生物化学PPT蛋白质下word版本

1、生物化学PPT蛋白质下v构型：指一个分子中各原子在空间构型：指一个分子中各原子在空间的相对分布或排列，构型的改变涉的相对分布或排列，构型的改变涉及到共价键的断裂和重新形成。及到共价键的断裂和重新形成。1.肽平面：肽平面：酰胺平面，参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平面。位于同一平面。 （一）肽平面（一）肽平面ccccc2.肽键键长为肽键键长为0.133nm具有部分双键性质，不具有部分双键性质，不能自由旋转。能自由旋转。3.3.酰胺平面中肽键一般是酰胺平面中肽键一般是反式构型。反式构型。扭角变，主链构象变，扭角变，主链构象变，当扭角为固定值时，主当扭角为固定

2、值时，主链为有规律的构象。链为有规律的构象。多肽链可以看成由多肽链可以看成由C串联起来的无数个酰胺平面组成串联起来的无数个酰胺平面组成C 1C 2C 1C 2（二）蛋白质的二级结构（二）蛋白质的二级结构 早在1951年，Pauling和Corey根据对一些简单化合物，如氨基酸、二肽以及三肽的X-射线晶体图的研究数据，提出了两个周期性的多肽结构： -螺旋（-helix）和-折叠（-sheet）结构，它们是许多纤维蛋白和球蛋白的主要的二级结构。二级结构二级结构：蛋白蛋白质多肽链主链质多肽链主链上原子的上原子的局部局部空间结构，即空间结构，即多肽链多肽链中有规中有规则的重复构象。则的重复构象。并不涉

3、及氨基并不涉及氨基酸残基侧链的酸残基侧链的构象。构象。主要有主要有-螺旋、折叠、-转角、无规卷曲。q -螺旋v-螺旋：是多肽链主链围绕螺旋中心轴而成的螺旋式构象。v-螺旋的特点：大都为右手螺旋，每3.6个AA残基旋转一周，沿纵轴的间距为0.54nm；螺旋的稳定性靠链内氢键维持，每隔3个AA残基可形成一个氢键。在-螺旋中，AA残基的R侧链分布在螺旋的外侧，其形状、大小及电荷等均影响螺旋的形成和稳定性。3.6残基残基0.54nm-角蛋白角蛋白原纤丝初原纤维中间纤维烫发的生化原理烫发的生化原理胶原蛋白胶原蛋白原胶原分子原胶原分子胶原纤维胶原纤维q-折叠v-折叠折叠：若干条肽链或一条肽链的若干肽段平若

4、干条肽链或一条肽链的若干肽段平行排列，相邻肽链之间靠氢键维持。行排列，相邻肽链之间靠氢键维持。v-折叠结构的特点折叠结构的特点：（1）-折叠结构中肽链处于几乎完全伸展状态完全伸展状态, 两个AA残基之间的距离由R基决定。（2）肽链按层排列,靠链间氢键链间氢键维持其结构的稳定性。（3）相邻肽链走向可以是平行的(=-119，=+113)，也可以是反平行的(=-139，=+135)。（4）肽链中的AA残基的R基团分布在片层的上下。 折叠平行的平行的-折叠折叠反平行的反平行的-折叠折叠-螺旋螺旋-折叠折叠棒状棒状片状片状多肽链紧紧盘绕多肽链紧紧盘绕多肽链几乎完全伸展多肽链几乎完全伸展形成链内氢键形成链

5、内氢键多链间氢键多链间氢键如角蛋白如角蛋白如丝心蛋白如丝心蛋白q -螺旋与-折叠比较v-转角：蛋白质分子中出现的回折，在这种肽链转角：蛋白质分子中出现的回折，在这种肽链的回折角上就是的回折角上就是-转角结构。转角结构。q-转角转角（四）蛋白质的三级结构整条肽链整条肽链中全中全部氨基酸残基的相部氨基酸残基的相对空间位置。即肽对空间位置。即肽链中链中所有原子所有原子的空的空间排布。间排布。1. 定义定义 N端C端2.球状球状蛋白质三级结构的特点蛋白质三级结构的特点同时含有几种类型二级结构元件具有明显的折叠层次整个分子紧密结实，分子表面有一个空穴或裂沟几乎所有的亲水侧链都分布在分子的表面上，大部分的

