土壤微生物多样性

1、土壤微生物多样性的研究进展摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，是土壤有机质和土壤养分转化和循环的主要动力，它参与土壤有机质的分解、腐殖质的形成等生化过程，在土壤生态系统中起着非常重要的作用。本文从土壤微生物多样性的定义、研究层次、研究方法和其影响因素来阐述目前国内外土壤微生物多样性的研究进展，并对目前存在的问题和今后面临的挑战提出几点看法。关键词：土壤微生物；多样性；PCR-DGGEAdvances of studies on soil microbial diversityAbstract:Soilmicroorganism, one of the important components

2、 of soil, is the main powerof soil organic matter and soil nutrientstransformation and circulation,and participates in the forming of its resolving, humus of participating in soil organic matter, etc. Itplays a very important role in the soil ecosystem. This paper surveyed advances of bio-diversity

3、of soil from the definition of soil microbial diversity, research levels, effect factors and research approaches. Furthermore, some problems andsuggestions were put forward for the further study of soil microbial diversity.Key words:soilmicroorganism; diversity; PCR-DGGE土壤中含有各种各样的有机和无机营养物，它是微生物生长和繁殖

4、的天然培养基。土壤的条件也是十分复杂的，而且多变。土壤微生物是指土壤中借助光学显微镜才能看到的微小生物，包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物，以及真核生物如真菌、藻类（蓝藻除外）、地衣和原生动物等。微生物积极参与土壤物质转化过程，在土壤形成、肥力演变、植物养分有效化和土壤结构的形成与改良、有毒物质降解及净化等方面起着重要作用。数量庞大、种类繁多的土壤微生物是丰富的生物资源库1。土壤微生物多样性是指生命体在遗传、种类和生态系统层次上的变化。它代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。土壤微生物多样性还可以定义为微生物生命的丰富性，通常以土壤生物区系的变

5、化和生物化学过程间的相互关系来反映。目前在地上部植物和动物的多样性方面开展了大量的研究，但对土壤生物多样性，特别是在土壤微生物多样性方面的研究仍较薄弱。随着现代生物学尤其是多聚酶链反应（PCR）、核酸测序等分子生物学技术的迅速发展，人们对土壤微生物多样性有了更深入的了解。1 土壤微生物分布及其群落分布1.1 土壤中微生物的分布土壤中的微生物种类是及其丰富的，据文献记载，1g干重农田土壤就含有几百万个细菌，数十万个真菌孢子和数万个原生动物和藻类。生境的物理化学特征可以影响在这一区域中生活的微生物生长、代谢活力、生物与生物之间的相互作用和微生物的生存。土壤中的微生物既有土著微生物又有外来微生物，其

6、中土著微生物是指在一个给定的生境中那些能生存、生长和进行活跃代谢的微生物，并且这些微生物能与来自于其他群落的微生物进行有效的竞争。土著微生物从生理方面完全适应了这一生境的物化环境。而外来微生物则是指来自于其他生态系统的微生物，所以这些微生物不能在这一生境长期生活下去。在土壤中，一般情况下真菌的生物量和细菌的生物量几乎是相等的，而原生动物和藻类的生物量与真菌和细菌生物量相比，会少一个数量级。如表1所示。表1农田上表层（15cm）处微生物数目和生物量2Table 1 The number of microorganisms and biomass On farmland surface layer

7、 （15cm）微生物 数量/（个细胞/g）生物量/（g/m2）细菌108160真菌105200放线菌105106160藻类10410532原生动物10438当然，这些数据不一定与其他类型的土壤情况相一致。但是在任何情况下，与农田或森林中的高等植物生物量相比，微生物生物量还是很小的。然而，与土壤中其他生物量相比，微生物生物量还是相当可观的，例如，在草地里微生物生物量可以超过其中的所有原生动物生物量。所以，微生物在土壤生态系统中的作用无疑是很大的。1.2土壤中的微生物群落在土壤中存在的大部分细菌为G+细菌，并且G+细菌的数目要比淡水和海洋生境中的G+细菌数目高。土壤中能利用糖类的土著细菌数目要比水

8、圈中的多。在土壤中常见的细菌属包括：不动杆菌属（Acinetobacter）、农杆菌属（Agrobacterium）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、柄杆菌属（Caulobacter）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、棒杆菌属（Corynebacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、微球菌属（Micrococcus）、分支杆菌属Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（

