第二章 微生物发酵制药技术

1、学习目标学习目标知识要求知识要求：1.掌握制药微生物菌种的选育及保藏技术，发酵方式、工掌握制药微生物菌种的选育及保藏技术，发酵方式、工艺条件、主要控制参数艺条件、主要控制参数 ；2.熟悉培养基制备及灭菌操作技术；熟悉培养基制备及灭菌操作技术；3.熟悉微生物代谢产物的生物合成；熟悉微生物代谢产物的生物合成；4.了解微生物发酵药物的分类了解微生物发酵药物的分类能力要求：能力要求：1.熟练掌握菌种选育及保藏技术、发酵工艺条件；熟练掌握菌种选育及保藏技术、发酵工艺条件；2.学会培养基制备技术，灭菌操作技术。学会培养基制备技术，灭菌操作技术。第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物

2、发酵制药的发展简史 微生物发酵制药的历史悠久。免疫学方面，我国微生物发酵制药的历史悠久。免疫学方面，我国宋朝真宗年间（公园宋朝真宗年间（公园998-1022998-1022年）就开始利用接种人年）就开始利用接种人痘的免疫技术预防天花病。痘的免疫技术预防天花病。17961796年英国医生年英国医生E.JennerE.Jenner利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。利用接种牛痘苗预防天花并获得成功。 到到1919世纪末，陆续发明了预防或治疗各种细菌性世纪末，陆续发明了预防或治疗各种细菌性传染病的疫苗和类毒素。此后，利用微生物生产疫苗传染病的疫苗和类毒素。此后，利用微生物生产疫苗的研究获得了蓬勃的发展

3、。的研究获得了蓬勃的发展。 第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史 直到第二次世界大战初期，随着人们对抗生素，尤其直到第二次世界大战初期，随着人们对抗生素，尤其是对青霉素重要事件的认识，才大大推动了微生物发酵制是对青霉素重要事件的认识，才大大推动了微生物发酵制药的发展。药的发展。19291929年年FlemingFleming在研究金黄色葡萄糖球菌时偶然在研究金黄色葡萄糖球菌时偶然发现了青霉素，但是当时人们认为动物实验的结果不能指发现了青霉素，但是当时人们认为动物实验的结果

4、不能指导人的医学实践。导人的医学实践。 第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史 直到直到1010年后，才通过动物实验，把青霉素从细菌学家年后，才通过动物实验，把青霉素从细菌学家好奇的物质转变为医学上具有活力的物质。好奇的物质转变为医学上具有活力的物质。19411941年年FlorryFlorry利用发酵技术制备大规模青霉素获得成功。利用发酵技术制备大规模青霉素获得成功。 第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史 1939 1939年年WaksmanWaksman开始系统地有计划地筛选新抗生素。开始系统地有计划地筛

5、选新抗生素。 第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史 随着细胞融合技术和基因工程的问世，为微生物制药随着细胞融合技术和基因工程的问世，为微生物制药来源菌的获得提供了一种有效的手段。工程菌和融合子经来源菌的获得提供了一种有效的手段。工程菌和融合子经发酵后生产原料微生物所不能产生的药物或提高生产效率。发酵后生产原料微生物所不能产生的药物或提高生产效率。同时近年来发酵工艺及其控制研究也得到了发展，利用计同时近年来发酵工艺及其控制研究也得到了发展，利用计算机在线控制以及固定化细胞技术为微生物发酵制药工艺算机在线控制以及固定化细胞技术为微生物发酵制药工艺带来了新

6、的发展空间。带来了新的发展空间。 第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史 我国微生物发酵制药工业起步较晚。我国微生物发酵制药工业起步较晚。 19491949年年 上海建立了青霉素实验所；上海建立了青霉素实验所； 1953 1953年年 5 5月月1 1日上海第三制药厂正式投产青霉素；日上海第三制药厂正式投产青霉素； 19581958年年 建成华北制药厂，投产了青霉素、链霉素、建成华北制药厂，投产了青霉素、链霉素、土霉素和红霉素等品种；土霉素和红霉素等品种；第一节第一节 概概 述述一、微生物发酵制药的发展简史一、微生物发酵制药的发展简史 我国微生物发酵制

7、药工业起步较晚。我国微生物发酵制药工业起步较晚。 1957 1957年年 我国开始氨基酸发酵的研究，我国开始氨基酸发酵的研究，19641964年谷氨酸年谷氨酸发酵成功；发酵成功； 5050年代年代 开始核酸发酵生产；开始核酸发酵生产； 7070年代年代 成功研究出成功研究出“二步发酵法二步发酵法”生产维生素生产维生素C C技术。技术。 目前目前 基因工程药物已经成为研究热点。基因工程药物已经成为研究热点。第一节第一节 概概 述述二、微生物发酵制药研究的内容二、微生物发酵制药研究的内容 微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性技术科学。生

