第七章遗传育种

1、l几个概念：l（1） 遗传型（遗传型（Genotype）又称基因型）又称基因型它是指某一生物个体所含有的全部遗传因子的总和。遗传物质起决定性作用，而外界环境可以影响其表型，即： 遗传型+环境条件=表型l（2）表型：表型：指肉眼可以观察到的某一生物所有具有的一切外部特征。 （3）变异：）变异：指生物体在内因或外因的作用下引起的遗传物质的改变。 （4）饰变饰变（modification）：是指外表的修饰性改变，意即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表现变化。它是不遗传的，是一种外表现象。 l一、三个经典试验一、三个经典试验l（一）（一） 转化实验：转化实验：1928年英国的细菌

2、学家格里菲斯（Griffith）首先发现肺炎球菌的转化现象。肺炎球菌是一种病原菌，存在两种类型：光滑型（S）和粗糙型（R，Rough）S型有荚膜，菌落光滑，能使人和动物得病死亡。R型无荚膜，粗糙，不能使人和动物得病。 实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。 离体条件下进行了转化实验：（1） （1）从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA、蛋白质、荚膜多糖等） （2） 对各组分进行转化试验。从上述结果中可知，只有S型细菌的DNA才能将S的R型转化为S型，而且DNA纯度越高，转化效率也越高，直到只取用纯度为6*10-

3、6g的DNA时，仍有转化能力，这就说明，S型菌株转移给R型菌株时，决不是某一遗传性状（在这里是荚膜多糖）的本身，而是以DNA为物质基础的遗传因子。 l首先将Ecoli培养在放射性32PO43或 35SO42作为P或S源的培养基中，结果35S 存在于蛋白质，而32P只存在于核酸，然后让T2噬菌体侵染，从而使T2被标记上S和P，接着让具放射性的T2感染不含放射性元素的大肠杆菌，并在噬菌体复制前进行搅动并离心，得上清液和沉淀物，结果发现S位于上清液而P位于底部，这说明蛋白质外壳没有进入Ecoli，由于搅动而脱落，且较轻，故位于上部，而DNA进入菌体，且较重，被沉淀下来。对沉淀液进行培养发现有大量完整

4、的T2噬菌体出现，因此证实了DNA是遗传信息的载体。l1965年美国学者法朗克-康勒特（H、FraenrelConrat）用含RNA的烟草花叶病毒进行了植物病毒重建实验。他将TMV（烟草花叶病毒）放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，将它的蛋白质外壳与RNA核心分离，RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草，且能分离出正常的病毒离子，证明RNA是遗传物质，另外，他还选用了另一株与TMV近似的霍氏车前花叶病毒（HRV）进行实验。 从图中可以看出，用TMV的RNA和HRV的蛋白质外壳重建的杂合病毒去感染烟草时，烟叶上出现的是典型的TMV病斑。再从分离出来的新病毒中分析发现，它是未带有任何HRV痕迹的典

5、型TMV病毒，反之亦然。这充分地证明了核酸决定蛋白质，是遗传物质。l1、细胞水平、细胞水平 2、细胞核水平 3、染色体水平（1）染色体数：（2）染色体倍数l4核酸水平（1）核酸种类）核酸种类（2）核酸结构）核酸结构（3）DNA长度长度 l 5、基因水平、基因水平 6、密码子水平、密码子水平 7、核苷酸水平、核苷酸水平l1定义和特点定义和特点凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭会环状的dSDNA分子，即 cccDNA，就是典型的质粒质粒。l严紧型复制控制严紧型复制控制：l松弛型复制控制：松弛型复制控制：l质粒消除：质粒消除：l附加体：附加体：l整合：整合：l操作的优点：l体

6、积小，便于DNA的分离和操作；l呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定；l有不受核基因组控制的独立复制起始点；l拷贝数多，使外源DNA可很快扩增；存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。l其优点是：l体积小l高拷贝数（ 2030个细胞）；l可扩增到含10003000个质粒；l分离容易；l可插入较多的外源DNA（不超过10kb）；l结构完全清楚l有两个选择性抗药标记（l可方便地通过转化作用导入宿主细胞。 l3质粒的分离与鉴定质粒的分离与鉴定 4质粒的种类质粒的种类l大致可分5类，接合质粒；抗药性质粒；产细菌素和抗生素质粒；具生理功能的质粒；产毒质粒等。见P199表7-4l （