9、Staphylcoccus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）。但是在不同的土壤中它们的相对比例有很大的不同。放线菌占土壤细菌群体的10%33%，其中，链霉菌属（Streptomyces）和诺卡氏菌属（Nocardia）在土壤放线菌中占的比例最大，其次是微单胞菌属（Micromonas），放线菌属（Actinomyces）和其他放线菌，它们是土壤中的土著微生物，但是它们的数量是很少的。放线菌对干燥条件抗性比较大，并能在沙漠土壤中生存，它们比较适合在碱性或中性条件下生长，并对酸性条件敏感。土壤中主要的光合自养细菌群体是蓝细菌种，包括鱼腥藻属（Anabaena）、眉藻属（Calothrix）、

10、色球藻属（Chroococcus）、筒孢藻属（Cylindrospermum）、鞘丝藻属（Lyngbya）、小枝藻属（Microcoleus）、节球藻属（Nodularia）、念珠藻属（Nostoc）、颤藻属（Oscillatoria）、席藻属（Phormidium）、织线藻属（Plectonema）、裂须藻属（Schizothrix）、伪枝藻属（Scytonema）、单歧藻属（Tolypothrix）。在这些蓝细菌中，某些蓝细菌，如念珠藻在某些土壤环境中既能固氮气，又能通过光合作用合成有机物。合成的含氮物质可以给其他微生物和高等植物提供氮源，有时这些含氮物质甚至可以成为这些微生物生长的限制因

11、子。蓝细菌在没有植物生长的土壤表面上形成表面壳，这对土壤具有稳定作用。固氮菌是土壤中的自生固氮菌，能把大气中的氮气转化成氮化合物。土壤中的某些厌氧梭状芽孢杆菌也能固定氮气。根瘤菌和某些植物通过共生进行固氮。在土壤中还有许多化能异养菌能对无机物进行转化，这对于维持土壤肥力是必要的。在土壤生境中可以发现许多外来微生物，它们是来自于空气、水圈或者由植物或动物带入到土壤中，例如，某些植物致病菌就可以由有病植物组织带入土壤中，如农杆菌属、棒杆菌属、欧文氏菌属（Erwinia）、假单胞菌属和黄单胞菌属。进入土壤生态系统的外来微生物一般很快死亡，但在某些情况下，某些外来微生物在土壤中可以生存很长时间，能形成

12、芽孢和其他抗性状态的微生物可以在土壤中存在很长时间。在土壤中真菌的生物量相当大，在土壤中可以找到大部分的真菌，土壤真菌可以以游离的状态存在或与植物根形成菌根关系。真菌主要存在于土壤上表面10cm处，在30cm以下很难找到真菌。如果土壤含有大量的氧气，那么真菌的量就很大。在土壤中常见的真菌主要是半知菌，如曲霉属（Aspergillus）、地霉属（Geotrichum）、青霉属（Penicillum）和木霉属（Trichoderma），但也可以找到大量的子囊菌和担子菌。土壤中的土著酵母主要是半知菌，如假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）和隐球酵母属（Cryptococc

13、us）。油脂酵母属（Lipomyces）、施万酵母属（Schwanniomyces）、克鲁氏酵母属（Kluyveromyces）、裂芽酵母属（Schizoblastosporion）、汉逊氏酵母属（Hansenula）、假丝酵母属和隐球酵母属只能在土壤中分离到，这说明土壤是它们的天然环境。大量的藻类可以生活在土壤中，大部分藻类是生活在土壤表面或土壤上表层的数毫米处。在土壤表层的土著藻类可以进入土壤的亚皮层，这时这些藻类又成为外来藻类，并且有可能被其他微生物吞噬。大部分原生动物往往只存在于土壤的表层15cm处，因为它们需要相对高浓度的氧气，这些原生动物是土壤细菌和藻类的捕食者。细菌病毒在土壤中是

14、广泛分布的，但数量不是很多。如果有关的细菌数目增加，那么相关的病毒数目也在增加。根瘤菌及其噬菌体与形成根瘤和固氮的关系引起许多研究者的注意。但是，现在发现对噬菌体产生抗性的根瘤菌却不能进行固氮，这是一个奇怪的现象。能引起高等植物产生病变的某些病毒通常也可以存在于土壤中，但有些植物病毒在土壤中仅能生存很短时间。某些能感染植物根的病毒可以被某些线虫和真菌携带并进行传播。2 土壤微生物多样性研究层次长期以来，微生物多样性的研究层次一直是众说纷纭。DeLong3认为生物多样性应从物种多样性、遗传（基因）多样性和生态系统多样性三个层次上综合表述。马克平4等认为生物多样性可分为物种多样性、基因多样性、生态

