目的基因与克隆载体的体外重组新

1、会计学1目的基因与克隆载体的体外重组新目的基因与克隆载体的体外重组新基因工程的操作过程切接转增检连接方式同聚物加尾加人工接头加DNA衔接物粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRI粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同

2、尾酶）BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 退火GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATT4-DNA ligaseTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT5 TGATCAACTAGT5 BclITGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGT粘性末端连接双酶切产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA ligaseGA

3、ATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGEcoRIGGACTTCCTGAABamBam平末端连接HpaI5 5GTTAACCAATTGGTTAACCAATTG5GTTCAA AACTTG5 5 CCCGGG5 GGG CCC3 T4-DNA ligaseCCCAACGGGTTG5 5GTTGGGCAACCC5 CCCGGGGGGCCC5 StuI3 平末端连接-不同粘性末端的平端连接BamHI5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAG5 GACGTC3 T4-

4、DNA ligaseCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC5 CTGCAGGACGTC5 PstI3 T4-DNA pol切平5 CG5 GCKlenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC粘性末端的更换BamHI5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseKlenow补平GATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55GGATCCTGCAGGATCCCCTAGGACGTCCTAGG5 5PstICTGCAGGACGTCPstI linker5 p3 HOOH

5、3 p 5 TDTMg2+ dATPAAAAAAAAAAAA OH 3 5 p3 HOp 5 同聚物尾巴 Poly（dA）末端延伸连接同聚物加尾C 3 GG5 G 3C5C3 GT4-DNA ligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTTTTTT 3C退火C3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAAC5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAA

6、AAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT末端延伸连接同聚物加尾 （平齐末端）末端延伸连接同聚物加尾 （3突出末端）CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGT4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火Pst IPst IC3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGG

7、GGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPst ISph I末端延伸连接同聚物加尾 （5突出末端）5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5Klenow补平Klenow补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTT

8、AAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCC CCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamH IBamH IEcoR IBamH I末端延伸连接人工接头加尾CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCC5 EcoR I末端延伸连接人工接头加尾55 GCT

9、TAA 555 AATTCGT4-DNA ligase5 5T4-DNA ligase5CCGAATTCGG5 GGCTTAAGCCEcoR ICCGGGCTTAAAATTCGGGCCGAATTCGGCTTAAGCCCCGAATTCGGCTTAAG退火EcoR IEcoR IEcoR ICCGAATTCGGGGCTTAAGCC末端延伸连接DNA衔接物加尾CCG5 GGCTTAA5 EcoR I AATTCGG5 GCC5 EcoR I重组率重组率的定义： 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 （在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%） 重组率是衡量连接反应效率的重要

10、指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率提高重组率的方法：提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAA pAATTCG5 p5 GCTTAA OH 55 AATTCG5 HO退火5 G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A G5G A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸酶5 GAATTCCTTAAG5 重组率提高重组率的方法：人工构建粘性末端： CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3 C5C3 GTACG

11、T4-DNA ligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC 3C退火C3CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenow基因工程的操作过程切接转增检粘性末端连接单酶切产生的粘性末端的连接（同种酶）5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5GCTTAAAATTCG5 退火

12、GCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAG5 GCTTAA 55 AATTCG5 5 GAATTCCTTAAG5 EcoRI粘性末端连接双酶切产生的粘性末端的连接5 5GAATTCCTTAAGGGACTTCCTGAAEcoRI5GCCTGAAATTCG5 退火GCCTGAAATTCG5 GCTTAA 5 GACTTAT4-DNA ligaseGAATTCCTTAAG5 5GGACTTCCTGAA5 GCTTAA 55 GACTTA5 5 GAATTCCTTAAGEcoRIGGA