神奇的荧光纳米材料量子点在生物体系中的应用

1、神奇的荧光纳米材料量子点在生物体系中的应用关键字：染料，荧光团，FRET (荧光共振能量转移)，纳米颗粒，荧光量子点荧光共振能量转移(FRET)是运用荧光蛋白、传统有机染料和其它染料作为荧光探针来研究蛋白构象、蛋白相互作用的一种实用技术，它能检测到小于纳米级的距离变化。以往的荧光蛋白、有机染料和镧系金属染料分子由于其窄的吸收光谱、带长尾的宽发射光谱和非常低的光淬灭域限，且在吸收峰和发射峰之间不存在大的斯托克斯偏移1, 2，因此，还不是FRET体系最佳的供体和受体。只有选择合适、理想的供体、受体分子才能保证高的能量转移效率和精确的测量数据。半导体量子点(QDs)由于其可调谐的狭窄的激发波长和远离

2、激发峰的发射以及抗漂白性的优良的光学性质，并可以同时连接多个染料分子，使其比有机荧光分子更好地适用于荧光共振能量转移的研究体系。量子点既可以作为FRET供体，也可以作为它的受体3。但最近有文献报道量子点作为FRET受体几乎看不到能量的转移，他们认为主要是因为量子点长的激活寿命和受体染料分子短暂的激发时间。在近几年，基于量子点的FRET研究得到了广泛的证实和应用4-6，在这里我们将为大家简单地介绍量子点的特性、化学合成以及基于量子点的FRET在研究核酸检测，免疫分析，生物分子相互作用，分子构象的变化，生物传感器和癌症研究等方面的应用。1. 量子点的发现太空恒星之间并不是一无所有，1980年宇航员

3、注意到从颗粒状的尘云或者星云上反射到我们银河系的恒星光谱都充满宽宽的红色带。很长一段时间里，这种来自星云和银河系其他地方的尘埃发射的荧光对人们一直保持着神秘色彩，很长一段时间世界上任何一个天文实验室的研究人员无法揭示这种具有奇异光学性质的颗粒组成。可是后来，来自欧洲和美国的两个研究小组，出乎意料地分别提出了下面这个很相近的观点这种发射红色光谱的尘埃可能就是量子点。什么才是量子点？这个术语首先被上个世纪80年代在美国Bell实验室一起工作的物理学家Daniel Chemla和David Miller所提出。这个术语指的是直径非常小近似球形的半导体晶粒（宇宙尘埃就是硅颗粒的一个例子）。量子点常常被

4、看作是纳米晶粒（他们至少有其他10个化名，比如人造原子，量子晶体和纳米点等等），也被当作是胶体颗粒。图1.1 量子点的限域效应量子点有一个非常奇特的最基本特征：它的光学行为依赖于它的尺寸（图1.1A）。比如，在紫外灯照射下，2.3nm的CdSe量子点发射青绿色光，而5.5nm的相同材料组成的量子点却发射桔红色的光。1967年，纽约Eastman Kodak公司的Chester Berry第一次报道了这种奇异的现象，当时他是在观察银卤化物沉淀时发现的，可是当时一直没人注意到这点，就连Berry本人也没在意他的发现。直到十年之后，也就是在20世纪80年代早期，许多研究小组再次观察到了这种效应，首先

5、是在氯化铜镶嵌玻璃中发现的。后来在硫化镉的胶体颗粒制备中（硫化镉胶体在一段时间内一直用来制造有色玻璃）也发现了这种效应，供职于Bell实验室的LouisBrus也是观察到硫化镉颗粒具有的这种效应的科学家之一（当时仅仅是为了表征该颗粒而作了一次光化学实验而已）。可是这次，所有的科学家已经意识到了该特异效应的价值所在。科学家之所以如此重视该现象，量子点出色的发射特性在未来发光材料中可能具有很大的用途。在此之前，首先需要解决的问题是如何合成特定尺寸和特定发光特性（图1.1B）的量子点。一旦量子点的合成路线确定下来，科学家们就可以思考如何将之投入到现实应用中去。 2. 量子点的结构和尺寸量子点的结构一

6、般包括两个部分：核（core）和壳（shell）。核一般使用CdSe，CdTe 或者InAs 等作为材料，其尺寸的大小决定了其光学性质；第二层壳不仅可以保护核，还可以为进一步的修饰提供条件。核一般选用半导体材料，而材料的选择能初步控制发射波长的范围，如图2.1所示，CdSe 一般提供可见光谱，而CdTe 提供红色和接近红外范围的波谱，而InAs9则提供近红外的波谱。通过调节量子点的尺寸可以获得想要的波长，例如3nm的CdSe提供520nm的荧光发射，而5.5nm的CdSe则发射630nm的荧光， 图2.1 单个量子点探针放大示意图中间尺寸产生中间颜色的波谱。发射峰的宽度由量子点的尺寸分布决定，

7、用最新的合成方法可以合成单分散性很好的样品，其最大半峰宽（FWHM）在20-35nm 范围内。量子点的核还被另一层由无机材料组成的壳所包被，这些材料可以保护核免受外界环境的影响，并放大修饰核的光学性质。一种单分散的壳能放大量子产率以及增加数十倍的光稳定性。壳的另一个作用就是增加化学稳定性。然而，也有许多没有包被壳的量子点可以直接借助水溶性修饰层与生物分子偶联而发挥其生物学作用。量子点之所以能用于生物标记，其尺寸也是一个有利因素。图2.2显示了量子点与其他生物试剂或标本的比较。如图，量子点的尺寸随颜色由蓝变红而逐渐增大，比绿色荧光蛋白（GFP）稍微大点而远远小于藻红蛋白（PE）、金颗粒，细菌或动

