尿素的细菌;纤维素微生物的分离选编

1、会计学1尿素的细菌尿素的细菌;纤维素微生物的分离选编纤维素微生物的分离选编第第1 1节节 微生物的实验培养微生物的实验培养生生物物分分类类动物界：动物界：植物界：植物界：真菌界：真菌界：原生生物：原生生物：原核生物：原核生物：病毒病毒大型真菌、霉菌大型真菌、霉菌酵母菌酵母菌细细菌、放菌、放线线菌、菌、支支原体、原体、蓝蓝藻、藻、衣衣原体原体变形虫、草履虫变形虫、草履虫DNADNA型病毒、型病毒、RNARNA型病毒型病毒真核生物真核生物原核生物原核生物非细胞生物非细胞生物细胞细胞生物生物1 1）概念：）概念：按照微生物对营养物质的不同需按照微生物对营养物质的不同需要，要，配制出供其生长繁殖的配制

2、出供其生长繁殖的营养基质营养基质。1 1、培养基：、培养基：2 2）营养成分：）营养成分：概念概念分类分类作用作用为微生物为微生物的生长和的生长和繁殖提供繁殖提供所需碳元所需碳元素的营养素的营养物质物质无机碳源：二氧化碳无机碳源：二氧化碳、碳酸氢钠；碳酸氢钠；有机碳源：葡萄糖有机碳源：葡萄糖、脂肪酸、石油等脂肪酸、石油等葡萄糖是最主要的碳葡萄糖是最主要的碳源源合成微生物合成微生物的细胞物质的细胞物质和代谢产物，和代谢产物，有些碳源是有些碳源是异养微生物异养微生物主要能源主要能源碳源碳源：概念概念分类分类作用作用为微生物为微生物的生长和的生长和繁殖提供繁殖提供所需氮元所需氮元素的营养素的营养物质

3、物质无机氮源：无机氮源：N2、NH3铵盐、硝酸盐；铵盐、硝酸盐；有机氮源：尿素、有机氮源：尿素、牛牛肉膏、蛋白胨等肉膏、蛋白胨等铵盐、硝酸盐是最主铵盐、硝酸盐是最主要的氮源。要的氮源。合成蛋白质、合成蛋白质、核酸和含氮核酸和含氮代谢产物代谢产物氮源：氮源： 温度、温度、PHPH、渗透压、渗透压、O2O2及特殊营养及特殊营养物质等。物质等。碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源碳源碳源CO2、 NH3 、NH3氧化释放的化学能氧化释放的化学能思考：思考：自然界中微生物是混杂的生活在自然界中微生物是混杂的生活在一起的，如何分离出某种微生物（如纯一起的，如何分离出某种微生物（如纯化大肠

4、杆菌）？化大肠杆菌）？2 2、实验操作、实验操作大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养 1）制备培养基：）制备培养基：计计算算称称量量溶溶化化调调PHPH值值灭灭菌菌倒倒平平板板原则：原则：目的明确、营养协调、目的明确、营养协调、PH值适宜值适宜1、获取纯化培养物的关键是、获取纯化培养物的关键是防止外来杂菌防止外来杂菌 的入侵。的入侵。2、无菌措施：、无菌措施：1) 1)对实验操作空间、操作者衣着和手进对实验操作空间、操作者衣着和手进行清洁和行清洁和消毒消毒；对将培养用的器皿、；对将培养用的器皿、接种工具和培养基进行接种工具和培养基进行灭菌灭菌2) 2)实验操作时已灭菌材料等应避免与周实验操作时

5、已灭菌材料等应避免与周围物品接触；实验操作应在酒精灯火围物品接触；实验操作应在酒精灯火焰附近进行；接种工具等应在酒精等焰附近进行；接种工具等应在酒精等火焰上灼烧后使用火焰上灼烧后使用概念概念对象对象常用方法常用方法消消毒毒灭灭菌菌用用温和温和物理和化物理和化学方法杀死物体学方法杀死物体表面或内部表面或内部部分部分有害微生物（不有害微生物（不包括芽孢和孢子）包括芽孢和孢子）用用强烈强烈物理和化物理和化学方法杀死物体学方法杀死物体表面或内部表面或内部全部全部有害微生物（包有害微生物（包括芽孢和孢子）括芽孢和孢子）空间、操作空间、操作者衣物、手者衣物、手等等器皿、培养器皿、培养基、接种工基、接种工具

6、等具等煮沸、酒精、煮沸、酒精、氯气、紫外氯气、紫外线等线等灼烧灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌法法消毒：消毒：常用消毒方法：常用消毒方法： 煮沸消毒法煮沸消毒法:100:100煮沸煮沸5-6min5-6min； 巴氏消毒法巴氏消毒法:70-75 :70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min； 化学药剂消毒法化学药剂消毒法: :用用75%75%酒精等进行皮肤消酒精等进行皮肤消毒毒; ;氯气消毒水源；氯气消毒水源； 紫外线消毒等紫外线消毒等灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌：干热灭菌：160-160-170 170 下加热下加热

