明显的作用。9、通过培养植物的花粉可获得单倍体植株。1974年Nitseh等首创用挤压法分离花粉进行培养的方法。1977 年，Sunderland 等提出了自然散开法收集花粉的方法。花药培养时一些二倍性的花药壁细胞亦形成愈伤组织，从而增加了培育单倍体植株的难度。虽然用花药与花粉培养单倍体植株目前都已取得长足的进展，但白化苗出现过多仍是亟待解决的问题。10、人工种子是21世纪极具发展潜力和经济价值的高科技成果，由三

14、部分构成：人工种皮 是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允许内外气体交换畅通，又能防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏，还应具备一定的机械抗压力。人工胚乳 是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主要成分，再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构，并具有萌发长成植株的能力。11、动物细胞与组织培养的各个环节，都应十分重视灭菌与无菌操作。一旦发生染菌或交叉感染，抢救工作相当麻烦，而且还不一定能成功。对一般性细菌污

15、染可试用氨苄青霉素(终浓度 200?gmL)或链霉素(终浓度 200?g/mL)除菌。霉菌感染，除小心地铲除菌落(丝)外，还应在培养基中加制霉菌素达100UmL 以抑杀散落的孢子、菌丝。支原体的感染令人棘手，即使以100?gmL的卡那霉素处理后也只能抑制其繁衍而未能根除。有人建议用庆大霉素或去污剂加以清除。一般性的病毒侵染不一定得兴师动众加以围剿，因为它们在正常情况下不大影响细胞的生理功能和实验结果。细胞系、株之间的交叉污染是一个值得重视的问题。在一个工作区内不能同时放置两种以上细胞株，除非由于细胞融合等工作需要的暂时存放。同时，两种细胞株不能共享培养器具，即使器具消毒后也是如此。12、哺乳动

16、物和人体内主要有两类淋巴细胞：T细胞和B细胞。前者能分泌淋巴因子(如干扰素)，发挥细胞免疫的功能；后者能分泌抗体，具有体液免疫的作用。由于外环境纷繁复杂，千差万别的抗原诱使B淋巴细胞群产生的抗体高达数百万种。不过每个B淋巴细胞都仅专一地产生、分泌一针对某种抗原决定簇的特异性抗体。要想获得大量专一性抗体，就得从某个特定B淋巴细胞培养繁殖出大量的细胞群体，即克隆。如此克隆出的细胞其遗传特性高度一致，由它们分泌出的抗体即叫做单克隆抗体。但目前还没有办法使 B 淋巴细胞在体外无限地分裂繁殖。肿瘤细胞，特别是癌细胞具有无限增殖的特性。如被称为“海拉”(HeI_a)的癌细胞是从一位叫做HenriettaL

17、akes的病人身上取下的。尽管Lakes早在1951年已经病逝，但她的癌细胞却以繁殖迅速的特点传遍世界，至今未见衰退。为了充分利用单克隆抗体纯度高、专一性强的优点，1975年Kohler和Milstein将肿瘤细胞融合，终于获得了既能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞，在生物医学领域做出了重大贡献，由此荣获1984年诺贝尔生理学与医学奖。四、问答题1、生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。试述二者的差别。原核细胞 细菌、放线菌等的细胞属于原核细胞。原核细胞体积较小，DNA环状、不与蛋白质结合而裸露于细胞质中。胞内无膜系构造的细胞器。胞外由肽聚糖组成细胞壁，是细胞融合的主要障碍。原核细胞

18、生长迅速，无蛋白质结合的DNA，易于人工遗传操作，是细胞改造的良好材料。真核细胞 酵母、动物、植物等的细胞属于真核细胞。真核细胞体积较大、内有细胞核和众多膜系构造的细胞器。植物细胞有以纤维素和半纤维素为主要成分的细胞壁。真菌细胞壁主要由各种葡聚糖构成网状纤维物，还有甘露聚糖、蛋白质和脂质填充其中。真核细胞一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也难于插入外源基因。诱导真核细胞同步化生长，对于成功地进行细胞融合及细胞代谢物的生产具有重要作用。2、细胞培养技术细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。不同细胞的培养条件差异较大，但

19、细胞培养过程有共同之处：取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒。有时还需借助某些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。培养基的配制。根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。接种与培养。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中，置于培养室或培养箱中，提供细胞生长所需的最佳培养条件，如温度、湿度、光照、氧气及二氧化碳等。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。3、细胞融合技术两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合