7、1）F质粒质粒 l（2）R质粒质粒l（3）Col质粒质粒l（4）Ti质拉质拉l（5）Ri质粒质粒l（6）mega质粒质粒l （7）降解性质粒）降解性质粒l一、一、 基因突变：基因突变：简称突变，是指生物体内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化。突变机率一般在10-6-10-9。l（一）（一） 突变类型：突变类型：突变的类型很多，我们按突变后极少数变株的表型是否能在选择培养基上加以鉴别区分，分为选择性突变株选择性突变株（Selection Mutont）：）：凡能用选择性培养快速选择出来的突变株。反之称为非选择性突变株。非选择性突变株。l选择性突变株有选择性突变株有：营养缺陷型、抗性突变型、

8、条件致死突变型。l非选择性突变株有：非选择性突变株有：形态突变型、抗原突变型和产量突变型。 l某野生型菌株（Wild Tyain Strain）由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力。因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型称-。加上某生长因子可生长。 （2） 抗性突变型：（抗性突变型：（Resist Mutant）l由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类型。 l（3） 条件致死突变型（条件致死突变型（Condtimal Lethal Mutant）：）：l某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并实现基表型，而在另一种条件下却无

9、法生长繁殖的突变类型称为-。 l指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。 l（5） 抗原突变型（抗原突变型（Contigenic Mutant）：）：l 由于基因突变而引起的抗原结构发生突变的变异类型。如细胞壁缺陷变异（L型细菌）、荚膜变异或鞭毛变异等。l（6） 产量突变：产量突变：l由于基因突变而获得的代谢产物产量上高于或低于原始菌株的突变株，称为-。前者为正突变，后者为负突变。 l每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率称突变率。l突变是独立发生的，一个基因突变不会影响其它基因的突变率，这一点也说明一个细胞同时发生两个基因突变的几率是极低的，为每个基因突变率的乘积。 l（

10、1） 不对称性：不对称性：l指突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。这一说法乍听似乎很矛盾，如：细菌在含青霉素的环境下，出现了抗青霉素突变体；在紫外线作用下产生了抗紫外线突变体等。从表面看他们似乎有直接的关系，是诱因，其实不然，原因是原群体中本来就有抗霉素突变株，只是在青霉素作用下把它选择了出来。（2）自发性：）自发性：各种突变可以在没有诱因的情况下发生，即自然界中时时存在突变。（3）稀有性）稀有性：自发突变随时发生，但对某一特定基因其发生率极低10-610-9。（4）独立性：）独立性：即每一个基因发生突变是独立的，没有相互关联。（5）诱变性：）诱变性：即通过诱变剂可提高突变率。一般可

11、提高10105倍。（6）稳定性：）稳定性：由于突变是遗传物质结构发生变化，因而具有遗传稳定性。 （7）可逆性：）可逆性：原始野生型变为突变型为正向突变。相反称为回复突变或回变。 （四）四） 基因突变的自发性和不对应性的证明：基因突变的自发性和不对应性的证明： 1、变量试验：（Fluctuation Test）：证明证明：抗性突变体是在接触噬菌体前就出现了，出现突变的时间越早，产生的菌落就越多，说明抗性突变体的出现与是否接触噬菌体无关。 2、 涂布实验：（涂布实验：（Newcombe Expetiment）结果：结果：发现，在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，要比未经涂布过的28个，多得多

12、。说明：说明：该抗性突变发生在未接触噬菌体之前。噬菌体的加入只不过起甄别作用，而不是诱导突变的因素。 3、平板影印培养试验（、平板影印培养试验（Replica Plating） （五）五） 基因突变的机理：基因突变的机理：l（1） 碱基置换：碱基置换：l置换置换是染色体一点微小的损伤，也称点突变。一般只涉及一对碱基，置换又可分成两种情况，即转换和颠转换和颠换换。l转换转换（Transition）即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或一个嘧啶被另一个嘧啶置换。l颠换颠换（Transversion）即一个嘌呤被另一个嘧啶或一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。l（2） 移码突变（移码突变（Frame-Shif