8、物细胞等。图2.2 量子点的尺寸范围3. 量子点的性质与合成3. 1 量子点的物理及化学特性量子点是一种直径在1-100nm，能够接受光的激发而产生荧光的半导体纳米晶粒。这种纳米颗粒基本上是由周期表中的-或者-V族的原子所形成。当半导体纳米晶粒的尺寸与其激子的玻尔半径(约5-10nm)相接近时，由于存在量子尺寸效应，半导体纳米粒子能带的带隙随粒子半径的减少而增加，导致其吸收光谱和荧光光谱的蓝移。与传统的有机染色分子相比，量子点有如下优点：(1) 量子点的荧光发射波长可以通过改变量子点粒径的大小和其化学组成来“调谐”(图3.1.1,图3.1.2)。半导体纳米晶粒可以采用两元素成分合成或三元素成分

9、合成的方法，其荧光发射光谱覆盖了从近紫外光(400nm)到近红外光(2000nm) 7-9的光谱范围。因此，可以制备在这一光谱范围内的荧光光谱各异的量子点。图3.1.1 由不同核材料合成的具有代表性的量子点发射峰对应的谱峰位置图3.1.2 溶于三氯甲烷中不同尺寸的量子点受同一蓝色激光照射的荧光光谱示意图(2) 传统有机染料的荧光谱峰宽且不对称，并且吸收光谱谱带窄，若要观察到多种染料的荧光，必须同时用多种不同波长的激光来激发（图3.1.3)。而量子点的荧光光谱狭窄且对称，而其吸收光谱很宽，可以被任何波长小于其荧光波长的光所激发，激发波长几乎涵盖从紫外到远红外区的整个光谱范围(图3.1.4)。因此

10、，可以选择一种使生物体自身荧光尽可能小的激发光图3.1.3 CdSe量子点（绿色）和罗丹明6G（红色）激发谱比较图3.1.4 CdSe量子点（绿色）和罗丹明6G（红色）发射谱比较来同时激发不同大小的量子点，使其发出多种颜色的荧光，以实现对多种目标分子的同时成像和跟踪。(3) 由于量子点的摩尔消光系数(0.5-5×l0 M-1cm)10大约是有机染料(5-10×l0 M-1 cm )的10-50倍，在激发光强度相同的情况下，量子点的吸收速率将比有机染料快l0-50倍，由此增加了荧光发射速率，使量子点的荧光发射强度是有机荧光染料的10-20倍11, 12。此外，量子点的光漂白作

11、用很小，光化学性质十分稳定，不易因化学作用和生物代谢降解，荧光可持续数周或更长时间，能动态观察细胞或蛋白质的动力学过程，不会对组织细胞造成伤害。而且它可以经受反复多次激发，不容易发生荧光淬灭。(4) 较长的激发态寿命使量子点的荧光能够从背景荧光中分离出来13, 14。较大的斯托克斯位移及狭窄对称的荧光谱峰又进一步提高了量子点的探测灵敏度(图3.1.5)。因此，光谱特征各异的量子点在标记生物分子时，可以将其荧光光谱移到生物体自身荧光少的区域，易于识别、分析。图3.1.5 量子点和传统染料斯托克斯位移比较3.2 量子点的化学合成以及它与生物大分子的结合欲实现量子点在生物体系中的实际应用须解决以下问

12、题：(1) 提高荧光量子产率。单独的量子点颗粒容易受到杂质和晶格缺陷的影响，荧光量子产率很低。但是，当以一种半导体材料为核(如CdS，其粒径决定其荧光光谱的波长)，用另一种能隙比较高(相对核来说)的半导体材料(如ZnS)包覆，形成核-壳结构后，可以有效地使表面钝化，可将量子产率提高到约50，甚至更高，因而可以产生很强的荧光发射；另一方面这种核-壳结构降低了半导体纳米晶粒的重组，增强了量子点的稳定性15, 16。文献17利用高温热解法制成了高质量的量子点。这一过程主要包括在高温下使某种合适的金属或有机金属(锌、镉或汞)的先导物与对应的硫族元素的先导物(硫、硒或碲)在对应的有机溶剂(如氧化三正辛基

13、膦，TOPO)中化合，该有机溶剂必须具备在高温下稳定的特性，并可作为使量子点稳定的表面活性剂，以防止纳米晶粒的团聚。此后各种合成高质量量子点的过程在此基础上不断发展完善。(2) 设计合成亲水性的量子点并实现它与生物大分子的连接。适用于活细胞体系的量子点，必须具备水溶性的特点，而上述方法制备的量子点不能溶于水，也不能与生物分子结合。为使量子点溶于水并能与生物分子连接，必须将量子点表面层的TOPO分子进行替换或包裹另一层带有电荷或具有亲水性的聚合物。如采用相转移方法将两性分子的聚合体(含有一个疏水片段或侧链及一个亲水片段或基团)作为去污剂，增加量子点水溶性18，同时提供可与生物分子结合的功能基团(