20、的主要过程：制备原生质体 由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。诱导细胞融合 两亲本细胞(原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙二醇(PEC)等诱导融合，或用电激的方法促进融合。筛选杂合细胞 将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。4、原生质体的制备取材与除菌酶解处理分离洗涤鉴定。取材与除菌 原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣，因为由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高

21、。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗23次，然后浸入70酒精消毒后，再放进3次氯酸钠处理。酶解 由于植物细胞的细胞壁含纤维素、半纤维素、木质素以及果胶质等成分，因此市售的纤维素酶实际上大多是含多种成分的复合酶，如中科院上海植物生理研究所生产的纤维素酶EA3-867和日本产的OnozukaR10就含有纤维素酶、纤维素二糖酶以及果胶酶等。此外，直接从蜗牛消化道提取的蜗牛酶也有相当好的降解植物细胞壁的功能。分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组

22、织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取200400目的不锈钢网或尼龙布进行过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。洗涤 刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤24次。鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也可用荧光增白剂染色后置荧光显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光.通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分率。此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色

23、、胞质环流观察以及测定光合作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。5、人工种子的构成及特点人工种子的结构人工种子由以下三部分构成：人工种皮 是包裹在人工种子最外层的胶质化合物薄膜。这层薄膜既能允许内外气体交换畅通，又能防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏，还应具备一定的机械抗压力。人工胚乳 是人工配制的保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以生成胚状体的培养基为主要成分，再根据人们的需要外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等物质，尽可能提供胚状体正常萌发生长所需的条件。胚状体 胚状体是由组织培养产生的具有胚芽、胚根等类似天然种子胚的结构，并具有萌发长成植株的能力。人工种子的特点人

24、工种子的优点 可以不受环境因素制约，一年四季进行工厂化生产；由于胚状体是经人工无性繁育产生，因此有利于保存该种系的优良性状；与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利于胚状体的健康生长。人工种子的缺点:人工种子的研制仍有一些关键技术尚未攻克。如：人工种皮的性能尚不尽人意；还未找到一种符合多数物种需要的人工胚乳；胚状体如何让它处于健康的休眠状态；人工种子怎样做到既延长其保存时间又不明显降低萌发率等。6、人工种子的制备胚状体的制备及其同步生长通过外植体的固体培养基培养，液体培养基的悬浮细胞培养以及花药、花粉的诱

25、导培养都可获得数量可观的胚状体。但这些胚状体往往处于胚胎发育的不同时期，不符合大量制备人工种子的需要。因此诱导胚状体的同步化生长成了制备人工种子的核心问题。采取以下措施可促进胚状体的同步生长：低温法：在细胞培养的早期对培养物进行适当低温处理若干小时。由于低温阻碍了微管蛋白的合成，纺锤体形成受阻，所以滞留于有丝分裂中期的细胞增多。此时再让培养物回复到正常温度，细胞则同步分裂。抑制剂法：细胞培养初期加入DNA合成抑制剂，如5氨基尿嘧啶等，使细胞生长基本上都停顿于Cl期。除去抑制剂后，细胞进入同步分裂阶段。分离法：在细胞悬浮培养的适当时期，用一定孔径的尼龙网或钢丝网或密度梯度离心法，收取处于胚胎发育

26、某个阶段的胚性细胞团，然后转移到无生长素的培养基上，使多数胚状体同步正常发育。通气法：有人发现，在细胞悬浮培养液中每天通人氮气或乙烯12次，每次几秒或更长时间，可显著提高有丝分裂同步率。渗透压法：随着植物胚状体的发育，其渗透压值呈现规律性的从高到低的变化。我们可配制一定渗透压值的培养基而使胚状体的发育停留在指定的阶段(如向日葵球形胚的渗透压为175)，从而达到同步发育的目的。控制细胞及胚状体的同步化生长是一个尚未完全解决的问题。除了上述提出的外因干预以外，物种及不同外植体细胞的敏感性，对实现同步生长也有很大影响。经过实验摸索才可能成功。刚收获的胚状体含水分很高，不够成熟，亦难以储存。一般应经自

27、然干燥47天，使胚状体转为不透明状为宜。人工胚乳的制备人工胚乳的营养需求因种而异，但与细胞、组织培养的培养基大体相仿，通常还要配加一定量的天然大分子碳水化合物(淀粉、糖类)以减少营养物泄漏。常用人工胚乳有MS(或SU、White)培养基+马铃薯淀粉水解物(15)；05XSH 培养基+麦芽糖(15)等。尚可根据需要在上述培养基添加适量激素、抗生素、农药、除草剂等。配制包埋剂及包埋褐藻酸钠是目前最好的人工种子包埋剂，它无毒、使用方便，具有一定的保水、透气性能，价格较低，经CaCl2离子交换后，机械性能较好。其次是琼脂、白明胶等。通常以人工胚乳溶液调配成4的褐藻酸钠，再按一定比例加入胚状体，混匀后，