15、系统多样性和景观多样性四个层次。Solbrig5对微生物群落多样性进行剖析后提出3个组成要素：物种多样性、遗传多样性和功能多样性。而Watve等6则认为，微生物多样性可细致划分为生活环境多样性、生长繁殖速度多样性、营养和代谢类型多样性、生活方式多样性、基因多样性和微生物资源开发利用多样性等。但不论如何划分，如果将土壤微生物的多样性与整个生态系统联系起来，都可以从物种多样性、遗传多样性、结构多样性和功能多样性4个方面全面的概括土壤微生物多样性的基本特征7。2.1土壤微生物的物种多样性土壤微生物的物种多样性是指土壤生态系统中微生物的物种丰富度和均一度，这是微生物多样性的最直接表现形式，也是多样性研

16、究中最基本的内容。根据原位的、不经培养的微生物系统发育学研究发现，自然界中95%99%的微生物种群尚未被分离培养或描述过，从而推算地球上仅细菌就有10万50万种8。研究推算，细菌、真菌及病毒的已知种占估计种的比例分别为5%、10%和4%9。2.2土壤微生物的遗传多样性土壤微生物的遗传多样性是指土壤微生物在基因水平上所携带的各类遗传物质和遗传信息的总和，这是微生物多样性的本质和最终反映。与高等生物相比，微生物的多样性在基因水平上更为突出，不同种群间的遗传物质和基因表达具有很大的差异10。从本质上讲，生物多样性源于遗传的多样性。遗传多样性可用来描述种群遗传变异和研究维持变异的机制，遗传变异可以在形

17、态、细胞和分子水平上体现。微生物遗传多样性在分子水平上体现主要是由于遗传物质的碱基排列顺序的多样性和组成核酸分子的碱基数量的巨大性。2.3土壤微生物的结构多样性土壤微生物的结构多样性是指土壤微生物群落在细胞结构组分上的多样化程度，这是导致微生物代谢方式和生理功能多样化的直接原因。例如，微生物标记物分析法通过提取和分析微生物群落中可以用作不同类群标记性指纹的生化组分或胞外产物来获取微生物群落组成和结构多样性的信息11。2.4土壤微生物的功能多样性土壤微生物的功能多样性是指土壤微生物群落所能执行的功能范围以及这些功能的执行过程，如分解功能、营养传递功能以及促进或抑制植物生长的功能等，这些对土壤生态

18、功能及自然界元素循环具有重要意义。目前一般采用底物诱导下的代谢响应模式测算土壤微生物群落的代谢功能多样性12。3 土壤微生物多样性研究方法虽然土壤微生物研究一直深受各国土壤学家和生态学家的关注，但是，长期以来土壤微生物的深入研究受限于手段落后已是不争的事实13。比如：对于土壤细菌认识，人们通常是通过先分离细菌细胞再在培养基上培养、鉴定菌落的方法，但事实上，土壤中只有少部分细菌可以通过此方法得到，而大部分细菌是极难培养成功的，这使得许多土壤细菌包含的大量遗传信息难以被发现14。土壤真菌和放线菌也是一样，人们对它们的认识主要依赖于其地上的子实体或分生孢子的形态，而现实中的许多真菌和放线菌的菌丝体在

19、土壤中处于休眠或不活动状态，用常规调查方法只能了解到其中的一小部分，很难得到大多数种类的信息15。所以，方法的局限性，造成了人们全面了解和深入研究土壤微生物多样性的主要障碍。随着科学技术的不断发展，分子生物学及其其它新方法逐渐应用在土壤微生物多样性的研究上，使得多样性的研究得到了进展性的突破。土壤微生物多样性的实验研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上包括以下几类：（1）传统的微生物平板纯培养方法；（2）Biolog微平板分析方法；（3）脂肪酸分析方法；（4）分子生物学方法；（5）其他方法，如用于微生物生物量测定的氯仿熏蒸方法（Fumigation-incubation）、底物诱导呼

20、吸法（Substrate-induced respiration）和光合微生物色素法等等；用于测定土壤C矿化速率和微生物呼吸强度等方法；用于测定土壤酶活性分析方法；用于土壤微生物形态鉴定的方法；用于测定微生物能量代谢的分析方法；用于测定微生物对土壤养分利用与转化功能的同位素示踪法；以及以荧光为基础的显微技术，包括荧光标记蛋白、荧光染色和荧光原位杂交等。土壤微生物的实验研究方法如图1所示。土壤微生物多样性实验研究方法土壤微生物遗传多样性土壤微生物结构多样性土壤微生物功能多样性与微生物活性土壤微生物物种多样性分子生物学法如PCR-DGGE、RAPD、RFLP 等Biolog 微平板法、氯仿熏蒸浸提