8、产和制剂的综合性技术科学。 内容包括：内容包括： 1.1.微生物制药用菌的选育微生物制药用菌的选育 2.2.发酵发酵 3.3.产品的分离、纯化工艺产品的分离、纯化工艺第一节第一节 概概 述述三、微生物发酵药物的来源三、微生物发酵药物的来源 微生物酶发酵：微生物酶发酵： 微生物代谢产物发酵：微生物代谢产物发酵： 微生物转化发酵：微生物转化发酵：第一节第一节 概概 述述三、微生物发酵药物的来源三、微生物发酵药物的来源 微生物菌体发酵：微生物菌体发酵： 微生物酶发酵：天冬酰胺酶、链激酶微生物酶发酵：天冬酰胺酶、链激酶 微生物代谢产物发酵：微生物代谢产物发酵： 微生物转化发酵：微生物转化发酵：第一节第

9、一节 概概 述述三、微生物发酵药物的来源三、微生物发酵药物的来源 微生物菌体发酵：微生物菌体发酵： 微生物酶发酵：微生物酶发酵： 微生物代谢产物发酵：氨基酸、抗生素微生物代谢产物发酵：氨基酸、抗生素 微生物转化发酵：微生物转化发酵：第一节第一节 概概 述述三、微生物发酵药物的来源三、微生物发酵药物的来源 微生物菌体发酵：微生物菌体发酵： 微生物酶发酵：微生物酶发酵： 微生物代谢产物发酵：微生物代谢产物发酵： 微生物转化发酵：微生物转化发酵：C-1,2C-1,2脱氢脱氢简单节杆菌简单节杆菌醋酸可的松醋酸可的松醋酸泼尼松醋酸泼尼松第一节第一节 概概 述述四、微生物发酵药物的分类四、微生物发酵药物的

10、分类 1.1.抗生素类药抗生素类药 2.2.氨基酸类药氨基酸类药 3.3.核苷酸类药核苷酸类药 4.4.维生素类药维生素类药 5.5.甾体类激素甾体类激素 6.6.治疗酶及酶抑制剂治疗酶及酶抑制剂第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成一、制药微生物的选择一、制药微生物的选择 1.1.样品采集与处理样品采集与处理 2.2.分离方法分离方法 3.3.活性测定活性测定第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育 菌种选育的目的：改良菌种的特性、开发新产品菌种选育的目的：改良菌种的特性、开发新产品 药物高

11、产菌株或分泌型特效药物菌株的选育包括：药物高产菌株或分泌型特效药物菌株的选育包括：自然选育和人工育种。自然选育和人工育种。 人工育种：人工育种： 1.1.诱变育种诱变育种 2.2.杂交育种杂交育种 3.3.基因工程育种基因工程育种第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育（一）自然选育（一）自然选育 注意：遗传特性不稳定，容易继续注意：遗传特性不稳定，容易继续 变异；变异； 需要经常进行选育工作；需要经常进行选育工作； 能提高平均生产水平，但不能提高平均生产水平，但不 能大幅提高。能大幅提高。 第二节第二节 制药微生物与产

12、物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育（一）自然选育（一）自然选育 制备单孢子悬浮液制备单孢子悬浮液分离出单菌落分离出单菌落斜面种子斜面种子高产菌株高产菌株沙土管菌种沙土管菌种斜面种子斜面种子摇瓶复筛摇瓶复筛高产纯化株高产纯化株生产菌种斜面生产菌种斜面第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育（二）诱变育种（二）诱变育种 定义：采用诱变剂处理可以大大提高菌种的突定义：采用诱变剂处理可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出只有优良特性的变频率，扩大变异幅度，从中选出只

13、有优良特性的变异菌株。变异菌株。特点：速度快、收效大、方法简便特点：速度快、收效大、方法简便 缺乏定向性缺乏定向性三个环节：三个环节： 突变的诱发突变的诱发 突变株的筛选突变株的筛选 突变高产基因的表现突变高产基因的表现 第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育1.1.制定筛选目标制定筛选目标2.2.制定筛选方案制定筛选方案 2 2）留种保藏菌种）留种保藏菌种 （1 1）诱变过程）诱变过程 3 3）筛选高产菌株）筛选高产菌株 1 1）出发菌种的斜面）出发菌种的斜面 2 2）单孢子悬浮液制备）单孢子悬浮液制备 3 3）孢子