13、t Mutation）：）：l指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。l吖啶类染料：如原黄素、吖啶黄和-氨基吖啶等。都是能引起移码突变。 缺失：缺失：染色体丢失了部分片段称-重复：重复：在一对同源染色体的不同部位上各有一个断裂点，一条染色体的断片接到另一条染色体的相应部位，结果使后者发生重复。易位：易位：两条非同源染色体同时发生断裂，断片相互交换位置后重接，就形成易位。倒位：倒位：一条染色体两处发生断裂后，中间的片段转动180后重接就叫-（1）IS 特点是分子量最小（仅 0 .7 1.4kb），只能引起转座（t

14、ransPOsition）效应而不含其他任何基因。因Is在染色体组上插入的位置和方向的不同，其引起的突变效应也不同。IS引起的突变可以回复，其原因可能是IS被切离，如果因切离部位有误而带走IS以外的一部分DNA序列，就会在插入部位造成缺失，从而发生新的突变。 与IS和Mu噬菌体相比，Tn的分子量是居中的（一般为225kb）。它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其他基因。Tn虽能插到受体DNA分子的许多位点上，但这些位点似乎也不完全是随机的，其中某些区域更易插入。（3）Mu 噬菌体 它是Ecoli的一种温和噬菌体。与必须整合到宿主染色体特定位置上

15、的一般温和噬菌体不同，Mu噬菌体并没有一定的整合位置。与IS和Tn两种转座因子相比，Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。Mu噬菌体引起的转座可以引起插入突变，其中约有2是营养缺陷型突变。 l自发突变是指在没有人工参与下生物体自然发生的突变。自发突变并不是没有原因，而是人们认识不到。下面介绍几种自发突变的可能机制：l（1） 背景辐射和环境因素引起突变：背景辐射和环境因素引起突变：l如宇宙空间的各种短波或高温现象等。自然界中普遍存在的一些低深度物质等。l（2） 微生物自身有害代谢产物的诱变效应：微生物自身有害代谢产物的诱变效应：l如：H2o2，它是微生物体内一种较普遍的代谢产物

16、，它对某些种类的微生物有诱变作用，如脉孢菌。l（3） 互变异构效应：互变异构效应：l是由于ATCG四种碱基在化学结构上发生异构现象而引起DNA复制合成时出现错误。 (4)环出效应：环出效应： 即环状突出效应，因为DNA是由两条单链组成，如果其中一条单链在复制时出现一个小环，则小环上的基因就会在复制时被越过，从而发生突变。 l紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻相邻嘧啶间嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链间结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。 l但微生物具有一定对损伤后的但微生物具有一定对损伤后的DNA修复修复的能力。的能力。

17、 l把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下，可明显降低其死亡率，这种现象就称为-。l实验：用Ecoli.将8*106个/ml的Ecoli用紫外线照射一定时间后，发现只有100个/ml的Ecoli存活；如果有照射后，立即放到可见光下30min,则存活量为2*106个/ml l原理原理：是在黑暗的条件下，光激活酶与胸腺嘧啶二聚体结合，当有光的情况下，该酶发挥作用，使二聚体再分解成单体 l又称切除修复，它是用来修复活细胞内被损伤的DNA的一种机制。只是这种修复与光没有关系。 l过程：过程：（1）内切核酸E先在二聚体的5端切开一个缺口。（2）外切核酸E从5到3端将二聚体切除。（3）在DNA聚合酶的

18、作用下，以DNA的另一条互补链为模板，重新合成一段DNA链。（4）通过连接E的作用把新合成的一段DNA连接起来。即完成修复。 l（一）（一） 自发突变与育种：自发突变与育种：l1、 从生产中自然选种：从生产中自然选种：l在工业生产中，微生物总是以一定频率发生着突变，一些有经验的微生物工作者，可以通过观察，发现一些向正向突变株。然后进行分离、纯化、试验等。即可找到一个好种。l2、 定向培育优良品种：定向培育优良品种：l定向培育定向培育是指用某一特定因素（如温度、药物）长期处理某微生物群体，并不断移种传代（目的是增加突变频率），以达到累积并选择相应自发突变株的目的。是一种古老的育种方法。l但由于自