6、疏水性基团都埋在分子内部。（五）蛋白质的四级结构（五）蛋白质的四级结构蛋白质的蛋白质的四级结构四级结构: :由两个或两个以由两个或两个以上具有三级结构的多肽链通过非共价键上具有三级结构的多肽链通过非共价键彼此缔合在一起形成的聚集体。彼此缔合在一起形成的聚集体。寡聚蛋寡聚蛋白：白：由两个或两个以上多肽链通过由两个或两个以上多肽链通过非共非共价键价键构成的蛋白质分子。构成的蛋白质分子。亚基（亚基（subunitsubunit）：）：寡聚蛋白中独立具寡聚蛋白中独立具有三级结构的多肽链。亚基单独存在无有三级结构的多肽链。亚基单独存在无活性。活性。亚基间主要作用力是疏水作用，氢键、亚基间主要作用力是疏水

7、作用，氢键、盐键也参与。盐键也参与。1.1.血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构成人血红蛋白组成：成人血红蛋白组成： HbA： 22 98% ， HbA2： 22 2% 新生儿和新生儿和3个月以上胎儿：个月以上胎儿：HbF 22早期胚胎：早期胚胎： 22接近于球体，接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。每个亚基上有一个血红素辅基。、链的三级结构与肌红蛋白的很相似。链的三级结构与肌红蛋白的很相似。肌红蛋白解离平衡常数：肌红蛋白解离平衡常数：22MbOOMbK 氧饱和度：氧饱和度： 22MbMbOMbOY2.2.血红蛋白和肌红蛋白的氧

8、合曲线血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线Henry定律：溶于液体的任一气体的浓度与液体上面的该气体分压成定律：溶于液体的任一气体的浓度与液体上面的该气体分压成正比。正比。P50：Mb的半饱和氧分压v 血红蛋白和肌红蛋白都能结血红蛋白和肌红蛋白都能结合氧，而且氧都是结合在分合氧，而且氧都是结合在分子中的血红素辅基上。子中的血红素辅基上。v 肌红蛋白是个单体，可以贮肌红蛋白是个单体，可以贮存氧，并且可以使氧在肌肉存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散；然而血红内很容易地扩散；然而血红蛋白是个四聚体分子，可以蛋白是个四聚体分子，可以转运氧。转运氧。v MbMb的氧结合曲线为的氧结合曲线为双曲线双曲线形，形

9、，说明说明MbMb易结合氧；易结合氧；HbHb的的氧的的氧合曲线是合曲线是S S型曲线型曲线。说明四。说明四个亚基之间具有正协同效应。个亚基之间具有正协同效应。一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合一个配体与蛋白质上的一个结合部位的结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力称为为别构效应别构效应。可分为同促效应和异促效应两类。相同配体可分为同促效应和异促效应两类。相同配体（同种的结合部位）引起的反应称为同促效应，（同种的结合部位）引起的反应称为同促效应，不同配体（不同的结合部位）引起的反应称为不同配体（不同的结合部位）引起的反应称为异促效应异促效应 3.变构

10、效应变构效应血红蛋白上有血红蛋白上有CO2和和BPG结合部位，因此，血结合部位，因此，血红蛋白还能运输红蛋白还能运输CO2 。波耳效应：波耳效应：CO2浓度的增加以及相应的浓度的增加以及相应的pH降降低使得血红蛋白氧分数饱和度曲线向右移动。低使得血红蛋白氧分数饱和度曲线向右移动。4.波耳效应及其生理意义波耳效应及其生理意义在红细胞内：在红细胞内： 碳酸酐酶碳酸酐酶 CO2H2O HHCO3四维持蛋白质构象的作用力四维持蛋白质构象的作用力v氢键（二级结构）v疏水基相互作用 疏水作用对维持蛋白质的三、四级结构起主要作用v范德华力v离子键（盐键）v二硫键v配位键氢键：多发生于多肽链中负电性很强的氢键

11、：多发生于多肽链中负电性很强的N原子或原子或O原子的孤对电子与原子的孤对电子与NH或或O-H的的H原子间的相原子间的相互吸引力。对维持蛋白质分子的二级结构起互吸引力。对维持蛋白质分子的二级结构起主要主要作用，三、四级结构起一定作用。作用，三、四级结构起一定作用。疏水相互作用：又称疏水键，指疏水基团或侧链为疏水相互作用：又称疏水键，指疏水基团或侧链为避开水分子而相互靠近聚集形成的力，对维持蛋避开水分子而相互靠近聚集形成的力，对维持蛋白质分子的三、四级结构起白质分子的三、四级结构起主要主要作用。作用。范德华力：实质是静电引力，产生于极性基团之间范德华力：实质是静电引力，产生于极性基团之间和极性基团