14、计数）孢子计数 4 4）单菌落分离）单菌落分离 （2 2）筛选过程）筛选过程 1 1）传种斜面）传种斜面第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育3.3.突变的诱发突变的诱发 （1 1）出发菌株的选择）出发菌株的选择 1 1）选择纯种：）选择纯种：产量稳定、波动范围小产量稳定、波动范围小 2 2）选择具有优良性状的出发菌株：）选择具有优良性状的出发菌株：生命力旺盛生命力旺盛 3 3）对诱变剂敏感）对诱变剂敏感 （2 2）诱变剂的选择）诱变剂的选择第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成二、制药微生

15、物菌种的选育二、制药微生物菌种的选育3.3.突变株的筛选突变株的筛选 （1 1）随机筛选）随机筛选 1 1）摇瓶筛选法）摇瓶筛选法 2 2）琼脂块筛选法：）琼脂块筛选法：需经摇瓶复筛验证需经摇瓶复筛验证 3 3）筛选自动化和筛选工具微型化）筛选自动化和筛选工具微型化 （2 2）理性化筛选）理性化筛选第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成三、制药微生物菌种的保藏三、制药微生物菌种的保藏保藏目的：保持菌种的活力，防止退化保藏目的：保持菌种的活力，防止退化保藏环境：低温、干燥、缺氧保藏环境：低温、干燥、缺氧 （一）定期移植保藏法（一）定期移植保藏法斜面培养、液体培养、穿刺

16、培养斜面培养、液体培养、穿刺培养特点：菌株有代谢活性，保存时间不长，特点：菌株有代谢活性，保存时间不长，传代多，菌种易变异传代多，菌种易变异（二）砂土管保藏法（二）砂土管保藏法特点：保存抗生素生产菌，操作简便、特点：保存抗生素生产菌，操作简便、效果好，长达效果好，长达1 1年、变异率低、死亡少年、变异率低、死亡少第二节第二节 制药微生物与产物的生物合成制药微生物与产物的生物合成三、制药微生物菌种的保藏三、制药微生物菌种的保藏（三）液状石蜡保藏法（三）液状石蜡保藏法 斜面保藏的改进型斜面保藏的改进型（四）液氮保藏法（四）液氮保藏法 防止菌种退化的最佳方法防止菌种退化的最佳方法（五）冷冻干燥保藏法

17、（五）冷冻干燥保藏法（六）低温冷冻保藏法（六）低温冷冻保藏法 存活率高，变异率低，实用方便存活率高，变异率低，实用方便（七）谷粒（麸皮）保藏法（七）谷粒（麸皮）保藏法 适用于产孢子放线菌和真菌适用于产孢子放线菌和真菌四、微生物代谢产物的生物合成（四、微生物代谢产物的生物合成（自学自学）第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定一、培养基及其制备一、培养基及其制备 培养基是专门用于提供微生物生长繁殖和生物培养基是专门用于提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。营养物质的混合物。（一）培养基的成分（一

18、）培养基的成分 1.1.碳源碳源 供给菌生命活力所需要的能量，构成菌体供给菌生命活力所需要的能量，构成菌体细胞成分和代谢产物。细胞成分和代谢产物。 葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定一、培养基及其制备一、培养基及其制备 2. 2.氮源氮源 构成微生物细胞和代谢产物中的氮素来源构成微生物细胞和代谢产物中的氮素来源的营养物质，补充碳源。的营养物质，补充碳源。 分为：有机、无机氮源两类分为：有机、无机氮源两类 无机氮源成分单一、无机氮源成分单一、 有机氮源成分复杂，有机氮源成分复杂，质量稳定、易被菌体吸收质量稳定、易被菌

19、体吸收 被菌体利用的速度不同被菌体利用的速度不同利用，铵盐为速效氮源。利用，铵盐为速效氮源。不同比例可调节发酵液的不同比例可调节发酵液的pHpH。第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定一、培养基及其制备一、培养基及其制备 3. 3.无机盐和微量元素无机盐和微量元素 磷：菌体核酸、核蛋白的组成成分，辅酶和高能磷酸磷：菌体核酸、核蛋白的组成成分，辅酶和高能磷酸键的成分，也是氧化磷酸化的必需元素，还可调节键的成分，也是氧化磷酸化的必需元素，还可调节pHpH。 硫：含硫氨基酸的成分，也是某些产物成分。硫：含硫氨基酸的成分，也是某些产物成分。 铁：细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化酶的组成元铁

20、：细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化酶的组成元素。素。 锌、镁、钴：酶的辅酶或激活剂。锌、镁、钴：酶的辅酶或激活剂。 钠、钾、钙钠、钾、钙 4.4.水水 5. 5.前体：前体：内源性、外源性内源性、外源性第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定一、培养基及其制备一、培养基及其制备 （二）培养基的种类与选择（二）培养基的种类与选择 1.1.培养基的种类培养基的种类 （1 1）孢子培养基：制备孢子）孢子培养基：制备孢子 （2 2）种子培养基：）种子培养基： 孢子发芽、菌体生长繁殖孢子发芽、菌体生长繁殖 （3 3）发酵培养基）发酵培养基 第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定一、