19、发突变频率低，变异程度轻微，故速度缓慢，效果不明显。 梯度平板筛选法 （筛选代谢物拮抗物的突变株 ） （二）诱变育种：（二）诱变育种：是指采用物理或化学的方法处理微生物细胞群，促使其显著提高突变率，然后再筛选优良突变株的方法，称-。 1、诱变育种的基本环节：诱变育种的基本环节：l（1） 选择简便有效的诱变剂：选择简便有效的诱变剂：l原则：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。有了合适的诱变剂，还要采用简便有效的诱变方法 艾姆斯试验艾姆斯试验 用艾姆斯试验测定潜在化学致癌物的基本原理是：鼠伤寒沙门氏菌即“S.t ”的的组氨酸缺陷型

20、（his）菌株在基本培养基平板上不能生长，如发生回复突变则能生长。 l这一点主要在生产中积累的经验。lA、 选择生产中选育过的自发突变株。lB、 采用具有有利性的菌株（生长速度快，营养要求低等）lC、 选择已发生过其它变异的菌株，可提高其它诱变因素的敏感性。lD、 选择增变菌株，因为它对诱变剂的敏感性较高。lE、 选择能产生所需代谢物的菌株。l（3） 最好处理单细胞悬液：最好处理单细胞悬液：单细胞悬液分散均匀，能普遍接触诱变剂；且能长出纯菌落。l（4） 选用合适的诱变剂量。选用合适的诱变剂量。l即选择一个能显著提高诱变率，又能增加变异幅度的剂量。l物理因素诱变剂量物理因素诱变剂量=强度强度*时

21、间时间l化学因素诱变剂量化学因素诱变剂量=浓度与处理时间来表示浓度与处理时间来表示l（5） 充分利用复合处理的协同效应：充分利用复合处理的协同效应：l如： A两种或多种诱变剂的先后使用lB 同一种诱变剂重复使用。lC两种或多种诱变剂的同时使用。l采用复合处理方法，可显著提高诱变效果。l（6）利用形态、生理与产量间的相关指标选择：）利用形态、生理与产量间的相关指标选择： （7）设计高效的筛选方案和方法：）设计高效的筛选方案和方法：筛选方案：筛选方案：初筛以量为主，复筛以质为主。步骤是： l一般也可采用初筛和复筛两种方法对突变株进行生产性能测定。l初筛：初筛：可在平板培养皿中进行，亦可在摇瓶中进行

22、，特点是快速简便，工作量小，直观性强（可直接观察到生长圈、变色圈、透明圈等现象）缺点是：与发酵罐中进行液体深层条件差距较大。l复筛：复筛：对突变株的生产性能作比较精确的定量测定采用复筛的方法。一般是将微生物接种在三角瓶内的液体培养基中作振荡培养，然后对培养液进行分析测定。其优点是：培养液接近发酵罐的条件，能够测定较精确的数据。 筛选方法举例1、产量突变型的筛选（2）抗药性突变株的筛选：）抗药性突变株的筛选： l（3）营养缺陷型突变株的筛选：）营养缺陷型突变株的筛选：l与营养缺陷株有关的三种培养基lA、基本培养基：（、基本培养基：（MM，Minimal Medium）：）：指仅能满足某微生物的野

23、生型菌株生长需要的最低成分组合培养基，不同种类的微生物其MM是不一样的。lB、完全培养基（、完全培养基（CM Complete Medium）：）：凡能满足一切营养缺陷株营养需要的培养基称-。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素和碱基之类的天然物质（如蛋白胨、酵母膏等）。lC、补充培养基（、补充培养基（SM Supple Madium）：）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为-。它是由基本培养基再添加某种营养缺陷型菌株所不能合成的物质构成的。l与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体：lA、野生型：（、野生型：（Wild Type）：）