12、与非极性基团之间。和极性基团与非极性基团之间。离子键：又称盐键，是正负电荷之间的一种静离子键：又称盐键，是正负电荷之间的一种静电相互作用力，主要在侧链上发挥作用。电相互作用力，主要在侧链上发挥作用。二硫键：形成于半胱氨酸残基之间，在稳定蛋二硫键：形成于半胱氨酸残基之间，在稳定蛋白质三维结构中发挥作用。白质三维结构中发挥作用。配位键：指在两个原子之间由其中一个原子单配位键：指在两个原子之间由其中一个原子单独提供电子对而形成的一种特殊的共价键。独提供电子对而形成的一种特殊的共价键。LOGOLOGO第四节第四节蛋白质的结构与功能的关系蛋白质的结构与功能的关系1. 蛋白质的激活蛋白质的激活一、蛋白质的

13、一级结构与功能的关系一、蛋白质的一级结构与功能的关系无活性的蛋白质前体经特定的方式断裂后才转变无活性的蛋白质前体经特定的方式断裂后才转变为有活性的蛋白质，这一过程叫为有活性的蛋白质，这一过程叫蛋白质的激活蛋白质的激活（activation）。）。蛋白质的激活是蛋白质活性的一种调节方式。蛋白质的激活是蛋白质活性的一种调节方式。镰刀形血红蛋白（镰刀形血红蛋白（sickle-cell hemoglobin, Hb S）2 2、蛋白质的一级结构与分子病蛋白质的一级结构与分子病 -链链N端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）正常人） Val-His-Leu-

14、Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys二、蛋白质的空间结构与功能的关系蛋白质的空间结构与功能的关系蛋白质的功能通常取决于它的特定构象一、蛋白质的性质一、蛋白质的性质多肽链中氨基酸残基的可解离基团：末端-COO-、-NH3+，酸性氨基酸侧链-COO- ，Lys的-NH3+，Arg的胍基，His的咪唑基。蛋白质的等电点蛋白质的等电点(pI) 在某一在某一pH值时，蛋白质分子中所带的正值时，蛋白质分子中所带的正电荷数与负电荷数相等，净电荷为零，在电电荷数与负电荷数相等，净电荷为零，在电场中不移动，此时溶液的场中

15、不移动，此时溶液的pH称为蛋白质的等称为蛋白质的等电点。电点。第五节 蛋白质的性质与分离鉴定1.蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离 NH3+ NH3+ NH2P P P COOH COO- COO- 正离子正离子 兼性离子兼性离子 负离子负离子 pHpI pH=pI pHpI 各种蛋白质的氨基酸组成不同，解离情况不同，等电点不同。+OH-+OH-+H+H+在下面所指的pH条件下，下述蛋白质在电场中向正极还是向负极移动，还是不动？(a)卵清蛋白，在pH5.0；(pI4.6)(b)乳球蛋白，在pH5.0和7.0；(pI5.2)(c)胰凝乳蛋白酶原，在 pH5.0、9.1和11。(pI9.1) (a)

16、正极 (b)负极，正极 (c)负极，不动，正极蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特在某些物理和化学因素作用下，其特定的定的空间构象被破坏空间构象被破坏，即有序的空间结，即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其构变成无序的空间结构，从而导致其理理化性质改变化性质改变和和生物活性丧失的现象生物活性丧失的现象。2.蛋白质的变性和复性蛋白质的变性和复性造成变性的因素造成变性的因素 物理因素：紫外线照射、超声波、物理因素：紫外线照射、超声波、高温、高压。高温、高压。 化学因素：强酸、强碱、重金属盐、乙醇等有机化学因素：强酸、强碱、重金属盐、乙醇等有机

17、 溶剂及变性剂等溶剂及变性剂等。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。改变蛋白质的一级结构。蛋白质变性，表现为：蛋白质变性，表现为：1.1.物理性质改变疏水基团外露，溶解度降低，粘物理性质改变疏水基团外露，溶解度降低，粘度增加，扩散系数降低，常伴随蛋白质的沉淀。度增加，扩散系数降低，常伴随蛋白质的沉淀。2.2.生物活性丧失变性的主要标志。生物活性丧失变性的主要标志。3.3.生化性质改变分子结构松散，易被蛋白质水解生化性质改变分子结构松散，易被蛋白质水解酶水解。酶水解。 应用：应用：临床医学上，变性因素常被应用来消临床医学上，变性因素常被应