14、羧基酸、胺等)，并且该方法增加了量子点的稳定性和发光效率，使其在生物环境中具有长期的稳定性。量子点的生物结合通常可以通过两种途径来实现。一种方法是连有特定化学基团的生物分子与半导体纳米晶粒表面的官能团发生反应实现连接。巯基(-SH)是最多用于绑定到半导体材料(CdSe，CdS，CdTe，ZnS)表面的基团，量子点通过巯基(-SH)与生物分子结合19。这种方法的结果是亲水性外壳上的部分配体被生物分子所替换。另一种方法是使生物分子非共价地结合到量子点外层的亲水性外壳上。最简单的方法是生物分子通过非特异性方式吸附到亲水性外壳上20，也可以通过静电作用使生物分子吸附到量子点亲水性壳上。大多数胶体量子点

15、带负电，因此，带正电的生物分子可以结合到量子点的表面。此外，生物分子还可以通过共价交联的方式结合到量子点上21，这种方法要求量子点表面的亲水性外壳上带有某些反应基团(-COOH，-NH2，或-SH)。为了特异性地标记生物结构，量子点需要与特定的生物分子(如抗体)结合，以便特异性地与相应的受体偶联(图3.2.1)。绑在量子点上的配体(抗体)既可以直接识别特异性的受体分子，也可以通过初级配体(初级抗体)来识别受体分子22。图3.2.1 量子点与生物分子的连接方式：a) EDAC参与的传统化学共价连接方式；b) 通过SMCC参与的巯基与氨基还原偶联将抗体与量子点相连；c) 通过受体蛋白将抗体与量子点

16、相连；d) 含有六组氨酸标签的多肽和蛋白与Ni-NTA修饰的量子点连接，定量定点。4. 荧光量子点在生物标记和生物成像中的应用4.1 标记细胞结构和受体分子吸附了配体(抗体)的量子点可以高特异性地与靶受体结合，进而该受体由于被荧光标记而被观测到。当量子点吸附不同抗体时，可以特异性地标记不同的受体。第一次标记试验是由Alivisatos小组11完成的，该小组用两种粒径的CdSe-CdS量子点分别标记老鼠的成纤维细胞的细胞核和F-肌动蛋白纤维，一种发绿色荧光，另一种发红色荧光，并且将发红光的量子点特异性地标记在F-肌动蛋白丝上，而发绿光的量子点与尿素和乙酸结合，使量子点与细胞核具有高亲和力，这样就

17、可以同时在细胞中观察到红色和绿色的荧光。4.2 活细胞成像与示踪量子点激发态的寿命较长，并且其光稳特性好，能够长时间地追踪细胞的生物过程。Nie小组首先报导了铁传递蛋白-量子点结合物被活HeLa细胞吞噬的过程12。随后出现许多关于量子点被细胞通过非特异性吞噬而摄入细胞的报道。量子点被细胞吞噬的过程是生物研究的一个重要领域，它关系到细胞与外界的联系过程。此外，细胞的摄取机制对许多领域的应用研究很重要，其中包括药物、核酸、基因的传导。Dahan，Jovin小组实现了对单个活细胞内的单个分子运动的实时再现50，这对于有机染料来说是极端困难的。Dubertret等51将ZnS涂层的CdSe量子点用聚合

18、磷脂酞乙醇胺(PEG)和卵磷脂混合物包裹成胶囊，注人Xenopus(非洲蟾蜍)的胚胎细胞内观察胚胎的发育过程（图 4.1），通过几天的观察发现量子点已经被分配到注射细胞的传代细胞内，由此实现了对单个细胞的移动和分化的实时成像，这对于胚胎形成、癌症转移、干细胞疗法等领域的研究非常重要。图 4.1 通过量子点观测Xenopus胚胎的发育过程4.3 生物活体成像作为另一个重要的应用领域，量子点被用作核磁共振(MRI)、X射线扫描、放射性成像等成像技术的对比剂，用于生物活体成像。传统的有机染料注射到生物体内几分钟后其荧光就消失了，与之相比，PEG包裹的量子点在生物体血液循环中的半衰期超过3 h52。其

19、原因可归因于其独特的结构性。一方面PEG包裹的量子点体积足够小，水溶性好，可以减缓调理作用和网状内皮的吞噬作用；另一方面，PEG包裹的量子点体积又足够大，可以避免肾的过滤作用。要想最终实现利用量子点对组织器官的成像，则要求激发和探测波长能够穿透生物组织。可见光最多只能穿透毫米级厚度的组织，而红外光(650-2000nm)由于其波长较长，被生物体散射和吸收少，可穿透厘米级厚度的组织。将某些在红外区发光的量子点标记到组织或细胞内的特异组分上，并用红外光激发就可以通过成像检测的方法来分析研究组织内部的情况。传统的量子点(CdSe-ZnS)发出的荧光波长通常在可见光区域。为了提高量子点荧光在生物组织内