24、：l在自然界中分离的任何微生物在其发生营养缺陷突变之前的原始菌株，称该种微生物的野生型。 A+B+lB、营养缺陷型（、营养缺陷型（Auxo Troph）：）：l野生菌株经诱变后，由于丧失了某种酶的合成能力，因而只能在添加了该E合成产物的培养基上生长，这类菌株称-。A-B+lC、原养型（、原养型（Prototroph）：）：l一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。A+B+l营养缺陷型的筛选方法：营养缺陷型的筛选方法：l 诱变处理同上：淘汰野生型：。l抗生素法：抗生素法：主要是利用抗生素对微生物具有抑制作用。如，用青霉素法，可以杀死生长繁殖着的细菌，但不能

25、杀死未萌发或休眠的细菌。在含青霉素的培养基中野生型细胞被抑制，而“浓缩”缺陷型。l菌丝过滤法：菌丝过滤法：适用于丝状的真菌或放线菌，原理是在基本培养基上，野生型孢子可萌发成菌丝，而缺陷型可休眠。如用合适的滤纸，可将缺陷型孢子过滤出来，如此重复便可得缺陷型。 （1） 检出缺陷型：检出缺陷型： 夹层培养法：夹层培养法： l限量补充培养法：限量补充培养法：把诱变处理后的细胞接种在含微量（0.01%）蛋白胨的基本培养基上，野生型迅速生长，而生长较慢的多为缺陷型。也可在基本培养基上加入微量相应物质，从而得到某一特定营养缺陷型。l逐个检出法：逐个检出法：把经过诱变的细胞涂布在平板上，待长出单个菌落后，用接

26、种针把单个菌落逐个地分别接种到基本培养基和另一完全培养基上，培养，如果在完全培养基的某一个部位长出菌落，而在基本培养基上相应部位却不长，说明是一营养缺陷型菌株。l影印接种法：影印接种法：将诱变处理后的细胞涂布在一完全培养基的表面上，经培养长出许多菌落，用影印法将其接种到另一基本培养基平皿上，培养，比较两平板的菌落，如果发现在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的菌落就是一个营养缺陷型。 l（4）鉴定缺陷型：）鉴定缺陷型：l可用生长谱法生长谱法来进行，步骤是：把营养缺陷型细胞或试管斜面上的孢子洗下，经清洗，配成10-10个/mol的悬液，与基本培养基混合，在皿背面划上若干区域，加上微量试剂；

27、培养；观察后。l(5)营养缺陷型的应用：营养缺陷型的应用：l作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传规律所不可缺少的标记菌种；作为氨基酸、维生素、碱基等物质生物测定的实验菌种；在生产中，可直接用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；也可作为菌种杂交、重组育种和利用基因工程进行育种时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株。 l概念：概念：凡把两个不同性状的个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新型遗传个体的方式称-或遗传重组。l一、一、 原核微生物的基因重组：原核微生物的基因重组：l原核微生物基因重组的主要方式主要方式有转化、转导、接合和

28、原生质体融合等几种形式。l受体菌直接接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象就称转化或转化作用。l感受态（感受态（competence）：指受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。不同细胞感受态出现的时期不同，现已知感受态因子是一种胞外蛋白质，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来，便于接合。l转化因子的本质是DNA，实现转化所需的DNA浓度是极低的。l转化现象在原核生物中较为普遍；在放线菌和兰细菌以及少数真核微生物中也有报道，但较少。 转化步骤：转染：转染： 如果把噬菌体或其他病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去

29、感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒后代，这种现象称转染转染（transfection）。l它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。 l以噬菌体为媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合从而使后者获得前者部分遗传性状的现象称为转导转导。获得新遗传性状的受体细胞就称为转导子转导子。（Transductant）l或（遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组现象称为-） l1、 普遍性转导（普遍性转导（Generalized Transeuction）l噬菌体在侵染寄主细胞后在寄主