18、用来消毒及灭菌。毒及灭菌。蛋白质的复性：变性的蛋白质当去除变性因素后，蛋白质可重新恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。蛋白质的复性与导致变性的因素、蛋白质的种类以及分子结构改变的程度有关。一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的一级结构二二硫硫键键 天然状态，有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、-巯基乙醇肽链伸展，失去活性3.3.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 v 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素水化膜水化膜颗粒表面电荷颗粒表面电荷1.蛋白质的胶体性质：

19、蛋白质的胶体性质：蛋白质分子：生物大分子，分子量蛋白质分子：生物大分子，分子量 1100万，分子的直径可达万，分子的直径可达1100nm，胶体范围。胶体范围。+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀：由于受到某些因素的影：由于受到某些因素的影响，蛋白质从溶液中析出的现象。响，蛋白质从溶液中析出的

20、现象。沉淀和变性的区别：沉淀时空间结构不一定被破坏，蛋白质仍有生物活性，若恢复原来的条件，蛋白质可重新溶解。变性的蛋白质易于沉淀，沉淀不一定变性。变性的蛋白质易于沉淀，沉淀不一定变性。4.蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀（1 1）盐析）盐析 不导致蛋白质的变性不导致蛋白质的变性蛋白质的盐溶：在盐浓度很低时，向蛋白质溶液中加入少量的中性盐，蛋白质的溶解度增加的现象。蛋白质的盐析：当加入大量的中性盐后，蛋白质的溶解度下降，沉淀析出的现象称为盐析。 硫酸铵、氯化钠、硫酸钠、氯化钾 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。蛋白质胶体溶液稳定性的影响因素（2）有机溶剂 乙醇、丙酮非极性有机溶剂可降低介质的介电常数，破坏蛋

21、白质水化膜，使其沉淀。（3）重金属盐类 pHpI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+，Pb2+， Cu2+等）结成不溶性沉淀。（4）生物碱试剂和酸类 单宁酸、三氯乙酸、硝酸、硝基水杨酸 pH pI时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。（5）加热变性（6）等电点沉淀法5.蛋白质的颜色反应双缩脲反应双缩脲反应、酚试剂反应、米伦反应等6.蛋白质的含量测定考马斯亮蓝染色法、紫外吸收法、凯氏定氮法等考马斯亮蓝染色法、紫外吸收法、凯氏定氮法等 电泳电泳 前处前处理理粗粗分分离离细细分分离离生物细胞或组织生物细胞或组织 无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速离心解、差速离

22、心选择性沉淀法选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子交离子交换层析换层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析盐析、等电点沉淀、盐析、等电点沉淀、有机溶剂有机溶剂二、蛋白质的分离和分析技术二、蛋白质的分离和分析技术溶解度不同分离1.透析和超过滤透析和超过滤初步分离纯化常利用不同蛋白质在溶液和盐中溶解度的差别，硫酸铵常用于分级分离。再通过透析将硫酸铵除去。半透性膜超过滤是利用压力或离心力，使水和其它小分子溶质通过半透膜，蛋白质被截留在膜上。2.层析（色谱）层析（色谱）1. 1.层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离样品（流动

23、相）流过固定相时，待分离样品（流动相）流过固定相时，样品中的各个成分与固定相进行不同程度样品中的各个成分与固定相进行不同程度的相互作用，并以不同速度流经固定相而的相互作用，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。达到分离蛋白质的目的。2 2、蛋白质分离常用的层析方法、蛋白质分离常用的层析方法v离子交换层析：利用各种蛋白质的电离子交换层析：利用各种蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。荷量及性质不同进行分离。v凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层又称分子筛层析或排阻层析，利用析或排阻层析，利用各各蛋白质相对分子蛋白质相对分子质量大小进行分离。质量大小进行分离。将含有天冬

24、氨酸(pI=2.98)、甘氨酸(pI=5.97)、苏氨酸(pI=6.53)、亮氨酸(pI=5.98)和赖氨酸(pI=9.74)的pH3.0柠檬酸缓冲液，加到预先同样缓冲液平衡过的强阳离子交换树脂中，随后用该缓冲液洗脱此柱，并分别收集洗出液，这5种氨基酸将按什么次序洗脱下来？Asp, Thr, Gly, Leu, Lys交联葡聚糖交联葡聚糖聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺琼脂糖琼脂糖1.将称为配体的分子共价结合在层析柱的固体材料上，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配体发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。2.被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。亲