20、的穿透性，Kim等53制备出一种新的核-壳结构的量子点(发射峰位在850nm，量子产率约13)，并成功地用于组织穿透（深度为1cm）的鼠冠状动脉血管及猪的前哨淋巴结的成像。5. 量子点结合FRET技术应用于生物体系5.1 量子点在FRET中应用的可行性自1993年Bawendi等合成高质量的硒化镉(CdSe)量子点以来，量子点已逐渐被用作发光生物探针。量子点相对于有机染料有很多优点，自2001年起被应用于FRET中。基于量子点的FRET应用一般是量子点作为供体，但也可以作为受体，其原理示意图5.1.1所示23 。生物连接的量子点用一层多聚物和蛋白包被来钝化，以保持稳定性和荧光的高量子产率。但随

21、着稳定性的增强、量子产率的增大，粒子的直径也增大了，而FRET的能量转移发生在偶极-偶极相互作用之中(对距离的变化非常敏感)，距离的增加就减少了FRET的产生。为了减小偶极-偶极中心之间的距离，研究者采用把蛋白直接连接在量子点上，使能量转移发生在量子点和蛋白质色氨酸残基之间24，或者使量子点连接到一个基因控制的髓磷脂基本蛋白图5.1.1 基于量子点的多个供体-受体对FRET的应用原理上，使能量转移发生在外层髓磷脂基本蛋白和量子点之间。当供体-受体距离在几个波长之内时，外层受体分子吸收由量子点发出的非辐射性能量发出一定波长的荧光，而作为供体的量子点能级回落到基态。在FRET中，选择合适的供体-受

22、体对能够保证高效的能量转移率和提供可测量的参数：淬灭的供体光子发射和增强的受体荧光。在研究生物受体-配体之间特定的相互作用，或者是蛋白分子受到目标分子的作用而发生构象改变时，合适的光谱交错对于得到高效的能量转移至关重要。而且，激发线必须与最小的受体吸收光谱相一致，才能减轻由于直接激发受体而产生的影响。量子点具有优越的光学性质，无疑在某些程度上具备了这些优点:首先，激发量子点的激发波长范围很宽，可以从紫外到远红外区，因此可以用同一波长的光激发不同大小的量子点，并且可以通过选择合适的激发波长来避免对受体分子的直接激发。其次，量子点的大小不同，所发射的荧光颜色不同，可以通过改变量子点的大小来调节量子

23、点的发射光谱与受体分子吸收光谱的重叠程度，从而可以调节FRET的效率。再次，量子点的荧光谱峰狭窄而对称，半高峰宽通常为25-45nm。两个相距r的独立分子D-A之间的能量转移可以表示为：E = KD-A/(KD-A+D-1) = R06/(R06+r6) (1)其中KD-A表示独立的两个单分子对之间的能量转移速率；D表示供体分子激发状态的时间寿命；R0表示能量转移为50%时供体、受体之间的距离；r表示量子点和无机染料中心的距离。当多个受体同时靠近量子点供体时，公式(1)可以修改为公式(2)来说明它们之间的相互作用。E = nR06/(nR06+r6) (2)其中，n表示与供体分子相互作用的受体

24、分子的平均个数。从以上两个公式可以看出，供体、受体之间的能量转移与R0和r之间存在六次方的关系。Wang等25通过设计麦芽糖粘附蛋白(MBP)连接到量子点的实验模塑比较了量子点作为FRET能量供体具有比传统染料更好的能量转移效率。通过改变n值和光谱重叠的程度，证明了量子点的优越性。Wargnier等26利用纳米尺度的自组装合成水溶性的CdSe-ZnS量子点，并用合成的量子点作为FRET的供体、受体和纳米金胶体作为受体分子进行了实验，数据与长程能量转移的理论计算值完全一致。5.2 量子点组成的FRET分析体系在生物研究中的应用由于量子点的独特优势，近来对其应用于FRET的研究更为深入，范围不断扩

25、展，目前，以量子点为基础的FRET主要应用于以下几个方面。5.2.1 核酸检测核酸是生命体的遗传物质，是生物物种延续和发展的基础。FRET技术在研究核酸结构，DNA测序和核酸杂交等方面被广泛应用。对于核酸结构的分析，主要是应用方程式（1），由值测定值，给出标记基团的空间距离。该方法可作为NMR的补充，使测定的核酸结构更为精密。该方法在检测核酸构象的变化中也有较高的灵敏度。分子信标(MB)是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移原理而设计的发夹型荧光探针。它包括一个环(loop)和一个干(stem)，其中环是由与靶分子互补的核酸碱基序列组成，干为两列互补的碱基序列，荧光基团和猝灭基团分别标记在其

26、干的两端。通过荧光基团和猝灭基团之间是否发生FRET来区分匹配错误的靶分子。但由于有机染料光漂白速率较快、寿命较短以及其荧光色彩的有限性，限制了MBs在活体检测中的应用27。Ozkan等将荧光量子点作为荧光给体，设计了新型的分子信标探针。荧光量子点的发射峰较尖锐且峰形对称，光褪色的作用也较小，与传统的有机染料对相比，当发夹闭合时，虽然FRET发生效率较低，但与靶分子结合后，由于量子点荧光较强，荧光增强的倍数高，检测灵敏度显著提高。Kim等设计了一种新的分子信标，用巯基乙酸包覆的量子点作为荧光基团，与MBs的5端的-NH2相连，4-(4-二甲基氨基苯基)偶氮苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团，连