21、法、土壤酶活性测定方法、土壤呼吸测定方法、荧光技术等微生物脂肪酸分析微生物纯培养方法、电镜方法、染色方法等图1土壤微生物多样性的实验研究方法Fig.1 Methods for laboratory analysis of biodiveristy in soil下面仅对有关土壤微生物多样性几种主要的实验研究方法加以介绍与评述。3.1微生物平板培养方法微生物平板纯培养法是用于估计微生物多样性的传统方法，被认为是监测特殊微生物群变化的非常有效的方法15。根据目标微生物选择相应的培养基，然后通过各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分析鉴定。可用于跟踪特定分类组或功能组的微生物数量，并评价在该

22、平板上的微生物群落的组成。但后者需从琼脂平板上将菌落分离出来，并对分离菌进行鉴定。由所得到的分类组或分类群的分布情况可了解群落的结构。这种方法对于衡量小群体多样性方面不失为一种快速的方法。但由于微生物培养方法存在许多不足，只能反映极少数微生物的信息，所测结果误差较大，埋没了大量极有应用价值的微生物资源。且这种平板培养方法通常只能得到微生物类群的数量信息，若要得到种类信息，则必须进一步地分离、纯化和鉴定。因此，在土壤微生物群落多样性研究中，需要结合现代生物技术来更详细的了解土壤微生物状况。但这种方法在分离具有一定功能的特殊目标物种时是非常有用的，利用这种方法已获得许多很有应用价值的微生物种类，并

23、应用于基因介导及生态修复等方面。3.2 BIOLOG微平板法BIOLOG系统是Garland和Miss1991年建立起来的一套用于研究土壤微生物群落结构和功能多样性的方法。这种方法是根据微生物对单一碳源底物的利用能力的差异，当接种菌悬液时，其中的一些孔中的营养物质被利用，使孔中的氧化反应指示剂四氯唑紫呈现不同程度的紫色，从而构成了该微生物的特定指纹。经过BIOLOG系统配套软件分析，并与标准菌种的数据库比较之后，该菌株的分类地位便被确认出来。这种方法成功的运用在区分作物的土壤微生物区系方面。作物方面的影响可能与植物根系分泌物有关，分泌物质导致了某些底物利用率能力的差异16。但目前的数据库中菌种

24、资料不完善，有些只能得到相似的类群。因此，对于微生物的分类鉴定，仅靠Biolog系统的方法是远远不够的，需结合其他方法如微生物生理生化和表型分析等进行。同时，根据Biolog颜色反应数据组合模式，利用主成分分析和聚类分析方法可以获得土壤微生物群落结构和代谢功能方面的信息。虽然不同微生物对同一C源的利用能力是有差异的，但微生物对不同单一C源的代谢指纹差异不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，也就是说，需要同时考虑土壤微生物在Biolog微平板系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对C底物实际利用能力的改变及其适应性问题如代谢补偿、代谢适应等。同时，Biolog微平板法描述的只是土壤中快

25、速生长型或富营养微生物类群的活性，而不能反映土壤中生长缓慢的微生物信息，包括Biolog方法在内的微生物培养方法测定的土壤微生物种类数量不到16SrRNA方法测定的微生物数量的1%17，因而大大低估了土壤中微生物的实际情况，故许多学者建议在使用Biolog微平板法时，需要结合其他方法，以获得更全面的结果。3.3脂肪酸甲酯（FattyAcid Methyl Ester，FAME）谱图分析目前，FAME谱图分析已成为土壤微生物多样性的较为常用研究方法之一。该方法首先是利用有机溶剂将土壤微生物中的磷脂脂肪酸浸提出来，然后再进行分离纯化，最后利用标记脂肪酸，通过气相色谱（GC）等仪器分析方法，得到土壤

26、微生物磷脂脂肪酸组成图谱，进而得到不同脂肪酸的含量和种类，即所谓的FAME指纹剖面（Fingerprint Profile）（图2）。根据FAME的多样性，利用相关的计算机分析软件和相关数据库可同时得到土壤微生物的群落结构组成多样性、比例以及微生物生物量等方面的信息。FAME分析方法不需要对土壤微生物进行培养，可以直接提取原位土壤微生物群落的脂肪酸。但FAME分析结果的准确性与微生物体内的磷脂脂肪酸是否提取完全、稳定以及实验过程是否造成污染等有很大关系。在该方法中，细菌和真菌可根据其磷脂脂肪酸的组成来鉴别，但不同属甚至不同科的微生物FAME有可能重叠，而且该方法只能鉴定到微生物属，不能鉴定到种

