电镜超薄切片1

1、透射电子显微镜生物制品制备技术 01The photo of light microscope23冷冻蚀刻超薄切片4冰冻蚀刻复型术 Freeze etch replica5冰冻割断术 电镜细胞化学术 Freeze cracking electron microscope cytochemistry 6免疫组织化学技术 免疫电镜术 Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy 7电镜放射自显影术 显微放射自显影技术Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography8扫描电镜技术 Scanni

2、ng electron microscopy SEM被吞噬的红细胞9现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；另一类是生物制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。 101、 超薄切片样品的制备（1） 取材( 基本要求是在活体情况下进行)取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则）1） 快速：1分钟之内投入固定液。2） 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。3） 部位准4） 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。5） 低温：0-4oC11取材的方法1）

3、动物材料： 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。12胚胎干细胞的研究132）培养细胞(Cell culture)： 生长在瓶中的细胞到足够的量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。143）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。经过固定处理后再离心成团，在50oC中弃去上清液，

4、加入适量的经50oC预温的2%的琼浆，使团悬浮，将悬浮团和琼脂液一同在薄片上展层，固定后切成1mm3的小块。15（2）固定 (fixation) The aim is to avoid digestion by enzymes (autolysis) or bacteria and to preserve the physical structure, pieces of organs should be promptly and adequately treated before or as soon as possible after removal from the animals bo

5、dy.161）Function of fixationA阻止细胞自溶。B 稳定细胞物质成分。C 在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。D能提供一定的电子反差 17 理想的固定剂，应具备以下条件：能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。182）影响固定效果的因素固定液的pH值渗透压缓冲液的类型固定的温度和时间当前采用的是在04下固定1 4小时。193）常用的几种固定剂A 四氧化锇（

6、osmium tetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内配制。20优点对蛋白质、磷酸脂蛋白、核蛋白固定较好； 对脂类固定较好。分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。缺点不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。扩散慢，穿透能力差。具有挥发性和粘膜毒性。不适于进行细胞化学工作。21B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2） 特点：纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。 优点 (1

7、)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学研究。 22C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。 232）固定的方法A 单固定法：单细胞或固定液易于浸透的组织 1-2%四氧化锇（1-2h）。B 双固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）-锇酸（1% 4oC 2h）。C 原位固定和灌注固定：24附 几种常见固定剂的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在

8、7.0以下。0. 2mol/L磷酸缓冲液的配制 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 29g 重蒸水 加到500ml 调PH到7.4250.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液重蒸水 25ml二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O） 2.14g0. 1mol/L盐酸 8ml重蒸水 加至50ml调PH到7.4 26B 固定液的配制锇酸固定液的配制2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿 1G锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%锇酸固定液。 2%的锇酸缓冲液 10ml 0.2mol/L缓冲

9、液 10ml 调节PH应为7.3-7.427戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6重蒸水（ml） 4.6 4 3.40.2ml/L缓冲液（ml） 5 5 5戊二醛最终浓度 1 2.5 4调节固定液PH值到7.3-7.428（3） 脱水(dehydration)1）清洗:固定后均用和固定液相同的缓冲液冲洗3次，每次15分钟2） 脱水：常用的脱水剂为乙醇和丙酮。How to choose? Why? 乙醇引起组织中脂类物质抽提较丙酮少，且不会使组织变硬、变脆，故为常用脱水剂，然乙醇不容易和用于包埋剂的环氧树脂相混溶，因此在进入包埋剂之前常用中间剂环氧丙烷置换。29脱水程序如下表

10、浓度50%70%90%100%时间10-1510-1510-153次（每次10-15）温度4oC4oC转室温室温30经验(experiment)：脱水剂临时配制。浓度梯度上升。脱水时间和浓度。脱水时的连续性。脱水剂的选择。31（4）浸透是通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂取代脱水剂，使其渗透到组织中去。 脱水和包埋剂的比例2:11:2纯包埋剂时间1-2h2-3h2h温度室温室温37oC温箱32经验(experiment)：浸透时间。浸透温度。33（5） 包埋(embeding)：目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的