27、接到MBs的3端。此分子信标的环由25个碱基构成，干含有4对碱基，图5.2.1所示：当无靶DNA分子存在时，分子信标呈环-干结构，干部的QD与DABCYL之间由于距离较近，可发生FRET，QD的荧光被猝灭；当互补靶DNA分子存在时，由于环DNA分子序列与靶DNA分子序列特异性结合，干打开，QD与DABCYL分开，无FRET发生，QD的荧光强度增加。同时作者用3D分子模型对比了QD/DABCYL与6-fluorescene(6-FAM)/DABCYL之间的FRET效率，发现虽然QD/DABCYL的能量转移效率比6-FAM/DABCYL低，但是QD/DABCYL分子信标对光漂白的稳定性比6-FAM

28、/DABCYL分子信标强。用QDs代替有机荧光团使得同时进行多个DNA或RNA分析成为可能。图5.2.1 量子点修饰的分子信标5.2.2 免疫分析免疫分析法包括传统免疫分析法和标记免疫分析法；标记免疫分析法又可分为均相免疫分析法和非均相免疫分析法28。FRET属于一种比较简便的均相免疫分析法，由于其操作简单，反应速度较快，越来越引起人们的关注。以FRET为基础的均相免疫分析法可分为夹心法和竞争法。夹心法就是能量转移的供体和受体分别标记与同一个抗原相结合的两种抗体，形成D-Ab1:Ag:Ab2-A形式的抗原抗体复合物，使供体和受体之间的距离减小，发生FRET，从而可以判断免疫反应的发生。竞争法就

29、是能量转移的供体和受体分别标记抗原和抗体中的一种。由于抗原、抗体之间的特异性结合，使供体和受体之间发生能量转移，当加入未标记的抗原或抗体时，由于与标记的抗原或抗体发生竞争，产生无FRET现象的抗原抗体复合物，从而可以检测抗原或抗体。Wang等29将两种分别发出绿色荧光(G-NPs)和红色荧光(R-NPs)的CdTe纳米粒子用于免疫分析法。他们用R-NPs标记牛血清白蛋白(BSA)，用G-NPs标记抗BSA的IgG。当形成BSA-IgG抗原抗体复合物时，G-NPs和R-NPs之间就发生了FRET，G-NPs的发光被猝灭，而R-NPs的发光增强。他们还使用了竞争免疫分析法，在(R-NPs-BSA)

30、-(G-NPs-IgG)抗原抗体复合物中加入未标记的BSA，由于BSA逐渐取代标记的BSA，使得G-NPs的发光逐渐增强，而R-NPs的发光逐渐减弱，从而可以检测出BSA的浓度。利用这种基于竞争免疫分析的FRET可以制成蛋白质传感器和杂交光电装置。5.2.3 以FRET为基础的传感器在生物传感器的设计中，信号的调制主要依赖于粘附于生物分子的供体和受体之间的电子传导或能量传导效率。Mattoussi等30提出了麦芽糖粘附蛋白(MBP)的麦芽糖生物传感器的设计方案。通过重组技术，使MBP的C-端带上5-HIS，与QDs进行配位，形成QDs-MBP。他们将-环糊精-QSY9暗猝灭剂偶联到MBP的糖受

31、体位置，可以观察到由于QDs-QSY9图5.2.2 基于560QD-MBP-CD-QSY-9间FRET的麦牙糖传感器之间的FRET，QDs的荧光被猝灭。添加麦芽糖取代环糊精-QsY9后，QDs的荧光恢复(图5.2.2)。此外，他们还将QDs与Cy3标记的MBP配位后，形成QDs-MBP-Cy3，再将-环糊精-Cy3. 5键合到MBP的糖受体位置，由于QDs-Cy3-Cy3.5之间发生了二步FRET，克服了QDs与受体之间距离的限制，QDs和Cy3的荧光被猝灭；当添加麦芽糖取代-环糊精-Cy3.5后，Cy3的荧光恢复（如图5.2.3）。这样就形成了两种麦芽糖传感器，有可能用于麦芽糖的定量检测。他

32、们还将MBP用Cy3标记后，通过非共价自组装，分别结合到3种不同的QDs上，形成QDs-MBP-Cy3偶联物。保持总的MBP与QDs的比例不变，而改变MBP-Cy3与QDs的比例，发现可以通过调节QDs的光发射或者调节固定到QDs中心的MBP-Cy3的数量控制FRET效率。在这样的体系中量子点不仅作为有效的能量供体，还相当于生物传感器纳米组装的“支架”。最近，Mattoussi等提供了QD-蛋白生物连接纳米组装的FRET分析，证明了通过对这种精确控制来得到高效和精确的分析31,32。还利用多个麦芽糖粘附蛋白(MBP)标记光敏性的BIPS来反向调节量子点的发射光谱，调节的效率可以通过改变BIPS

33、的数量来进行控制33。因此，光敏性开关或生物传感器有望通过这样的装置来实现。图5.2.3 基于530QD-MBP-Cy3-CD-Cy3.5间FRET的麦牙糖传感器QDs-MBP偶联物显示了两个优点：(1)可以调节供体与受体之间的光谱重叠程度；(2)提供了一种单个供体可以和几个受体同时作用的模型。说明QDs能够同时与几个受体作用，从而可以增强FRET信号、提高检测的灵敏度，预示着使用单一QDs供体同时检测几个分析物将成为可能。Medintz等利用荧光量子点连接抗体片段发展了溶液相纳米尺度传感器的组装34，将抗-TNT特定抗体片段通过金属吸附作用连接到亲水的量子点上，基于FRET对液相环境的2，4