30、细胞内复制，在其装配阶段，正常情况下，是将自身的DNA包装在衣壳里，异常情况下，将寄主细胞的一段DNA包裹进去，而自身的DNA却没有包进去，这种包裹寄主DNA片段的噬菌体，当侵染新的寄主时，由于没有自己的DNA，或自己的DNA不完整，不能在新的寄主细胞里进行复制，因此不能使新寄主裂解，但却能将所包裹的DNA片段带入寄主并与寄主细胞的DNA进行基因重组，从而使寄主细胞发生变异。l普遍性转导这一名词的来源是由于通过这种转导，可以把供体菌的任何一段DNA片段带给受体细菌。 （1）完全普遍转导：）完全普遍转导： l在普遍性转导过程中，进入到受体菌的供体细菌DNA片段不与受体细菌DNA整合，也不进行复制

31、，但随着受体细菌的分裂，在两个子细胞中只能有一个能得到这种来自供体细菌的DNA片段，这种转导称为-（Abortive Trsnsduction） l指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。l特点特点是：只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率的误切或由于双重溶源菌的裂解而形成；局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。 （1）低频转导：低频转导：指通过一般溶源菌

32、释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成极少数转导子（10-410-6），故称。举例说明：大肠杆菌噬菌体参与局限性转导。 l（2）高频转导子（）高频转导子（HFT）在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含50左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，就可获得高达50左右的转导子，故称 l（3）溶源转变）溶源转变当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象，称溶源转变。l1、定义：、定义：l供体菌（雄）通过直接接触（其性菌毛）受体菌（雌），而产生的遗传信息的转移和重组过程叫接合接合。前者

33、传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状。把通过接合而获得新性状的受体细胞就称为接合子接合子。 2、E.coli的的4种接合型菌株：种接合型菌株： （1）F+菌株：菌株：（雄，F因子在细胞内游离）。当F+菌株与F-菌株接触时，通过性菌毛将复制的F质粒传给F-使其变成F+ （2）F-菌株：菌株：雌株，无F因子和性菌毛，它可通过与F+和F，接合使其成为雄株，也可接受来自Hfr菌株的一部分或整套核基因组DNA，但这种情况较少。（3）Hfr菌株：（高频重菌株：（高频重组菌株组菌株）在Hfr菌株细胞中，因F质粒已从游离态转变

34、成在核染色体组特定位点上的整合态，故Hfr菌株与F-菌株相接合后，发生基因重组的频率要比单纯用F+与F-接合后的频率高出数百倍，故名。 l（4）F菌株菌株当Hfr菌株细胞内的F质粒因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的、但携带整合位点邻近一小段核染色体基因的特殊F质粒，称F质粒或F因子。凡携带F质粒的菌株，称为初生F菌株，其遗传性状介于F+与F-菌株之间；通过F菌株与F一菌株的接合，可使后者也成为 F菌株，这就是次生 F菌株，它既获得了 F质粒，同时又获得了来自初生F菌株的若干原属 Hfr菌株的遗传性状，故它是一个部分双倍体（图 7-30）。以F质粒来传递供体基因的方式，称为F质粒转

35、导或F因子转导、性导或F质粒媒介的转导。与上述构建不同Hfr相似的是，因为F质粒可整合在E.coli核染色体组的不同位置上，故可分离到一系列不同的F质粒，从而可用于绘制细菌的染色体图 以上三种雄性菌株通过性纤毛与雌性菌株接合，可产生以下结果： 1、F+和F-接合产生二个F+菌株 2、 F、菌株和F-菌株接合产生二个F、菌株 3、Hfr和F-接合情况较为复杂 通过人为的方法，使遗传性不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。 ( 四）原生质体融合（四）原生质体融合（protoplast fusion） 步骤步骤 原核细

36、胞与真核细胞都能进行融合。l在真核微生物中，基因重组的基本方式有：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。我们只介绍有性杂交和准性杂交。 l（一）（一） 有性杂交：有性杂交：l是发生在细胞水平上的一种遗传重组方式。 凡能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，原则上都可采用有性杂交的方法进行育种。 l甲菌、乙菌分别接种产生子囊减分产生4个子囊孢子/子囊分别将子囊冲洗下来破坏子囊使孢子释放（E法研磨）分别离心得孢子（n）将孢子涂布平板得菌落（n）将菌落细胞混合离心，使接触新组合双倍体出现筛选良种 l准性生殖准性生殖是一种类似于有性生殖，但更原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合