28、逐滴滴到2025CaCl2溶液中(图3-5)。经过1015min的离子交换络合作用，即形成一个个圆形的具一定刚性的人工种子。而后以无菌水漂洗20min，终止反应。捞起晾干。为了克服人工种子易于沾黏和变干的缺点，美国杜邦公司以一种称为nVax4260的涂料对人工种子进行表面处理，效果较好。此外5CaC03或滑石粉对抗黏也有一定效果。以上所述滴液法获得的人工种子，其直径随滴管口径的大小而定；每颗种子内含胚状体：海藻酸钠田胞胚水数目主要取决于包埋剂中胚状体的密度；人工种皮的厚度则随人工种子在CaCl2溶液中离子交换时间的长短而定，一般掌握在10-15rain。种皮太厚，不利于胚状体萌发；种皮太薄，则

29、在贮存、运输以及播种过程中都会遇到麻烦。7、人工种子的贮存与萌发人工种子的贮存与萌发是迄今尚未攻克的难关。一般要将人工种子保存在低温(47)和干燥(相对湿度小于67)条件下。有人将胡萝卜人工种子保存在上述条件下，两个月后的发芽率仍接近100。但这种贮存方式的费用是昂贵的。在自然条件下人工种子的贮存时间较短，萌发率较低。柯善强(1990)报道，尽管在人工种皮中加入了防腐剂，他们研制的黄连人工种子在未消毒土壤中的萌发率仍仅为4452。桂耀林(1990)的刺五加人工种子的萌发率为1420，但在无菌土壤条件下则高达90以上。的细胞融合率还比较低，重复性不够高，所以近年来已不多用。8、淋巴细胞杂交瘤技术

30、的基本原理：实验前数周分次用特异抗原免疫实验动物(如小鼠)，使其脾内产生大量处于活跃增殖状态的特异B细胞。杀鼠取脾制得含有大量B细胞的脾细胞后，将鼠骨髓瘤细胞和脾细胞以聚乙二醇(PEG)法进行细胞融合。杂合细胞的选出是本技术的关键。B细胞天然地不能在体外增殖，而骨髓瘤细胞是所谓的HGPRT基因缺陷细胞，因此只有从淋巴细胞获得HGPRT基因等因子的骨髓瘤细胞才能在HAT选择培养液中生长。由于脾中含有很多种B细胞，融合后也必然产生很多种杂合细胞，因此必须对筛选得到的杂合细胞高度稀释后进行单细胞培养，即所谓的“单克隆”。待其增殖成一个细胞群体(克隆)后，用特异技术分别检测它们产生的抗体，从中挑出能产

31、生所需单一性抗体的杂合细胞，即杂交瘤细胞，这就是所谓的二级筛选法。此外还应注意，杂交瘤细胞是准四倍体细胞，遗传性质不稳定，随着每次细胞有丝分裂，都可能丢失个别或部分染色体，直到细胞呈现稳定状态为止。因此在建立杂交瘤细胞系的过程中要经常检查，存优汰劣。获得较稳定的单克隆杂交瘤细胞后，可将它们注射人哺乳动物(如小鼠)腹腔，然后从腹水中分离、提取单克隆抗体；或者将它们移到培养瓶或生物反应器中培养，再从培养液中回收产生的抗体。淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体的技术方兴未艾，必将在21世纪得到更大的发展。9、干细胞生物学研究生老病死是自然界不可违抗的规律。人的死亡往往并不是全身各器官的功能都同步衰竭造成的，

32、而是由于个别重要器官“难以胜任”，导致机体代谢紊乱所引起的，如肾功能衰竭引发尿毒症等。如果能更替这些受损的器官，我们就可以延年益寿。20世纪50年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)，从此开创了干细胞生物学研究的历程。1970 年，Evans 分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。接着，科学家直接从病人的身上提取某种特殊的细胞使之长成皮肤、骨骼和软骨，甚至是重要器官的一部分，这些特殊的细胞就是干细胞。1997 年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。干细胞(ste

33、mcell) 是动物(包括人)胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化发育成为人体全部206 种组织和细胞，甚至形成完整个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞、组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成至少十二种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。还有一类