34、，6-三硝基甲苯(TNT)进行了特定的检测。CdSe-ZnS核-壳型量子点可以被制备成带正电荷或负电荷的水溶性粒子，直径为3-6nm；量子产率(QYs)超过70。Wargnier等以FRET为基础研究了带相反电荷的QDs之间以及带相反电荷的QDs与纳米金之间在水相中的组装。Wargnier等将最大发射波长在563nm的红色量子点(R-QDs)用巯基琥珀酸和巯基磺酸的混合液处理，使其表面带负电荷；将最大发射波长分别在515nm和558nm的绿色量子点(G-QDs)和黄色量子点(Y-QDs)用巯基乙胺处理，使其表面带正电荷；纳米金粒子(NGs)带负电荷，每一个NG的表面大约有l8个羧基。由于带相反

35、的电荷，G-QDs和R-QDs、Y-QDs和NGs之间由于库仑引力而相互吸引，发生FRET。带正电荷的供体G-QDs和Y-QDs荧光被猝灭，说明G-QDs和R-QDs之间、Y-QDs和NGs之间发生了组装。保持受体的浓度不变，改变供体的浓度，发现R-QDs表面的平均电荷量是G-QDs的4倍，而Y-QDs和NGs表面所带的电荷量比较接近。在R-QDs和G-QDs中可以形成一个受体几个供体的组装，预示可以发展以FRET为基础的传感器。图5.2.4 (a)MBP-BIPS对QD发光的调制; (b)sulfo-NHS-BIPS的sP(左)和MC(右)形式由于光的波长、强度、曝光程度很容易控制。光驱动装

36、置引起了人们很大的兴趣。Medintz等34使用一个与蛋白质结合的光致色变的FRET受体，可逆地调制量子点的发光，从而制成一个光驱动调制器。1-3-2H-1-(2-羧基乙基)-3, 3-二甲基-6-硝基螺2H 1-苯并吡喃-2,2- (2H)-吲哚啉(BIPS)具有光致色变的性质，在UV光/白光照射下可逆地从无色的螺苯并吡喃(SP)变为有色的花菁(MC)，MC可以作为FRET的受体。将BIPS用硫代-N-羟基-丁二酰亚胺(sulfo-NHS)活化后，标记到MBP上，再将其结合到QD的表面，这样就形成了一个MBP-QD-BIPS融合物，图5.2.4所示。当用UV光照射时，BIPS转化为MC，由于

37、QD-MC之间的FRET，QD的荧光被猝灭；当用白光照射时，MC转化为SP，QD的荧光显著增加。通过改变染料/蛋白质的比率发现，可以通过改变结合到每个蛋白质上的BIPS的数目来调节QD的发光，使得使用这类纳米材料制成光致色变装置或传感器成为可能。5.2.4 生物大分子相互作用生物大分子间的相互作用是生命活动中最基本的过程。对其进行深入的研究在医学及生物学等领域都具有重要的意义，目前在国内外都是较热门的课题。Willard等5以量子点作为能量转移的供体，研究了蛋白质-蛋白质之间的特异性结合。他们将BSA生物素化(bBSA)后，结合到量子点的表面，形成QD-bBSA；用四甲基罗丹明(TMR)标记链

38、霉亲和素(SAv)，形成SAv-TMR。将QD-bBSA和SAv-TMR在PBS缓冲液中进行结合检测，通过改变SAv-TMR的浓度发现，随着SAv-TMR的浓度增加，QD-bBSA所产生荧光强度逐渐减弱，SAv-TMR的荧光强度逐渐增加。这是由于QD-bBSA和SAv-TMR发生了特异性结合，QD-TMR之间产生了FRET，使得QD的荧光被猝灭，TMR的荧光增强(图5.2.5)。为了做进一步证实，他们将未生物素化的BSA与QD相连，并检测了QD-BSA和SAv-TMR混合液的荧光光谱，发现SAv-TMR的荧光并未增强，说明QD-TMR之间的FRET主要是由于生物素-SAv之间的特异性结合所产生

39、的。这预示着将QD作为供体标记一种蛋白质，用有机染料标记另一种蛋白质，通过QD和染料之间的FRET可以观察不同蛋白质之间的特异性结合，并可应用于均相免疫检测、DNA杂交、酶-底物相互作用的设计中。Oh等35基于量子点与金纳米粒子之间的FRET，研究了生物分子相互作用的抑制性分析。利用链霉亲和素连接的量子点作为能量的供体，生物素连接的金纳米粒子作为能量的受体，构成了一个FRET体系。当外源性图5.2.5 FRET粘附分析示意图地加入抗生物素时，由于抗生物素与生物素之间特定的相互作用，减少了链霉亲和素连接量子点的荧光淬灭。抗生物素的检测域限达到10nmol·L-1。随着不同浓度的外源性抗

