分子生物学研究策略-印记基因ppt课件

1、分子生物学研讨战略Research Strategy on Molecular Biology2021. 9.基因组印记与印记基因基因治疗第二部分. Identical Twins Not So Identical ?Pure mice different skin color?表观遗传学 Epigenetic phenotypes基因表达上的差别.一、基因组印记与印记基因基因组印记(genomic imprinting)是一种不遵照孟德尔遗传规律的亲本等位基因差别表达景象，即DNA甲基化修饰经过启动子附近差别甲基化区域控制等位基因的不对称表达。基因组印记可以是共价标志DNA甲基化上的，也可以

2、是非共价标志DNA-蛋白质和DNA-RNA互作，核基因组定位。.mendelian inheritanceNon- mendelian inheritance.不对称表达的基因称为印记基因(imprinting gene)，如母系印记、父系表达的Igf2 (insulin-like growth factor 2)和父系印记、母系表达的H19。已证明的人类印记基因有51个，小鼠印记基因有82个。配子发生和早期胚胎构成过程中，基因组印记阅历了擦除和重建，并在以后的生命过程中维持印记，其中任何一个环节出现错误都能够导致胚胎发育缺陷，甚至死亡。 .印记基因的特点： 性别特异性，同一等位基因仅表达父本

3、或母本基因。 印记发生于配子构成过程中。 在胚胎的有丝分裂中能稳定传送给子细胞。 遗传给下一代时印记被重塑，建立新的与性别有关的印记。. 印记的重组包括印记的擦除与重建，主要发生在配子的迁移和成熟过程。基因印记的完好性是原始生殖细胞(primordialgermcell，PGC)细胞核具有全能性的重要前提，同时也是配子成熟过程的必需步骤。一印记基因的擦除与重建.印记的擦除发生于PGC原生殖细胞向生殖嵴迁移的过程中，而且在生殖细胞的分化过程中起到重要作用。基因组印记的建立是生殖细胞成熟过程中的重要事件，而且这一时间段是印记建立的特异时间窗，即印记基因甲基化的获得只特异性发生于配子构成过程。雌、雄

4、两性的配子分化、发育过程存在显著差别，印记的建立在雌、雄两性之间也存在显著的差别。.ICR为印记调控区Imprinting control region.雌性配子的印记重建 雌性生殖细胞的成熟过程中，擦除的基因组印记又逐渐重新建立起来。在幼鼠和成年鼠的研讨中发现，卵母细胞基因组印记的建立与卵母细胞的直径有关，与年龄无关。卵母细胞基因印记的建立大约起始于直径到达40m，到达65m时甲基化根本完成。.雄性配子的印记重建 雄性生殖细胞基因组印记的建立早于雌性，而且印记完成的过程比较漫长，主要发生在减数分裂之前的精原细胞阶段。 父源印记的建立与胚胎生殖细胞的分化发育存在亲密关系。临床常规精液分析诊断为

5、中、重度精子减少的患者其精子的基因印记错误率高于正常精子。 . 印记基因的“印记机理是呈印记一方的基因调控序列DNA(普通为启动子)被甲基化(methylation)、组蛋白被乙酰基化(histone acetylation)和组蛋白被甲基化, 其中DNA 甲基化是其关键。二基因印记的分子机制.基因印记的建立和维持依托DNA甲基转移酶(DNA methylation transferase，DNMT)的参与，DNMT的缺失或功能异常导致的印记异常会严重妨碍正常的胚胎发育。1、印记基因与DNA甲基化. 对印记基因研讨显示，来源于父母双方的等位基因甲基化程度不同，这一区域称为DMRs (Diffe

6、rentially Methylated Regions)，也有称为ICR Imprinting control region。.CTCF一种进化上高度保守的锌指核蛋白结合到母源链的ICR上，阻断了下游加强子对Igf2启动子的作用，从而阻断其的表达，而H19那么可以表达。在父源链上ICR被甲基化，CTCF不能结合上去，使Igf2的阻断不能发生，该基因能从这条链上表达，而H19由于其启动子被甲基化以及加强子竞争的作用不能从这条链上表达，结果呵斥了印记基因单链表达的景象。 .哺乳动物的DNMT家族主要成员: Dnmtl、Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L等。 Dnmt l是哺乳动物最主要的甲