34、干细胞为专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞等。不过，随着干细胞研究日新月异的飞速发展，最近也有科学家报道专一性干细胞也可能分化为其他类型的细胞和组织。干细胞有以下显著的特点：具有分裂成其他细胞的可能性；具有无限增殖分裂的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。开展干细胞研究一般要经过以下三个阶段：获得干细胞系：这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性(一般应稳定传 25 代以上)；建立干细胞诱导分化模型

35、：可利用基因工程手段引入外源目的基因(对原有致病基因进行置换改造)，探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学或和物理条件；将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。上述干细胞研究不仅操作烦琐而且对实验者的实验技能要求很高。我国徐荣祥教授等另辟蹊径，在皮肤干细胞原位再生方面取得了原创性的重大突破。他们对被烧伤的皮肤进行适当处理后，成功地直接诱导上皮组织基底层的干细胞分化生成皮肤细胞，使受伤的皮肤得以迅速康复。该技术显示我国干细胞研究已率先进入组织和器官的原位干细胞修复和复制阶段。 干细胞巨大的潜在应用价值引起世界许多国家和机构的高度重视，他们投入巨资进行研究，陆续取得

36、了一系列重大的发现，以致1999年12月美国科学杂志将人类干细胞的研究评为当年十大科学成就之首。近年来，干细胞研究取得的部分重要进展。政府、科学家和企业家已经从干细胞的初步研究成果中意识到其中莫大的发展潜力，导致干细胞研究异军突起，势头异常迅猛。我国科学家亦取得不错的业绩。理论上讲，干细胞可以用于治疗各种疾病，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如岛素依赖型糖尿病等。可以预期，不久的将来，人类将可以根据自己的要求“定制”所需的“部件”用于更替坏损或衰老的器官或组织，医治顽疾。从而使人类的平均寿命再向前迈出一大步。应用于细胞治疗疾病和

37、传统方法比较具有如下优点：低毒性(或无毒性)，一次治疗有效；不需要完全了解疾病发病的确切机制；用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。不过，虽然胚胎干细胞具有十分诱人的理论研究和商业开发前景，但通常要毁损早期胚胎才可能获得胚胎干细胞。受精是生命的起点，胚胎是生命的开端。以窒息一个生命的代价去挽救另一个生命是否值得？自从胚胎干细胞在1997年被分离出来后各国政府和科学家就展开了一场激烈的争论。克隆技术给法律、伦理、国家和社会安全等方面带来的冲击是空前的。英国2000年通过了准许在严格管理的条件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究；美国总统布什在2001年8月宣布，美国政府将仅仅支持对已有的胚胎干细

38、胞进行研究；德国不仅只允许研究2002年1月30日以前产生的胚胎干细胞，而且还必须是在没有其他可选择的情况下才能进行。中国对胚胎干细胞研究，即治疗性克隆持支持态度。中国科学院副院长陈竺院士 2002年7月指出：“一个体外的胚胎在有限的时间，如14天里，尚属一般的生物细胞，此时还没有神经细胞和脑细胞的产生，既无知觉也无感觉，因此科学界一般认为它在此时还不是一个道德意义上的人。人类干细胞研究给21世纪医学的革命性发展带来可能，因此总的平衡利弊，还是要支持”。陈竺副院长还强调，在支持的同时还要有严厉的法律、法规来保证这样的技术发展能真正造福人类。在胚胎干细胞研究步履蹒跚时，另一类干细胞，即人成体干细

39、胞研究却如火如荼地开展起来，干细胞产业也应运而生，而且成了各国争夺的又一个热点。2002年美国科学家宣布，从新生儿脐带中提取的脐血干细胞至少可以保存15年，这意味着这些冷冻的干细胞在15年之后仍然可用于治病。这无疑更加坚定了科学家和政府开展人成体干细胞研究的信心。我国第一家获得卫生部执业批准的设有公共库和自体库两部分的脐带血造血干细胞库2002年10月在北京正式宣布建成并投入使用。全球股市中有关干细胞概念股票的价值已经超过300亿美元。在美国，进行脐带血产业化研究的企业已有10家左右。我国2002年底在天津建成了首家可存储50万份干细胞的国家级干细胞产品产业化基地。五、辨析题1、关于克隆人回眸