40、生物素的加入，荧光淬灭的强度也存在着一定的定量关系，说明其设计可以作为生物分子特定性相互作用的高分辨定量分析。考虑到量子点在水溶液中的分散稳定性，Nagasaki等36在水溶液中利用CHO-PEG/PAMA共沉淀方法制备得到CdS量子点，即便是在浓度大的盐溶液中，这种方法制备的量子点也保持了很好的稳定性。他们利用量子点与荧光染料标记的蛋白质之间的FRET研究了一种新的分子识别体系：将粘附量子点的PEG末梢连接生物素作为配体分子，连有蔷薇花红染料分子的链霉亲和素作为受体，通过配体和受体之间的特定的相互作用来识别链霉亲和素。结果证明，荧光共振能量转移确实来自连接在CdS量子点上的生物素与连有蔷薇花

41、红染料分子的链霉亲和素之间特定的相互作用。5.2.5 生物大分子构象的变化生物大分子的结构是分子生物学研究的重点之一。分子特定的功能依赖于它所特有的结构。为了全面深入地了解生物大分子的功能，需要全面地了解生物大分子的结构，这对于研究和分析生物大分子的功能至关重要，一直以来都是广大科研工作者研究的热点。Medintz等32将6种不同的MBP突变体用罗丹明红(RR)标记后，配位到QDs上。通过研究QDs-MBP-RR之间的FRET来确定这6种不同的MBP,RR受体和QDs供体之间的距离以及MBP-RR在QDs表面的位置和取向。这提供了一种可以确定蛋白质在QDs或其它球形纳米粒子上位置的方法，这种方

42、法可能适用于观察蛋白质连接到QDs表面时的折叠过程或构象的变化。图5.2.6 量子点和染料Cy5FRET对的交叉连接动力学探针由于对距离变化的灵敏性，FRET在揭开生物分子内部活动的研究中显示出独特的优势。Hohng等37观察了量子点和有机荧光团之间的单分子FRET，进一步利用单分子之间的FRET，获得了两对双链DNA交叉连接模型的单分子构象变化信息(图5.2.6)。在这里链霉亲和素包裹的量子点不仅作为能量转移的供体，还充当了连接基底的支架作用。虽然量子点和Cy5之间的能量转移效率较低，但从高，低能量转移的两种状态看来，证实了交叉连接构象的改变。5.2.6 癌症治疗的光敏剂在光动力学治疗（PD

43、T）中，光，氧气和光敏剂共同作用以选择性地破坏目标组织。目标性也就在于光敏剂在癌细胞有选择地滞留，浓缩从而达到激光或紫外光在癌变组织的直接照射。在氧气的存在下，癌变组织同时暴露在光和光敏剂中能杀死癌细胞(图5.2.7)。相对传统的治疗，光动力学治疗侵害性更少，目标性更强，没有声波治疗的剂量限制，因而治疗几乎没有伤疤。量子点表面的多样性功能化修饰，使之具有良好的水溶性和生物相容性，有利于PDT能量在机体中的传送。自从Derfus等38证明量子点毒性受UV照射调节以来，量子点有望于杀死癌细胞。图5.2.7 量子点诱发的光动力学治疗的可能机理示意图在PDT中，光敏剂受到光的激活，但并不是光敏剂直接与

44、组织细胞反应来杀死癌变细胞，而是通过临近氧分子从三线态转变为能与细胞产生毒性反应的单线态氧来杀死癌变细胞。Samia等39通过FRET机理证明了CdSe量子点作为PDT光敏剂的可能性，为PDT光敏剂的发展开辟了新的思路。同时，量子点具有可调节的光学性质，有助于浅层和深层次的癌症治疗。Bakalova等40还研究了在更少毒性量子点存在下单线态氧的产生，并评价了不同表面包裹技术对单线态氧量子产率的影响。Lou等41研究了量子点生物连接癌细胞作为PDT传统光敏剂具有的潜在优势。水溶性的CdSe量子点连接于与白血病有特别作用的抗-CD抗体上，量子点标记的细胞与正常的淋巴细胞混合同时受到有经典光敏剂存在

45、的紫外光的照射。结果表明，量子点抗-CD连接的白血病细胞对紫外光刺激敏感，同时增强了经典光敏剂的效果。量子点生物连接体作为PDT光敏剂或只是增强光敏药物的效果都具有很好的应用前景，但量子点易聚集，释放重金属离子和光学稳定性也是待解决的问题。因此，人们应更清楚地认识到量子点独特的光学性质和实际应用之间存在的差距，更好地了解量子点在机体中吸收，代谢和毒性等机理。5.2.7 其他Patolsky等3利用FRET研究了在QDs表面进行的调节聚合反应和DNA复制动力学过程。Patolsky等将蔷薇红染料插入到新合成的调聚物或DNA复制物中，通过观察QDs-蔷薇红染料之间FRET信号随时间的变化，来研究调

46、节聚合反应和DNA复制的动力学。这个体系除了可以应用于探测酶作用于DNA的过程，也有望应用于癌细胞的快速、灵敏的检测。扫描近场光学显微术(SNOM) 42, 43由于其分辨率突破了Abbe衍射极限，自1980年代中期由Phol在技术上实现以来，在10多年的时间内获得了迅速的发展，为生物亚显微形态学及超微结构的生物学研究提供了一种有力的工具，在很多领域有很广阔的应用前景。Sekatskii等提出将FRET原理应用于SNOM中以提高其分辨率，但其中存在着几个问题：如探针在扫描样品时，其距离上不能超过Förster半径，这就要求探针的机械性能比较稳定；以及含有供体的探针光漂白速率比较快等。