21、培养基及其制备一、培养基及其制备 （三）影响培养基质量的因素（三）影响培养基质量的因素 1.1.原材料质量的影响原材料质量的影响 2.2.水质的影响水质的影响 3.3.灭菌的影响灭菌的影响 4.pH4.pH的影响的影响 5. 5.其他影响因素：黏度其他影响因素：黏度第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定二、灭菌操作技术二、灭菌操作技术 （一）灭菌原理和灭菌操作（一）灭菌原理和灭菌操作 灭菌是指用化学或物理学放入方法杀死或除掉物灭菌是指用化学或物理学放入方法杀死或除掉物料或设备中所有生命的有机体的技术或工艺过程。料或设备中所有生命的有机体的技术或工艺过程。 高温快速灭菌法高温快速灭菌

22、法 （二）无菌检查与杂菌的处理（二）无菌检查与杂菌的处理 1.1.无菌检查：无菌检查：无菌试验、发酵液直接无菌试验、发酵液直接镜检、发酵液生化分析镜检、发酵液生化分析 2.2.染菌的判断染菌的判断第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定二、灭菌操作技术二、灭菌操作技术3.3.染菌的防治技术染菌的防治技术（1 1）污染杂菌的处理）污染杂菌的处理（2 2）污染噬菌体的发现与处理）污染噬菌体的发现与处理 噬菌体是由噬菌体是由D.HerelleD.Herelle和和TwortTwort各自各自独立发现的。噬菌体是感染细菌、真菌独立发现的。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的

23、总、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体为噬菌体。（3 3）防止染菌的措施）防止染菌的措施设备、空气设备、空气第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定三、微生物发酵的三种主要操作方式三、微生物发酵的三种主要操作方式 1. 1.分批发酵分批发酵 2. 2.补料分批发酵补料分批发酵 3. 3.连续发酵连续发酵第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定四、发酵过程中的主要参数及控制四、发酵过程中的主要参数及控制 （一）发酵过程的主要控制参数（一）发酵过程的主要控制参数 1.1.温度温度 2.2.压力压力 3.3

24、.空气流量空气流量 4.4.黏度黏度 5.pH5.pH 6. 6.基质浓度基质浓度 7.7.溶解氧浓度溶解氧浓度 8.8.产物浓度产物浓度 9.9.菌体浓度菌体浓度第三节第三节 发酵工艺条件的确定发酵工艺条件的确定四、发酵过程中的主要参数及控制四、发酵过程中的主要参数及控制 （二）基质对发酵的影响及补料的影响（二）基质对发酵的影响及补料的影响 1.1.碳源的影响和控制碳源的影响和控制 2.2.氮源的影响和控制氮源的影响和控制 3.3.磷酸盐的影响和控制磷酸盐的影响和控制 （三）温度对发酵的影响及其控制（三）温度对发酵的影响及其控制 1.1.影响发酵温度变化的因素影响发酵温度变化的因素 2. 2

25、.温度的控制温度的控制 （四）（四）pHpH对发酵的影响及其控制对发酵的影响及其控制 1.pH1.pH对发酵的影响对发酵的影响 2.2.最适发酵最适发酵pHpH的确定与的确定与pHpH的控制的控制 1、碳源对发酵的影响及控制、碳源对发酵的影响及控制 不同碳源对毛霉产蛋白酶的影响0200400600800100012001400空白0.20%0.50%1%2%麦芽糖浓度酶活（u/g）中性条件下酶活碱性条件下酶活 2、氮源的种类和浓度对发酵的影响及控制、氮源的种类和浓度对发酵的影响及控制 不同氮源对毛霉产蛋白酶的影响不同氮源对毛霉产蛋白酶的影响020040060080010001200空白鱼粉废酵

26、母豆泊粉玉米黄粉蛋白胨酶活（u/g）中性条件下酶活碱性条件下酶活 3、磷酸盐浓度对发酵的影响及控制、磷酸盐浓度对发酵的影响及控制最适温度的控制最适温度的控制1、根据菌种及生长阶段来选择、根据菌种及生长阶段来选择 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。温度范围也不同。 如黑曲霉生长温度为如黑曲霉生长温度为37， 谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为3032 ， 青霉菌生长温度为青霉菌生长温度为30 。 2、根据培养条件选择、根据培养条件选择 温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。 通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。些，溶氧浓度也可髙些。 培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。用快，会使菌过早自溶。 3、根据菌生长情况、根据菌生长情况 菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以营养丰富，通气能满足，那么前期温度