27、，同时，该方法强烈地依赖于标记脂肪酸，标记脂肪酸变化可导致错误的群落变化估计。另外，该方法一个明显的缺陷是实验条件要求高，耗时长，成本高，因而在实际研究工作中常受到一定的限制18。GC分析磷脂脂肪酸磷脂甲脂化脂肪酸提取脂肪酸纯化其他类脂化合物FAME指纹剖面土壤样品图2土壤微生物FAME谱图分析的一般程序Fig.2The general procedures of FAME fingerprint analysis of soil microbes3.4 分子生物学方法最近2030年间，以核酸分析技术为主的分子生物学技术（如PCR、RFLP、RAPD、PCR-DGGE/TGGE、AFLP、SS

28、R等）的广泛应用，为从分子水平揭示生物多样性提供了新的方法论，开拓了分子生物学与生态学的交叉领域，分子生物学技术也逐渐被应用到土壤微生物多样性的研究中来。DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）即变性梯度凝胶电泳，是根据PCR扩增产物中长度系统但不同G+C含量的rDNA片段混合物在电泳胶中的移动位置不一样，进而形成不同rDNA指纹剖面，故可直接反映土壤微生物rDNA的多态性。 RFLP（restriction fragmentlength polymorphism）即限制性片段长度多态性技术是利用PCR扩增产物用限制性内切酶进行切割并电泳，以酶

29、切后DNA片段长度变化来表现出来，通过DNA转印及分子杂交方法检测。由于RFLP技术具有快速、方便等优点，因此RFLP技术非常适用于复杂的微生物系统中种类结构的研究。RAPD（random amplified polymorphic DNA）即随机扩增多态性DNA技术是以单一的短长度序列随机的寡核苷酸为引物，由于不同样本基因组序列的不同，以致与引物互补退火结合的DNA片段可能增加或减少，导致了扩增产物数目的变化。重复性不好是该技术存在的主要问题，而DNA模板的质量与数量、MgCl2和引物浓度的变化都有可能导致得到不同的图谱。另外，从条带图谱中无法得到任何微生物系统发育信息。ARDRA（Ampl

30、itied rDNA Restriction Analysis）技术是依据原核生物DNA序列的保守性，将扩增的rDNA片段进行酶切，然后通过酶切图谱来分析菌间多样性。ARDRA技术使研究微生物更直接有效。不受培养条件的限制，为实现对自然环境中微生物及多样性的检测和认识，真实地了解微生物的特性提供了可能性。非常适用于复杂的微生物系统中种类结构的研究和不同自然状况下共生态菌的分类学研究。AFLP（amplified fragment length polymorphism）即扩增片段长度多态性技术是通过有选择的扩增经酶切的部分基因组DNA片段而达到发现各样本基因组间差异的目的。AFLP技术的优点是

31、效率高、稳定性好。但同时也存在着一些缺点，如：AFLP技术费用昂贵；AFLP分析需要同位素或非同位素标记引物，必须具有放射性同位素操作过程中特殊的防护措施以及配套的仪器设备；AFLP对DNA纯度和内切酶的质量要求较高，基因组DNA酶切不完全极有可能影响实验。PCR （polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，是一种体外扩增核酸序列从而得到多个核酸拷贝的技术，可用于土壤微生物DNA扩增，并对扩增产物进行定量或定性分析。 一般的分子生物学技术在土壤微生物多样性的研究上的流程如图3所示。下面就目前应用在土壤微生物多样性研究上的PCR-DGGE进行全面的介绍。（1）原理PC

32、R-DGGE技术是基于核酸序列的不同，将片段大小相同的DNA序列分开的一种技术方法。在进行变性梯度凝胶电泳时，序列不同的DNA片段因为碱基组成和排列的差异，在聚丙烯酰胺凝胶中解链时需要不同的变性剂浓度，并会发生空间构型的变化，最终导致电泳迁移率的差异。将通过PCR扩增之后得到的等长双链DNA分子，在含梯度变性剂(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，电泳迁移率的差异会使不同序列的DNA片段停留在凝胶的不同位置，从而形成相互分开的条带图谱。从理论上讲，只要选择的电泳条件足够精细，就可以分开仅有1个碱基差异的DNA片段19。克隆切割并纯化rDNA片段测序土壤样品DNA提取纯化DGGEPCR