11、作用，有利于切薄片。包埋剂的性质:粘度适中，有良好的切割性能。能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。透明度好。对人无害。34包埋剂的种类环氧树脂类： 目前国内使用较多的环氧树脂有进口的Epon 812和国产的618。35 原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。36这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的

12、微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。37低粘度包埋剂(Spurr) 为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。 38水溶性包埋剂： 是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。 原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。 包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等 39所加的固化剂，

13、有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP30）。401环氧树脂的性能和配制：618树脂 5ml十二烯基丁二酸酐 DSA（固化剂） 5ml苯二甲酸二丁酯 DBP（增塑剂） 0.3ml2,4.6三苯酚 称DMP30（加速剂） 0.1ml 60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱中使气泡逸出。 41Epon812的配制A液： Epon812 62ml DDSA(固化剂) 100mlB液： Epon812 10

14、0ml MNA(固化剂) 89ml A液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。421） 包埋的方法43常规包埋 将浸透在包埋剂的组织块，转移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋剂。 把写好标本块编号的小纸条卷成环状，放入囊中，插入包埋剂中。 不加盖，37oC过夜，这也就是纯包埋剂浸透。 次日，升温到60oC48小时固化。 固化完毕，关温箱，自然冷却。 去掉外壳，取出组织包埋块将组织包埋块，存放在干燥器中。 44定向包埋：注意事项防潮、干燥。包埋剂要充分混匀。防气泡。包埋后立即清

15、洗器皿。自身保护。干燥器中存放包埋块。 45（6）切片1）选择和清洗载网。常用的载网有圆形的铜网，细胞化学和免疫组织化学常用镍网、不锈钢网和银丝网。直径为3mm，目数为200-300 462） 支持膜的制备： 福尔莫瓦膜：常用氯仿配制的 0.2%-1.5%的聚乙烯醇缩甲醛液（formrar）。注：制膜时室内的温度小于60%，否则会出现白点。 火棉胶膜：特点，火棉胶膜的机械强度比福尔莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸异戊酯溶液采用漏斗法和贴附法制膜。 帕罗丁支持膜：目前国外比较常用，一般配制30%左右的帕罗丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉胶同。 碳膜：炭膜的机械程度和稳定性较好，适用于高分辨率

16、的观察，用真空喷镀仪采用碳升华喷镀法制备。 复合膜：有机膜上喷镀5-10nm的碳膜。 微孔支持膜：高分辨率观察使用。472） 包埋块修整：修成四面锥体（45oC角）485）超薄切片机的构造 6）切片操作 7） 切片厚度: 灰色 40-50nm 银灰色 50-70nm 金黄色 70-90nm 紫色 90nm以上49(7)染色1） 常用的电子染色剂醋酸铀(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，对光不稳定，储存、染色最好闭光，变混则失效。广泛使用，能产生较高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差；对糖分、分泌颗粒、溶酶体等也能染色，但对膜的结构染色较差。常用浓度

17、：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的时间：组织块染色时间为1-2h或过夜。片染30min即可。 50枸橼酸铅（lead acetate）：特点：毒性大。与空气中的二氧化碳结合形成白色的碳酸铅沉淀。高PH（11-12）染色效果好。也是目前最广泛使用的染色液。它具有很高的电子密度，对细胞超微结构均有广泛的亲和性，能提高细胞膜系统及酯类的反差。枸橼酸铅（lead citrate）溶液的配制硝酸铅Pb(NO3)2 1.33g枸橼酸钠Na3(C6H6O7).2H2O 1.76g双蒸水 30ml混合后振荡30min呈乳白色，加1.0mol/L新鲜配制的NaOH8ml双蒸水 加至50ml 调PH到12 512） 染色方法A、 手工染色 单染色：用一种染色液；一般材料铅染好，免疫组化铀染好。 双染色：先用醋酸铀染色，再用柠檬酸铅染