WHO推荐的白喉类毒素效价测定方法

1、WHO推荐的白喉类毒素效价测定方法可选用以下两种方法之一种进行。（一）Vero细胞测定抗体法1免疫与采血用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品以2倍稀释法稀释成35个适当稀释度，每一稀释度样品免疫体重1014g小白鼠8只，皮下注射0.5ml，免疫5周后，每个小白鼠采血，分离血清，5630分钟灭活，放-20保存。2毒素试验量测定Vero细胞测定白喉抗体试验时毒素试验量采用Lcd/10000。在96孔培养板中用RPMI1640（或199）培养液将毒素做2倍系列稀释，每孔50l，然后向各孔中加入50l标准白喉抗毒素（0.0001IU），用胶带密封，在室温放置1小时后，加入50lVero细胞悬液（

2、见3项）密封，放37CO2孵箱培养67天后，观察结果，使细胞死亡的最大毒素稀释度孔（红色）就是Lcd/10000。Lcd/10000的毒素量约相当于110-4Lf的毒素适用于本试验。3Vero细胞RPMI1640（或199）培养液（加青霉素100IU/ml，链霉素100g/ml，胎牛血清10%）。Vero细胞培养于150cm2培养瓶中，待细胞长成占瓶底80%100%单层时，弃去上层培养液，加10ml0.25%胰酶，放37数分钟，弃去胰酶，加入10ml培养液，打匀细胞进行计数（1瓶150cm2培养瓶大约可得1040106细胞）。用培养液调整细胞浓度至2.5105细胞/ml。4阳性对照小白鼠血清用

3、吸附白喉类毒素免疫1批小白鼠，免疫5周后采血，分离血清，分装小管，冷冻干燥，保存于-20。5抗体滴定按下图将培养板编号：A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10A11A12B1C1D1E1F1G1H1（1）向每孔加入50l培养液，但A11、A12和H11、H12孔不加，而G11、G12加100l培养液。（2）取8份待检血清，分别加入A1至H1孔各50l，横向进行2倍系列稀释，直至A10和H10孔。（3）将标准白喉抗毒素稀释至0.008IU/ml，加入A11、A12、B11和B12孔各50l，从B11和B12孔开始竖向做2倍稀释至D11和D12孔。（4）H11和H12孔加入阳性小白鼠对照血清5

4、0l。（5）除G11和G12孔外，向其余各孔中加入毒素（Ldc/10000）50l，轻轻转动培养板，混匀，在培养板上贴上胶带将板孔封闭，放室温1小时。（6）收集Vero细胞，进行计数，并稀释成2.5细胞/ml的Vero细胞悬液。（7）室温放置1小时之培养板，去胶带，立即加入50lVero细胞悬液，再用胶带封闭培养板，放37CO2孵箱培养6天。在24小时及48小时检查胶带封闭情况，如出现封闭不严应更换。（8）培养6天后取出培养板，根据培养液颜色变化记录结果，黄色为（+），红色为（-），羲色不明显者则可用显微镜观察，如单层细胞完整无损则为（+），否则记录（-）。最终结果以打分表示，即变成黄色的最高

5、稀释度孔的2的指数，例如：变黄的最后一孔是1/256即28，则结果记为8。6试验要求E11、E12、F11和F12孔代表毒素量和Vero细胞敏感度都出现（-），如果出现（+），则毒素量和细胞敏感度都很低，应重试。细胞孔G11、G12和阳性对照孔H11、H12必须是（+），如出现（-），应重视。Lcd/10000毒素量的准确性，根据以上计划下列各孔中所加标准抗毒素为：孔A11和A120.0004IUB11和B120.0002IUC11和C120.0001IUD11和D120.00005IU如毒素用量准确（Lcd/10000），则A11、A12和B11、B12孔应为（+），而C11、C12和D11

6、、D12应为（-），否则应重试。7结果计算用平行线分析法进行结果计算8结果判定待检样品的效价每剂量应不少30IU。如95%可信限大于50%200%，则95%可信限的低限效价应大于30IU/1个人用剂量。豚鼠毒素攻击法1免疫及攻击用生理盐水将吸附白喉类毒素标准品和待检样品稀释成等比间隔的35个稀释度（中间的稀释度必须在攻毒后能保护约半数动物），每一稀释度样品免疫体重250300g之豚鼠至少10只，另外5只豚鼠不注射作为对照。免疫后4周，每只免疫豚鼠攻击白喉毒素100LD50，皮下注射1.0ml。对照组健康动物注射100倍稀释之上述毒素，每只皮下注射1.0ml。攻击毒素后观察5日，每日记录结果。2试验成立应具备的条件（1）检品的最低稀释度能保护半数以上动物。