33、RFLP、RAPD、AFLP等检测微生物遗传多样性信息图3分子生物技术在土壤微生物多样性研究中的应用图解Fig.3 A schematic of application of molecular biological techniques in the study of soil（2）操作步骤PCR-DGGE的主要操作步骤如下：样品总DNA的提取与纯化；对样品片段的PCR扩增；DGGE电泳。首先对样品进行预处理，目前普遍使用的是间接法，即通过梯度离心、离心洗涤等步骤去除样品中的杂质，然后再收集和裂解细胞。这一步骤避免了直接对样品处理时，样品中杂质对DNA的污染，但容易造成微生物种类和数量的丢失

34、。近年来，除传统的酶法、化学法和机械法裂解之外，不少新的细胞裂解方法被逐渐应用，如微珠振荡法、超声波法和微波法等。不同DNA提取方法会导致微生物的不同裂解度，所释放的核酸数量不尽相同，使得能够作为PCR模板的DNA数量在不同方法中并不一致，从而对最终的DGGE图谱产生影响。在DNA的提取过程中，一般使用乙醇、异丙醇和聚乙二醇等一些对DNA具有一定优先选择性的有机溶剂，来沉淀样品中的DNA分子。不同DNA提取方法导致抑制剂的残留水平不同，从而在不同程度上影响PCR的特异性扩增；其产生的DNA小片段数量也不同，会影响PCR扩增的敏感性，同时也增加了嵌套作用的可能性，也可能对DGGE的结果产生影响。

35、再者PCR扩增是PCR-DGGE技术中至关重要的步骤。PCR扩增引物的选择在分析微生物群落时，通常选择16SrDNA中的保守序列进行PCR扩增反应。这是由于任何一种原核生物都具有16SrDNA，其序列长短适中且非常保守。应用最广泛的16SrDNA通用引物是341f/534r(V3区)、341f/926r(V3-V5区)和968f/1401r(V6-V8区)，其中以使用V3区引物后的PCR-DGGE条带数最多、分离效果最好。为避免因为单一引物扩增偏嗜性造成的偏差，可以选用多对引物同时对混合DNA进行PCR扩增。选用不同引物对目的基因进行扩增，然后比较DGGE图谱的差异，可以降低共迁移的发生频率。

36、为使扩增产物在DGGE中的解链程度更完全，在PCR扩增目的片段时，人为地在其起来较为繁琐。最后进行DGGE，通常根据PCR扩增出的基因片段大小，来确定聚丙烯酰胺凝胶的浓度。变性剂的梯度范围一般根据垂直DGGE试验结果确定，垂直试验曲线斜率较大的部分代表解链区域的Tm(解链温度)，此时低温解链区的不同分子分离状态最佳。通常选择水平胶的变性剂梯度范围相差30%，对于不同的样品还需要进行调整。对于大多数DNA片段，比较适宜的温度是5065。电泳时间取决于样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等因素。DGGE胶版上的DNA谱带在染色后才能观察。常用的染色剂有溴化乙锭(EB)、SYBR Gr

37、een 、SYBR Gold和银。EB和SYBR染料只对双链DNA着色，单链DNA几乎不显色。其中EB染色最为常用，但聚丙烯酰胺对EB有熄灭作用，致使灵敏度低，导致低估环境样品中微生物的种类。SYBR染料价格昂贵，但其灵敏度高，能更好地消除染色背景；银染法对单、双链DNA均能着色，但不能用于后续的分子操作。目前在应用PCR-DGGE时常在某一引物的5端掺入一段约40个碱基的GC序列，称为“GC夹”或“GC帽”，使目的序列的解链行为发生在最高解链温度区域，从而完全解链。试验证明，使用“GC夹”之后，PCR产物在DGGE胶版上的分离效率大大提高。目前，“GC夹”技术已经被广泛地应用于PCR-DGG

38、E技术中。（3）优缺点该技术的优点是分辨率高；加样量小；重复性好；节约时间；操作简便、快速，可以同时检测多个样品。缺点是检测的DNA片段最适长度为200900bp，超出此范围的片段难以检测；PCR扩增所需G+C 碱基对含量至少达40；如果电泳的条件不适宜，不能保证可以将有一定序列差异的DNA片段完全分开，会出现序列不同的DNA迁移在同一位置的现象。4 土壤微生物多样性影响因素影响土壤微生物群落的结构组成和多样性，尤其是其功能多样性的因素有很多种，可大体分成自然因素和人为因素两大类。自然因素包括植被、土壤类型、温度、水分以及pH值等；人为因素包括农药、施肥以及土壤耕作方式等人类对土壤的管理方式。