7、基转移酶，表达于复制形状的增殖细胞，可以优先催化复制后半甲基化的DNA双链，使低甲基化的子链完全甲基化。在甲基化的维持中具有重要作用。. Dnmt 3a和Dnmt 3b作用于未甲基化的DNA双链，两者在催化功能上相互补充。Dnmt3a优先使核小体之外裸露部分的DNA甲基化，而Dnmt3b使中心区甲基化。 Dnmt 3L (DNA methyltransferase3一likeprotein)在PHD锌指区域与Dnmt3a和Dnmt3b有同源性，但缺乏高度保守的转移酶基序，因此没有催化活性，但Dnmt3L可以直接刺激Dnmt3a和Dnmt3b的DNA甲基化活性而发扬功能。.组蛋白是真核生物染色体

8、的根本构造蛋白，是一类小分子碱性蛋白质，其富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸，并且两种氨基酸大约占一切氨基酸残基的1/4，组蛋白因带有碱性氨基酸而带正电与带负电的双螺旋DNA组成DNA-组蛋白复合物。组蛋白分为H1，H2A，H2B，H3和H4等5种成分，除H1之外其他的4种组蛋白以二聚体共八聚体相结合，构成核小体中心，DNA缠绕其上由H1衔接构成念珠状的核小体构造。 2、印记基因与组蛋白修饰.组蛋白有两个活性末端: 羧基端和氨基端。羧基端与组蛋白分子间的相互作用和DNA缠绕有关，而氨基端那么与其他调理蛋白和DNA 作用有关，且富含赖氨酸，具有极度精细的变化区。这类变化由乙酰化、磷酸化、甲基化等共价

9、修饰引起。这些修饰可作为一种标志或言语，是“组蛋白密码的根本组成元素。这种组蛋白密码可被一系列特定的蛋白质所识别，并将其转译成一种特定的染色质形状以实现对特定基因的调理，这显著地扩展了遗传密码的信息储存量。组蛋白修饰与染色质构造变化及基因活化控制相关。 . 组蛋白的乙酰化是在组蛋白乙酰转移酶histone acetyltransferase，HACs和组蛋白去乙酰化酶histone deacetylase，HDACs协调进展，其主要是对于组蛋白的N端赖氨酸进展修饰，特定基因组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰是随机的位置特异的修饰。而组蛋白甲基化由组蛋白甲基转移酶催化完成的赖氨酸和精氨酸的甲基化，赖氨酸

10、可以有单甲基化、双甲基化和三甲基化，而精氨酸可以有单甲基化和双甲基化。.组蛋白修饰除了乙酰化、甲基化修饰还有磷酸化、腺苷酸化、泛素化和ADP 核糖基化等修饰。这些修饰能够经过两种机制影响染色体的构造与功能。首先，这些修饰几乎都能改动组蛋白的电荷，因此改动了组蛋白与DNA 结合的特性；其次，这些修饰可以经过信号传导，募集专注蛋白复合物到它们的外表起作用，从而起到调控基因表达作用。 .DNA甲基化与组蛋白乙酰化/甲基化的相互作用. 基因组印记是哺乳动物在长期进化过程中构成的自我监护机制，印记功能的紊乱将导致多种疾病，肿瘤易感性也明显添加。 与基因印记有关的综合征有很多，例如：安吉曼综合征Angel

11、man syndrome，AS，普-威综合征Prader-Willi syndrome，PWS 以及伯韦综合征Beckwith-Wiedemann syndrome 等。三印记基因与人类疾病.1、安吉曼综合征Angelman syndrome，AS通常为共济失调、睡眠妨碍、癫痫及精神发育迟滞，个别AS患者有忽然发作的傻笑兴奋面容、好动，被称为“高兴木偶。.2、普-威综合征Prader-Willi syndrome，PWS的主要特点是肥胖、张力减退、精神愚钝、性腺功能减退和发育缓慢。 . 安吉曼综合征和普-威综合征大多具有15q11-13缺失，少部分是由于单亲二体或者印记突变，父源染色体缺失时临

12、床上表现为PWS，而母源染色体缺失时表现为AS。在这个区域内有SNRPN, NDN and UBE3A等印记基因。 Snrpn ( small nuclear ribonucleoprotein poly peptide N) 即小分子核糖体蛋白多肽，该基因与细胞分化、增殖、胚胎正常发育、精神行为等有关。目前研讨以为Snrpn父源性基因在印记区域微缺失、突变、易位等可引起PWS(126-128)，而父源性二倍体( uniparental disomy, UPD)及母源性印记丧失与AS有关。AS还与母源性基因UBE3A在脑发育期间表达异常有亲密关系。.3、伯韦综合征Beckwith-Wiedem

