一代、二代、三代测序技术.

1、【最新整理，下载后即可编辑】一代、二代、三代测序技术(2014-01-22 10:42:13)转载第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先 发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个 核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是 均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相 同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补 的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷 酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团，所以 可被用作链终止试剂)通过聚合酶的引物延伸产生一

2、系列大小不 同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子 结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行， 每一组分别用四种ddNTP (双脱氧核苷酸)中的一种来进行终 止，再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出 我们需要的序列。第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform) 的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因 组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研 究人员分享。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格， 更全面、更深入地分

3、析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组 的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国 Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公 司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美 国 Applied Biosystems 公司的 SOLiD 测序仪。Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等 测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种 不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP 就会释放出不同的荧光，根据

4、捕捉的荧光信号并经过特定的计算 机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。以Illumina测序 仪说明二代测序的一般流程，（1）文库制备，将DNA用雾化 或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外 切核酸酶把DNA片段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核 苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。（2）簇 的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片 有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定 的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后 与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增 使用。通过不断循环获得上百万条

5、成簇分布的双链待测片段。（3） 测序，分三步：DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇 成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解。（4） 数据分析第三代测序技术-高通量、单分子测序被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪，PacificBioscience 的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测 序技术正向着高通量 低成本长读取长度的方向发展。不同于第 二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测 序，第三代分子测序，不需要进行PCR扩增。（1）Helico BioScience 单分子测序技术。该测序是

6、基于边合成边测序的思想，将待测序 列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在3末端加上 poly（A）,以及在poly（A）的末端进行荧光标记和阻断，把这些小片 段与带有poly（T）的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位 置，建立边合成边测序的位点加入聚合酶和被Cy3荧光标记脱 氧核苷酸进行DNA合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，直接对Cy3成像，观 测模板位点上是否有荧光信号，然后化学裂解核苷酸上的燃料并 释放加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物，进行下一轮反 应。（2）Pacific BioscienceSMRTT技术。该测序也是基于边合成 边测

7、序的原理，这项技于使用了 Zero-ModeWaveguide（ZMW）（零 级波导）。测序的过程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶 活性位点上与模板链结合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标 记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被 切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接 到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。（3）Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术。大多数纳米孔 测序技术的基本原理是当DNA分子或者它的组成碱基从一个孔 洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxfordNanopore测 序技术是以a-溶血素

8、来构建生物纳米孔，核酸外切酶依附在孔 一侧的外表面，一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔 的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内，为了提供既符 合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件，脂双分子层两侧 为不同的盐浓度 在适合的电压下，核酸外切酶消化单链DNA, 单个碱基落入孔中，并与孔内的环糊精短暂的相互作用，影响了 流过纳米孔原本的电流，腺嘌吟与胸腺嘧啶的电信号大小很相 近，但胸腺嘧啶在环糊精停留是时间是其他核苷酸的2-3倍，所 以每个碱基都因其产生电流干扰振幅是特有的而被区分开来。第一代指双脱氧末端终止法，扩增后通过毛细管电泳读取序列， 每次获取数据量少第二代为高通量测序，采用微

9、珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454, solexa, solid,高通量，可一次获得数G数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。第三代特点是单分子测序，多基于纳米科技，无需扩增，对单分 链DNA/RNA直接用合成、降解、通过纳米孔等方式直接测序， 核心特点是无需扩增所以成本更低第二代DNA测序技术编辑本词条缺少信息栏，补充相关内容使词条更完整，还能快速升级， 赶紧来编辑吧！第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列， 现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Il

10、lumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID system。目录1概述2基本原理3操作流程概述编辑DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术，在 生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构(Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术，但是 当时的操作流程复杂，没能形成规模。随后在1977年Sanger发 明了具有里程碑意义的末端终止测序法，同年A.M.Maxam和 W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速，并经 过后续的不断改良，成为

11、了迄今为止DNA测序的主流。然而随 着科学的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需 要，对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因 组测序，都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术（Next-generation sequencing）应运而生。这三个技术 平台各有优点，454 FLX的测序片段比较长，高质量的读长（read） 能达到400bp； Solexa测序性价比最高，不仅机器的售价比其他 两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成本只有 454测序的1/10； SOLID测序的准确度高，原始碱基数据的准确 度大于99.94%，而在15

12、X覆盖率时的准确度可以达到99.999%， 是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的 工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解测序原理、操作 流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序为例，简述第二代测序技术 的基本原理、操作流程等方面。基本原理编辑Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原 理是边合成边 测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜 色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时， 每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根

13、据捕捉的荧光信号 并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。 操作流程 编辑1）测序文库的构建（Library Construction）首先准备基因组（虽然测序公司要求样品量要达到200ng， 但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很 多样品有限的实验中），然后将DNA随机片段化成几百碱基或 更短的小片段，并在两头加上特定的接头（Adaptor）。如果是 转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，RNA片段化之后需 反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA反转成cDNA， 然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面

14、的 数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通 常会选择几种不同的insertsize，以便在组装（Assembly）的时候 获得更多的信息。锚定桥接(Surface Attachment and Bridge Amplification)Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell 又被细分成8个Lane，每个Lane的内表面有无数的被固定的单 链接头。上述步骤得到的带接头的DNA片段变性成单链后与测 序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使 用。预扩增(Denaturation and Complete Amplificati

15、on)添加未标记的dNTP和普通Taq酶进行固相桥式PCR扩 增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释 放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会 在Flow cell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片 段。单碱基延伸测序(Single Base Extension and Sequencing)在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合 酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加 入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通 过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从 而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信 息的过程叫做Base Calling， Illumina公司Base Calling所用的软件 是 Illuminas Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analy