39、下面就植被、土壤类型、温度和水分、土壤管理方式几种有代表性的土壤微生物多样性影响因素分别加以阐述。4.1 自然因素（1）植被植被通过影响土壤有机碳和氮的水平、土壤含水量、温度、通气性及pH值等来影响土壤微生物多样性。植被是土壤微生物赖以生存的有机营养物和能量的重要来源，影响着土壤微生物定居的物理环境，如植物凋落物的类型和总量、水分从土壤表面的损失率等。植被的存在有利于增加土壤微生物多样性和微生物生物量；反之，植被的破坏可能改变微生物组成并降低微生物多样性20。从微生物群落多样性的全球格局来看，植物群落类型初步决定了微生物群落的组成，土壤微生物群落多样性与覆盖于土壤上的植物群落多样性呈正相关；从

40、微生物群落多样性的区域格局来看，土壤微生物群落多样性与覆盖于土壤上的植物群落的生产力和多样性呈正相关21。（2）土壤类型近年来大量实验都证明了土壤类型是土壤微生物群落结构和密度的主要影响因素。Yang22等研究了土壤有机碳与土壤微生物功能多样性的关系，结果表明，两者之间存在明显的相关性，维持土壤有机碳含量对保持微生物多样性很重要。Sessitsch23等用T-RFLP技术研究了长期不同施肥条件下的土壤颗粒中微生物多样性，结果表明土壤颗粒越细小，有机质含量越高，土壤颗粒中的微生物群落结构越复杂，多样性越高。Staddon24等对加拿大西部不同气候带的土壤微生物多样性和结构进行了研究，结果表明土壤

41、微生物功能多样性与土壤pH值呈正相关，但随纬度增加而降低。ODonnell25等研究也发现，土壤pH值是影响土壤微生物多样性的重要因子。（3）温度和水分温度和水分对土壤微生物多样性的影响存在交互性，具有协同效应，因此可以用季节或气候的概念来说明不同温度和水分对微生物多样性和活性的影响。我们生活的地球上有多种多样气候类型，由此形成的复杂自然条件影响土壤微生物的生态分布。特别是在高寒极地、高山冻原、热带雨林等各类土壤中，土壤微生物扮演了主要生物因子。而在高温、高盐、高碱、高压和低温、低pH的极端环境中，土壤微生物更是发挥了不可替代的作用。如酸热芽孢杆菌（Bacillus acidocaldariu

42、s）的大多数菌株在6575还能生长，在40下停止生长；温暖、干燥气候条件下土壤曲霉属占多数，寒冷地方毛霉和青霉属为主，多湿地方木霉属最多26。在各种气候带中，热带占有突出的地位。只占世界陆地总面积7%的热带森林，却拥有世界50%以上的物种。此外生长于土壤中的某类嗜热菌，在高达112环境中能产生甲烷，嗜碱菌必须在pH高于8的环境中才能生存，专门在盐性环境中存活的嗜盐菌，嗜低温的食用菌菌种等等，目前此类大多数微生物利用价值未知，但其理论价值是肯定的。4.2人为因素人为的影响土壤微生物的多样性主要体现在对土地的利用及管理方式上，具体主要体现在：土地利用方式，农药的使用和施肥及土地的耕作方式等，这些人

43、为的影响因素通过改变土壤的理化性质而影响土壤微生物多样性。（1）农药的使用农药等杀虫剂作为一种外施入土壤生态系统的物质，它和土壤中其它物质一样能被土壤中的微生物或其分泌的酶降解，从而刺激或抑制了土壤中微生物的活性，引起土壤微生物群落结构的改变27。农药对土壤微生物的影响不同，可能对土壤微生物产生不同程度的抑制作用，也可能使土壤微生物多样性和生物量减少，还可能使土壤微生物群落结构和功能发生改变。（2）施肥土壤的微生物量与土壤C、N等养分循环密切相关，其变化可直接或间接反映土壤肥力的变化。施肥对土壤微生物多样性及活性的影响非常复杂，施用肥料除直接影响土壤化学成分变化、引起土壤微生物活性和群落结构变