40、动物克隆史，我们清楚地看到了从利用早期胚胎细胞到成年体细胞的飞跃。在此基础上，克隆人已经不再是科幻小说中的故事了。鉴于担心极少数科学家擅自开展克隆人研究，1997年11月11日，联合国教科文组织第29届大会在巴黎通过一项题为世界人类基因组与人权宣言的文件，明确指出，违背人的尊严，用克隆技术繁殖人的做法是不能允许的。1998年1月12日，欧洲法国、丹麦、瑞典、意大利、挪威、葡萄牙、罗马尼亚和西班牙等19 个国家在法国巴黎签署了一项严格禁止克隆人的协议(EuropeanProtocolonBanningHumanCloning)。这是国际上第一个禁止克隆人的法律文件。这项协议规定，禁止各签约国的研

41、究机构或个人使用任何技术创造与某一活人或死人基因相似的人，否则予以重罚。我国以及美、英、德、日等国政府也已明确表示反对克隆人。中国卫生部宣布，中国对克隆人研1998年初，美国哈佛大学69岁的Hid博士依然宣称，克隆人“只不过是人类生育的另一项先进技术”。他我行我素地宣布，计划把自己的细胞核与捐献者的卵相结合后，再将这个胚胎植入他妻子CroXya的子宫，以期生下他的复制品。2001年1月，意大利世界著名的人类生殖医学专家Antinori和美国肯塔基大学的Chawose教授公开宣布，他们决定实施全球第一个“克隆人”计划。2001年8月，Antinori宣称，他已经挑选了200对自愿者夫妇进行免费克

42、隆人试验。2002 年春，他甚至宣布，第一个克隆人、一位阿拉伯富商的儿子年底即将诞生!2002年12月27日，在世界84个国家拥有55万余名教徒的“雷尔”(Rael)教派下属的“克隆援助”(Clonaid)公司总裁、从未有过动物克隆记录的法国女主教Buwaseleye在美国佛罗里达州宣布“世界上第一个克隆婴儿夏娃(Eve)已经问世”；1月4日又称，世界上第二名克隆婴儿于当地时间3日晚在荷兰诞生。但由于该公司始终拒绝接受所谓的“克隆婴儿”的DNA检测，因此科学家普遍认为这很可能只是一出闹剧。他们除了政治或宗教上的目的外，试图吸引全球媒体注意力，制造轰动效应以牟取商业利益可能也是主要的驱动力之一。

43、潘多拉盒子再次被打开，人类又一次得到了一把双刃剑。1945 年在日本腾空而起的巨大“蘑菇云”杀害了无数的生灵，然而日后的核能利用却极大地造福了人类。现在，尽管科学家已经初步掌握了克隆哺乳动物的技术，但毕竟还不够成熟，成功率还太低。它突出表现为怀孕成功率低；孕期流产率高，可达50以上；围产期死亡率高；新生畜异常发育增多；出生后对环境的适应性较差以及可能早衰等。2002年，美国麻省理工学院的Yenes同夏威夷大学的柳町隆藏用基因芯片观察了克隆鼠的_kYY 个基因，发现有高达数百个基因不正常。这个发现较好地解释了许多克隆动物在出生前和出生时非正常死亡的原因。2003年2月，罗斯林研究所证实，“多莉”

44、羊由于患进行性肺炎已经被实施了“安乐死”。据分析，绵羊通常能活到1112岁，肺炎是老年绵羊常患的疾病。“多莉1996年7月5日出生，迄今未足7岁。它的死亡进一步引发了科学家关于克隆哺乳动物早衰的争论。在这种情况下进行人类的克隆不仅不科学，而且是不道德的。此外有关克隆人的伦理道德规范也是个必须严肃探讨的问题。2、关于人体干细胞的操作生老病死是自然界不可违抗的规律。人的死亡往往并不是全身各器官的功能都同步衰竭造成的，而是由于个别重要器官“难以胜任”，导致机体代谢紊乱所引起的，如肾功能衰竭引发尿毒症等。如果能更替这些受损的器官，我们就可以延年益寿。20世纪50年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现了胚胎干

45、细胞(embryonicstemcell，ES细胞)，从此开创了干细胞生物学研究的历程。1970 年，Evans 分离出小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养。接着，科学家直接从病人的身上提取某种特殊的细胞使之长成皮肤、骨骼和软骨，甚至是重要器官的一部分，这些特殊的细胞就是干细胞。1997 年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。干细胞(stemcell) 是动物(包括人)胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化发育成为人体全部206 种组织和细胞，甚至形成完整个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞、组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成至少十二种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。还有一类干细胞为专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞等。不过，随着干细胞研究日新月