SRSIM超高分辨率显微镜系统操作手册20页

1、SR-SIM超分辨率结构照明镜显微镜系统操作手册SR-SIM 原理：结构照明是一个宽视场技术，其中，受栅格图案的衍射级的干扰， 产生通过在拍照图像的同时叠加在样品上，栅格图案被捕捉的每一个 图像组在步骤之间的移动或旋转。高频信息用反傅里叶算法处置以 后，能够从原始数据中提取以产生一个重建的图像，横向分辨率大约 提高两倍，衍射限制范围在150和300纳米之间的轴向分辨率。SR-SIM超高分辨率显微镜开机步骤:7.打开电脑注意：所有带三角警示标记的保育器开口都要关紧，幸免激光照射！Zeiss SR-SIM 镜头配有 10X/dry、63X/、63X/、100X/ELYRA软件大体操作流程SR-SI

2、M Workflow-Acqisition （图像获取）1）目镜找视野选择 Locate 选项卡4.观察完毕后点击Oculars offline3.选择BF （明场）或者Fset77 （荧光）otijlarfiQrLiine1-fnrwniitcci limAs s i f nFset77为双色滤片，能同时观察 488nm，561nm2）图像获取= AcquisiflQfi Parameterf AtquisittCHn MndeObjectiveFrame Size；1004Plan-Apo 62x/1.4 Oil M271004 x 1002 standardAveragingert De

3、pthMethodMeanO Scan AreaImge Size; 127-4 pm k 127.1盼日成. 3 notations3 Rotattons Chi5 RoratlansReset AirZSFuwiil1.选择需要的图像分辨率2.选择需要的rotation ,般选5次, ChainnEhTmcta IChmneliTiracklTV18.选择相应的伪彩Track Configuraoi “.t definedTrackl-SIMLasers 4105561 M2o FOVEwpcrsure nrne msjEMCCD SainCannera _femipe旧 tune-63.

4、0 aC9.如有多通道可通过点击加号增加通道，每个通道重复步骤1-81.选择相应的激发波长2.通常设置激光强度为2,并在此基础上调节3.曝光时间为100ms ,并在此基础上调节4. EMCCD增益(EMCCD Gain)为40，并在此基础上 调节10.温度提示为红色时，仪器不能使用。等仪器降至相应温度方可使用注意：通常405nm的激光需设置较高的参数!7.手动选择所需的滤片（系统不会自动选择）3）获取三维图像1.选择 CenterCenterFirst/LestRang-e51山IntervalSmallestKeepCenterOffset5 Use Piezo1.73200.09L6.选择

5、需要的张数，一般为AFOFind Focus Set Exposure* Z-Stack21 Slioe5Time Series0.091 punInterval Tsiice13Q-.30:-l.ao:10-215.点击Smallest数值4.点击 Interval2.将图像调节至焦平面，点3.点击向下箭击 Center头EOlLive Cantinuous SnapB , Start Experiment7.点击 StartWorkflow - Processing （图像处置）1.点击 ProcessingI ZEN 2010 D2.选 择 StructuredIllumination,

6、点击右边的小三角，以展开条目.扣_】BKJB LocateAcquisitionFCSProcessing MirkUinlle iflew Acquisition Malntaini Macro Tools windowJApplyMethodrturt- vmugiiiigStntch卜 PALMParticle Tracklriifij Stru-ctu red lllummaticnStructured llluminBtloinTIRF- FilteredExperirnBrital PSFFourle-rTrariisfornnChannel AlignmentDeconvol u

7、tion Copy* ICSMethod ParametersInput Ern-ageSelsctRun BatchFlirt - lest *ii :Processing Automatic / Mode 3D 叩Output SR-SIM + Wide FieFd nrr. hiirnr-r.3.最亮点投影projectionColor-roded projectionLinear unMivinBIon Con cent rati anCorrelationM o d ifv SeriesHDR- imagin吕5titchj Structured IlluminationMethod

8、Ma?(innunn intcnsity prafettionIm 日且已 ca Ieu latorInput innage1.点击 Maximum intensity2.点击需要处理的图像现在取得的图片为不同Z轴上最亮点的投影。Zeiss ELYRA S1 通道校正(Channel Alignment)操作流程Acquire:利用200nm荧光小球获取SIM图像Process： SIM 图像处置Process： Channel Alignment 通道校正Use:利用校正结果样品为具有四种荧光通道、200nm直径的标准荧光小球。有以下 两个样片:样品编号所匹配的物镜0000-1783-455

9、63X/ Oil， 100X/ Oil0000-1788-601100X/ Oil注意：物镜及样片需要认真清洗！在实验前。需将样品放置在开启的系统中稳固30分钟至60分钟。需利用与物镜折射率相匹配的镜油。具体操作流程见以下图：1. Acquire SIM Image 获取 SIM 图像利用200nm的荧光小球ZEN) ZEN 2011File View Acquisition Maintain Macro Tools Window见aLocateAcquisitionProcessingMaintainExperiment Managerangle:Acquisition Parameter

10、Acquisition ModeShow All 由Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27Find Focus Set ExposureContinuousFrame SizeX* Y Y 100221 SlicesTime Series Format1004 x 1002 standardTile ScanPositionsRegionsA Start ExperimentAveragingNumberBit Depth 16 Bit:Setup ManagerMethodMeanHDRLaser Lines nmPowerA HR DPSS 561-1OC

11、561 (Elyra)A HR Diode 642-1(642 (Elyra)Image Size:Pixel Size:127.4 pm x 127.1 pm0.13 pmA HR Diode 405-5(405 (Elyra)A HR Diode 4S8-1(438 (Elyra)Q Laser Properties区 Light PathZSlwwAll 国Reset Al!Laser WFGrating 5 RotationsSwitch track every Z-Stack船 Channels show All 囱Tracks red yelloe Green blueTracks

12、ChannelsV yelloe5 Green5 blueExpand All Collapse AllTrack Configuration not definedSIM 34.0 呻 G3LP655Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27Exposure Time ms H100.0QStage FocusEMCCD GainCamera Temperature -63.0 ,C stableAperture 0.55O DisplayFocusV Focus Devices and Strategy:Multidimensional Acquisition1

13、选择需要的物镜2.选择 5 rotation3.建议案顺序依次设置4.激光强度：488nm, 561nm：2 5%;405nm, 642nm： 4 10%time： 100msGain： 30-507.选择 Center12. z-stack 选择 slice 为 21 张11.点击Smallest数值8.点击 Interval9.点击 Center10.点击向下箭头2.生成SIM图像1.选择 Processing 选卡3.选择先前拍摄的SIM原始图像7.点击 ApplyPirtcle Trackingt Strunured MurninatKHi . smnnd aunHiHiMnTIBF-

14、 Fite ndEcperintemai PSFFourier Transform Oianrtel Allenmerat Decanvnlutian Copy ICS.Ailiiicr2.选择 Structure Illumination5.选择Automatic模式6.选择 SR-SIMModflysenKHDiR-rTHgingcorreiEnoni通道校正1. 选择Processing选卡it mLMPnrtweirartneIt Structyred lumnaticn CTmmd A电rnnerTt Deconva I ution3.选择先前拍摄的SIM图像啊攻*ton bn C6.点击 Apply5.选择校正模式AffineH火业邮,FALKlFankMTraa：f bKimdF4.点击SelectOwv PALMParticle Tracking k Structured IlluminationChanne