25、和层析亲和层析3.3.电泳电泳带电的蛋白质在电场中能向与其所带电的蛋白质在电场中能向与其所带电荷相反的方向移动。通过蛋白质在带电荷相反的方向移动。通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术术, , 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根据支持物的不同，可分为薄膜电根据支持物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。泳、凝胶电泳等。 几种重要的蛋白质电泳：几种重要的蛋白质电泳：*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于，常用于蛋白质分子量的测定。蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点，通过蛋白质等电点的差异而

26、分离蛋白质的电泳方法。的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的是蛋白质组学研究的重要技术。重要技术。电泳迁移率与多肽链的分子量的关系：电泳迁移率与多肽链的分子量的关系：前沿染料迁移距离样品迁移距离r=lgMr= a - brSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS ： amino acids1：2十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS ）HS-CH2CH2OH巯基乙醇巯基乙醇SDS和巯基乙醇和巯基乙醇十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠原态蛋白质原态蛋白质变性？磺酸基磺酸基 极性亲水极性亲水烷基烷基 亲油（蛋白质疏水区）亲油（蛋白质疏水区）等电聚焦电泳等电聚

27、焦电泳双向电泳双向电泳蛋白质一级结构的测定1953年年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构测定了胰岛素的一级结构蛋白质一级结构测定的步骤。蛋白质一级结构测定的步骤。1.测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。关系，即可确定多肽链的数目。2.多肽链的拆分多肽链的拆分几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用

28、8mol/L尿素或尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基亚基). 3.二硫键的断裂v几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。二硫苏糖醇v过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键4.测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。5.分析多肽链的分析多肽链的N-末端和末端和C-末端。末端。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。 N-端氨基酸：端氨基酸： S

29、anger法。法。2,4-二硝基氟苯二硝基氟苯氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐端逐 个的向里水解。个的向里水解。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端末端 的肽键速度最大。的肽键速度最大。C-端氨基酸端氨基酸： 羧肽酶法：羧肽酶法：肽链外切酶，它能从多肽链的肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解。端逐个的水解。 肼解法：肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨

30、基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与质而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。H2NCH CROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCH CRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸6.多肽链断裂成多个多肽链断裂成多个小片小片段段。 可采用两种或多种不同的断裂方可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离肽段或肽碎片，并将其分离、纯、纯化化。 （1）酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，葡萄

31、球菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶Trypsin：R1为赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶 或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）R1为苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr侧链。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点糜蛋白酶糜蛋白酶 Pepsin：R2为苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr和亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸侧链水解速度较快。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点胃蛋白酶

32、胃蛋白酶（2）化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高丝氨酸内酯7.测定测定各各肽段的氨基酸顺序。肽段的氨基酸顺序。Edman （苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实氨基酸顺序分析法实际上也是一种际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链重复循

33、环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和端氨基酸残基逐一进行标记和解离。解离。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。一种从流感病毒中提取的对其入侵细胞有重要作用的蛋白质的肽链，一种从流感病毒中提取的对其入侵细胞有重要作用的蛋白质的肽链，可以用可以用CNBr(溴化氰）和溴化氰）和Pepsin（胃蛋白酶）（胃蛋白酶） 降解成小的片断。降解成小的片断。CNBr 降解而成的片断为降解而成的片断为:Arg-Thr，Phe-Ser-Met， Arg-Thr-Phe-Arg-Thr-Met.

34、Pepsin （胃蛋白酶）降解而成的片断为：（胃蛋白酶）降解而成的片断为：Arg-Thr，Phe-Ser-Met-Arg-Thr，Phe-Arg-Thr-Met.求正确的氨基酸残基排列顺序。求正确的氨基酸残基排列顺序。8.确定肽段在多肽链中的次序。确定肽段在多肽链中的次序。Arg-Thr-Phe-Arg-Thr-Met-Phe-Ser-Met-Arg-Thr9.确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析。后，将每个肽段进行组成及顺序分析。然后同与用胃蛋白酶处理的事先断开二硫键的肽段进然后同与用胃蛋白酶处理的事先断开二硫键的肽段进行比较，确定二硫键的位置。行比较，确定二硫键的位置。1.名词解释：等电点、必需氨基酸、兼性离子、肽键、肽平面、名词解释：等电点、必需氨基酸、兼性离子、肽键、肽平面、蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、四级结构、蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、四级结构、-螺旋、螺旋、-折叠、