37、，且不以减数分裂的方式导致低频率的基因重组的一种育种方式。l准性杂交常见于真菌、尤其是半知菌中。l过程：过程：l同种不同菌株的菌丝相互靠拢并接触-质配、核配异核体（偶尔）核融合形成杂合二倍体有丝分裂杂合双倍体分离筛选育种 准性杂交举例 灰黄霉素生产菌荨麻青霉的准性育种 选择亲本：即选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作为准性杂交的亲本。选择亲本：即选择来自不同菌株的合适的营养缺陷型作为准性杂交的亲本。 强制异合：即用人为的方法强制两菌株形成异核体。强制异合：即用人为的方法强制两菌株形成异核体。 移单菌落：将培养皿上长出的这种单菌落移种到基本培养基移单菌落：将培养皿上长出的这种单菌落移种到基本培养

38、基的斜面上。的斜面上。 验稳定性：就是检验新菌株究竟是不稳定的异核体，还是稳定的杂合二倍体验稳定性：就是检验新菌株究竟是不稳定的异核体，还是稳定的杂合二倍体。 促进变异：促进变异： l又叫遗传工程或重组遗传工程或重组DNA技术技术。是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质（DNA大分子）提取出来，在离体情况下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，再一起导入某一更容易生长、繁殖的受体细胞中，让外源DNA进行正常的复制和表达。l基因工程是一种在离体情况下，人为可以设计的可超远缘杂交的一种定向育种方式。我们把获得新功能的微生物称为“工程菌工程菌”，动植物称为“工程动植物或

39、转基因动植物工程动植物或转基因动植物”。 l1、 取得目的基因：取得目的基因：方法：A：可用密度梯度超离心方法，从供体生物中得到；B；通过反转录酶的作用由mRNA合成DNA。C：由化学方法合成特定功能的基因。2、选择适当的载体：、选择适当的载体：载体必须符合以下条件：(1)具有自我复制能力；（2）能在受体细胞内大量增殖；（3）载体上最好只有一个限制性内切酶的切口，使目的基因能融合到载体的固定位置上；（4）载体上必须有一种选择性遗传标记，以便及时把极少数“工程菌”或“工程细胞”选择出来。3、目的基因与载体、目的基因与载体DNA的体外重组的体外重组4、将重组载体引入受体细胞：、将重组载体引入受体细

40、胞：（一）工业上：（一）工业上：（二）农业上：（二）农业上：（三）医疗事业：（三）医疗事业：（四）环保事业：（四）环保事业：（五）促进生物学基本理论的研究。（五）促进生物学基本理论的研究。 l在基因工程中，外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增，这种以扩增外源DNA为目的的载体，称为克隆载体（cloning vector）.l目前基因工程中使用的载体均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体、入噬菌体载体、柯斯质粒载体、M13噬菌体载体、真核细胞的克隆载体、人工染色体等。l我们来了解一下：l 特性：（1）具有独立复制起点，这是必须的（2）具有较小的相对分子量。

41、有利于DNA的分离操作，但携带的DNA也小（3）具有较高的拷贝数。每个细胞中要含有数千个拷贝（4）具有便于选择的标记。（5）易于导入细胞（6）具有安全性。此质粒不具转移功能，可防止携带外源DNA的重组质粒扩散到实验室外，造成危害。l种类：PBR322（最常用最具代表性）、PUC系列、PGEM系列等。（都是人工构建的） l是一类很有价值的载体。具有很多优点：（1）遗传背景清楚（2）容量大（可23KB外源DNA）（3）具有较高的感染率l（三）（三） 柯斯质粒：柯斯质粒：l柯斯质粒（cosmid vector）即粘性载体，是由入噬菌体的粘性末端和质粒构成。它含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶位点，以及来自噬菌体粘性末端的DNA片段，即COS位点。l优点：（1）具高感染率（2）具质粒DNA的复制方式（3）可克隆大片段外源DNA。 lM13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状SSDNA，感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后，可变成复制型（RF）DSDNA，然后以滚环方式复制出SSDNA。野生型M13不能作为载体，经