13、ann syndrome 其特征有躯体过度生长、巨舌、内脏肥大、易患胚胎性肿瘤等。此病至少与胰岛素样生长因子IGF2印记丧失有关，致双等位基因表达IGF2，促进相关组织过度生长有关，也是此病患者易患胚胎瘤的缘由。 一些研讨阐明BWS 病人的ICR上突变导致H19/IGF2的印记丧失，使得IGF2 双等位基因表达而H19被沉默。 .二、基因治疗gene therapy 定义：将正常基因导入造血干细胞或其他组织细胞，以纠正基因的缺陷或者发扬治疗作用，从而到达治疗疾病目的的生物医学高技术。 .Ashanti DiSilva患腺苷脱氨酶简称ADA1990年美国第一次对SCID病人作基因治疗. 基因矫正

14、 基因置换 基因增补 基因失活 自杀基因的运用 免疫基因治疗 耐药基因治疗 一基因治疗战略总战略. 用正常基因在原位交换致病基因，使细胞DNA完全恢复正常形状。 对于致病基因中的异常碱基进展准确修复，使其恢复正常功能。基因矫正gene correction2.基因置换genereplacement.3.基因增补gene augmentation 将正常基因导入患者体细胞内，使其整合到染色体中一同表达，以补偿缺陷基因的功能 ，但致病基因未去除。4.基因失活gene inactivation 指将特定的反义核酸导入细胞，经过碱基互补作用与mRNA结合，阻断肿瘤细胞中基因的异常表达，以抗肿瘤、抗病毒

15、。 反义RNA: 干扰mRNA的互补RNA; 反义DNA: 干扰DNA的互补DNA。.5.“自杀基因的运用 自杀基因导入受体细胞后可产生一种酶，它可将原无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将受体细胞杀死，这种基因被称为“自杀基因。 自杀基因导入肿瘤细胞后，可将肿瘤细胞杀死。但对正常细胞那么无损伤作用。 .6.免疫基因治疗 将某些细胞因子IL-2、GM-CSF等基因导入肿瘤患者体内，以加强患者的抵抗力。 7.耐药基因治疗 在肿瘤化疗过程中，把产生抗药物毒性的基因导入患者体内，从而使患者能耐受更大剂量的化疗。.按基因操作方式将基因治疗分为两类：一类为基因修正gene correction和基

16、因置换gene replacement，即将缺陷基因的异常序列进展矫正，对缺陷基因准确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改动。经过同源重组homologous recombination即基因打靶gene targetting 技术将外源正常的基因在特定的部位进展重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。 。 .另一类为基因加强gene augmentation和基因失活gene inactivation，是不去除异常基因，而经过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能或特异封锁某些基因的翻译或转录，以到达抑制某些异常基因表达。. 将外源的基因导入生物细胞内必需借助一定的技术方法或载

17、体，有生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。目前基因治疗主要针对那些对人类安康要挟严重的疾病，包括：遗传病如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病如艾滋病、类风湿等。 . 基因治疗有二种方式：一是体细胞基因治疗，正在广泛运用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改动而遭到限制。二基因治疗方式. 体细胞治疗中体细胞应该是在体内能坚持相当长寿命或者具有分裂才干的细胞，这样才干使被转入的基因能有效地、长期地发扬“治疗作用。因此，干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。其中骨髓细胞被以为是独一满足以上规范的靶细胞，而骨髓的抽取

18、、体外培育、再植入等所涉及的技术都已成熟，骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。. 一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成妨碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等和非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也都能以骨髓细胞作为靶细胞。除骨髓细胞以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也在作为靶细胞进展研讨或实施转基因治疗。. 生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，这是目前更多地采用体细胞基因治疗的缘由所在。.三基因治

19、疗途径体外ex vivo和体内 in vivo两种途径. 1. ex vivo 途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体本身或异体细胞或异种细胞，经体外细胞扩增后，输回人体。体外基因转移途径比较经典、平安，而且效果较易控制，但步骤多、技术复杂、难度大，不容易推行。.2. in vivo 途径： 这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA。体内基因转移途径操作简便，容易推行，但目前尚未成熟，存在疗效继续时间短，免疫排斥及平安性等一系列问题。.1.目的基因的转移: 在基因治疗中迄今所运用的目的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的根本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。四基因治疗的根本步骤.2.目的基因的表达: 目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用连锁基因扩增