47、Müller等采用了一个新的供体-受体对可以很好地解决以上问题。他们将CdTe纳米粒子连接到聚苯乙烯微球的表面，再将微球连接到SNOM的探针上；用Alexafluor标记样品分子，形成一个FRET-SNOM体系，并报道了第一例用这个探针进行FRET-SNOM成像。结果表明，这种体系很有希望用于FRET-SNOM或者研究纳米晶与单分子之间的受控相互作用。在FRET中，量子点不但可以作为供体，还可以作为受体。BSA是目前研究得最多的蛋白质之一，可以作为研究蛋白质-量子点偶联的一个比较简便的模型。Mamedova等44用戊二醛(G)作偶联剂，研究了BSA与CdTe纳米粒子之间的生物偶联。C

48、dTe纳米粒子表面用L-半胱氨酸修饰，G的一个醛基形成Schiff碱与量子点表面的L-半胱氨酸的氨基结合，另一个醛基与BSA中的赖氨酸以相同的键结合，这样就形成了BSA-G-CdTe偶联物。为了证实BSA-G-CdTe的形成，进一步研究发现：(1)BSA与CdTe主要形成1:1的偶联物，其中含有少量的2:1的偶联物；(2)偶联后，蛋白质的三级结构大部分保持完整。用290nm的紫外光激发BSA-G-CdTe偶联物时，发现BSA中色氨酸在340nm处所发射的荧光完全被猝灭，而CdTe的荧光强度增加了一倍，说明发生了类似于经典Förster能量转移的过程，量子点通过共振能量转移从蛋白质的色

49、氨酸基团中吸收能量。水溶性量子点由于表面覆有聚合物或蛋白质，造成粒子尺寸的增加，可能使FRET减弱或消失。而疏水性量子点的量子产率比水溶性量子点高，稳定性好，并且许多生物过程发生在脂膜内，所以近来有科学家直接将疏水性量子点用于FRET研究。Kloepfer等45将疏水性CdSe量子点埋入脂膜中，研究了量子点作为供体分别与水溶性的染料Cy3.5和脂溶性的染料DiD之间的FRET，以及量子点作为受体与脂溶性的染料3-4-(2-(6-(二丁胺基)-2-萘)-反式-乙烯基)吡啶)丙磺酸酯(di-4-ANEPPS)之间的FRET。第一次在模拟膜体系中探索了疏水性量子点的能量转移过程。荧光量子点在其他FR

50、ET体系中的应用包括：通过DNA的互补作用将光淬灭剂金与荧光量子点相连46，并用这些荧光量子点来研究抗生物素和生物素之间的相互作用47。将荧光量子点与DNA引物相连作为供体与荧光核苷受体联用来分析DNA复制和调聚作用的动力学问题3。荧光量子点也被作为FRET体系供体在分子灯中应用49。定位于脂质囊中的荧光量子点作为供体与脂溶性或水溶性染料的相互作用也得到了研究50。6 小结与展望与有机荧光分子相比较而言，量子点作为荧光能量共振转移的供体或受体，具有许多特别的光学性质。首先，激发量子点的激发波长范围很宽，因此不同大小的量子点可以由同一个波长的光激发。另外，量子点具有较大的斯托克斯位移和狭窄对称的

51、荧光谱峰，这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点，而发射光谱不交叠(Overlap)，或只有很少交叠。由于大小不同、材料不同的量子点受到光激发后发出一系列不同光谱的光，且发射的荧光强度足以使光学设备检测到单个的量子点，当标记有不同量子点的两个生物分子互相靠近，在这一区域的光谱就会发生变化，甚至发生能量转移，就可以及时地观察到整个过程的动态变化。尽管基于量子点的FRET得到了广泛的应用，也取得了很大的成就，但还有许多有待改善的地方。如QDs的核比较大，在使用发射波长较长的QDs(例如，最大发射波长大于600nm)作为FRET的供体，或者使用比较大的蛋白质(如抗体)时，供-受体之间的距离有可能超过

52、10nm，使FRET的信号减弱或者无FRET发生。所以发展以QDs为基础的FRET，可以从以下几个方面展开探索和研究。(1)优化能量传递的供体和受体，以增加能量转移的效率：根据所要识别的物质的性质选择合适的供体和受体，并且供体的发射光谱和受体的吸收光谱要能够有效的重叠，在供体的有效激发波长下能够避免对受体的直接激发；此外供体和受体在供体的量子率、受体的消光系数、生物兼容性和抗干扰能力等方面均有要求。(2)为了在发生FRET时有足够的信号改变，在使用QDs生物偶联物时，可以根据受体配体的选择性来选择合适的中间体生物分子。(3)由于QDs的表面性质会影响它们在细胞环境下的稳定性，因此在应用于细胞分

53、析领域时，对此须做进一步的改进。(4)将疏水性QDs直接用于FRET。与新技术、新材料的结合，使FRET对生物检测的发展起到了更大的推动作用，在均相免疫检测、生物大分子相互作用和构象变化的研究方面，以及发展以FRET为基础的传感器、生物芯片以及纳米分析器件等方面将会有很好的前景，并将在环境检测、生物防御等一系列领域有广泛的应用。参考文献1. a) Lakowicz, J. RPrinciples of Fluorescence Spectroscopy(2nd ed). New York: Kluwer academic, 1999. b) Stryer, L.; Haugland, R. P

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