44、化外，肥料还能改变土壤的物理性状，影响地面植物的生长，间接的影响土壤微生物群落结构。另外，肥料的种类、施用方式、土壤类型和利用方式等因素也对微生物多样性产生影响。合理的施肥也可增加蓄水保墒能力、抑制土壤蒸发、提高水分的利用率、增加作物产量。（3）土地耕作方式土地耕作方式包括传统耕作、免耕、连作、轮作等。不同的耕作方式会对土壤微生物多样性造成不同的影响。有较多报道认为，免耕土壤中的微生物多样性和生物量均高于传统耕作后的土壤，其原因是传统耕作会导致土壤团聚体的分裂和表层土壤中有机质的消耗，而已发现的大团聚体中的微生物生物量比微团聚体中的高，减少耕作能增大团聚体，使微生物多样性和生物量增。连作后土壤

45、微生物区系发生变化，各类微生物数量上升，以真菌、硝化细菌、反硝化细菌数量明显增加28。轮作不仅影响土壤微生物，使有益微生物增加，有害微生物减少，而且使土壤微生物活性增强。轮作会使有寄主专化性的病原物得不到适宜生长和繁殖的寄主，从而减少病原物的数量；轮作还可以调节地力，提供肥力，改善土壤的理化性能。5 展望土壤微生物多样性研究所涉及的内容较为广泛，有着不同的层次和水平。虽然目前的研究还不足以让我们认识土壤微生物的全部，但土壤微生物作为巨大的基因资源库，其丰富的基因内涵已经表现出巨大潜力。对它的认识、研究和开发，无疑将给人类带来巨大的经济效益和社会效益。随着基因组时代的盛兴和后基因组时代（功能基因

46、组）的到来，土壤微生物以其独特的优势将更加受到研究者的青睐。其多样性的研究将为阐明生态和生物进化原理提供新的模式，同时也将为许多新兴学科、交叉学科的发展开辟广阔的前景。各种新技术的不断完善与发展，特别是分子生物技术的发展使我们逐渐打开了土壤这个黑匣子。在研究方法上，从理论上说，使用分离鉴定土壤中目标微生物DNA这一方法可以完全实现对土壤微生物种类的鉴别。但由于利用分子生物技术进行土壤微生物多样性的分析在国内刚刚起步，许多问题还有待进一步解决，加上土壤生态本身的复杂性和独特性，DNA提取的困难性、完全性及其它过程的干扰，常导致所得数据的可靠性下降，因此需要对研究土壤微生态的生物学方法不断完善与改

47、进。而目前对单一方法的研究已经基本成熟，今后有必要加强对各种研究方法的灵活应用，根据各种方法的优缺点将其有机结合，取长补短，消除单一方法的误差，提供更加全面准确的微生物多样性变化信息。并且应用各种新技术手段来不断发现新的微生物类群，丰富土壤微生物的物种。参考文献1郝文英中国农业百科全书·土壤卷M北京：农业出版社，1996，385-4002池振明现代微生物生态学M北京：科学出版社，2004，30-333DeLong EF.1996. Diversity of naturally occurring prokaryotesA. In :Colwell RR. ed. Microbial

48、Diversity in Time and SpaceC. New York:Plenum,125133.4马克平,钱迎倩.1994.生物多样性研究的原理与方法M.北京:中国科学技术出版社.5Solbrig OT.1991. From genes to ecosystems :a research agendafor biodiversity A. Report of a IUBS2SCOPEUNESCOworkshop. The International Union of Biological SciencesC.Paris France :51 Boulevar dole Montmor

49、enny.6Watve MG, Gangal RM. 1996. Problems in measuring bacterialdiversity and a possible solutionJ. A ppl. Environ.Microbiol.2000,62(11)：42994301.7林先贵，胡君利土壤微生物多样性的科学内涵及其生态服务功能J土壤学报，2008，45(5)：892-8938Amann R L, LudwigW, Schleifer K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individualmi

50、crobial cellswithout cultivationJ. Microbiological Reviews,1995,59: 143169.9Hawksworth DL. The fungal dimension of biodiversity :magnitude ,significance ,and conservation J. Mycol. Res.1995,19(4)：641655.10李顺鹏环境生物学M北京：中国农业出版社，2002，788611焦晓丹，吴凤芝土壤微生物多样性研究方法的进展J土壤通报2004，35(6)：78979212郑华，欧阳志云，方治国等 Biolog在土壤微生物群落功能多样性研究中的应用J土壤学报，2004，41(3)：45646113Dunbar J ,Ticknor L O ,Kuske C Rl1. Assessment of microbial diversity in