7、1-1-2h2h。高压蒸高压蒸汽汽灭菌：灭菌：100kPa100kPa、121 121 下维持下维持15-30min.15-30min.2)灭菌方法：灭菌方法： 倒平板：倒平板：待培养基冷却到待培养基冷却到5050O OC C左右时倒平板。左右时倒平板。平板倒置原因：防止培养基冷却产生水滴滴落培平板倒置原因：防止培养基冷却产生水滴滴落培养基上，造成污染。养基上，造成污染。2）纯化大肠杆菌：）纯化大肠杆菌：微生物接种方法微生物接种方法平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法平板划线法平板划线法：通过接种环在琼脂通过接种环在琼脂固体固体培养基表面连续划线培养基表面连续划线的操作，的操作，将

8、聚集的将聚集的菌种逐步稀释分散菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在到培养基的表面，在数次划线后培养，可以数次划线后培养，可以分离到由一个细分离到由一个细胞胞繁殖而来的细胞群体，即得到繁殖而来的细胞群体，即得到单一菌单一菌落落。平板划线法平板划线法稀释涂布平板法：稀释涂布平板法： 将菌液进行将菌液进行一系列的一系列的梯度稀释梯度稀释，然后，然后将不同稀释梯度菌液将不同稀释梯度菌液分别涂布在固体培分别涂布在固体培养基养基的表面，进行培养。在的表面，进行培养。在稀释度足够稀释度足够高的菌液高的菌液里，聚集在一起的微生物将被里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞分散成单个细胞，进而，进而形成单个菌落形

9、成单个菌落。步骤步骤1：梯度稀释操作：梯度稀释操作123456 (1) (1)将分别盛有将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。水的试管灭菌并编号。 (2) (2)用移液管吸取用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中，培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。 (3) (3)从从10101 1倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三支试稀释液，注入第三支试管中，重复步骤管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。，直至到第六支试管。步骤步骤2：涂布到培养基上：涂布到培养基上10-110-410-510-6

10、平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法相同点：分散出相同点：分散出单细菌形成单菌落单细菌形成单菌落来分离菌种来分离菌种不同点：分别通过不同点：分别通过划线划线和和稀释稀释分散出单细菌，分散出单细菌，稀释稀释涂布平板法涂布平板法除分离菌种外除分离菌种外还可以对微生物计数还可以对微生物计数专题专题1 1 微生物专题微生物专题微生物微生物概念及概念及分类分类微生物微生物培养培养微生物微生物分离和分离和计数计数微生物微生物应用应用思考思考1：如何：如何寻找某种微生物？寻找某种微生物？思考思考2：如何：如何分离某种微生物？分离某种微生物？取土样取土样制土壤悬液制土壤悬液样品稀释样品稀释涂布涂布

11、于固体培养于固体培养基基挑菌落保存挑菌落保存选择培养选择培养筛选并增大菌种浓度筛选并增大菌种浓度稀释菌种稀释菌种当两个或多个细胞连着一起时，平板上观当两个或多个细胞连着一起时，平板上观察到的菌落只有一个。察到的菌落只有一个。第第2节节 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数土壤中分解尿素的细菌的分离和计数如何从土壤中分离能够分解尿素的细菌如何从土壤中分离能够分解尿素的细菌（目的菌）并对其进行计数？试通过小（目的菌）并对其进行计数？试通过小组讨论写出实验设计的基本思路。组讨论写出实验设计的基本思路。讨论：讨论：思考：如何寻找目的菌？思考：如何寻找目的菌？思考：如何寻找和分离某种微生物？思考：如何寻找和

12、分离某种微生物？ 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。前都要灭菌。制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。实例实例1：教材：教材22页页纤维素丰富纤维素丰富纤维素纤维素稀释涂布平板稀释涂布平板透明圈透明圈2 2、分解纤维素微生物的分离：、分解纤维素微生物的分离：实验操作实验操作土壤取样土壤取样梯度稀释梯度稀释将样品涂布到鉴别将样品涂布到鉴别纤维

13、素分解菌的培纤维素分解菌的培养基上（含刚果红养基上（含刚果红）挑选产生透挑选产生透明圈的菌落明圈的菌落选择培养选择培养( (液体培养基液体培养基) )平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法接种接种平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法稀释涂布平板法选择培养基选择培养基筛选、分离的细胞筛选、分离的细胞加入青霉素加入青霉素酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌等真菌等真菌加入高浓度食盐加入高浓度食盐金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌无氮培养基无氮培养基固氮菌固氮菌无碳培养基无碳培养基自养型自养型细菌细菌依标记基因，加入某种等抗依标记基因，加入某种等抗生素生素导入了导入了重组重组DNA

14、DNA的受体细的受体细胞胞加入次黄嘌呤、氨基嘌呤等加入次黄嘌呤、氨基嘌呤等杂交瘤细胞杂交瘤细胞培养基成分培养基成分含量含量NH4ClNH4Cl4.6g4.6gK2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO

15、42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4Cl4.6g4.6g蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g培养基成分培养基成分含量含量K2HPO4K2HPO42.0g2.0gMgSO4MgSO41.6g1.6g琼脂琼脂15g15g蒸馏水蒸馏水1000ml1000ml乳糖乳糖5.0gNH4ClNH4C

16、l4.6g4.6g微生物的分离：科赫的平板划线法微生物的分离：科赫的平板划线法自然界中的微生物都是混杂生活在一起的，给研究和自然界中的微生物都是混杂生活在一起的，给研究和应用带来了很大困难。应用带来了很大困难。1919世纪后期，德国细菌学家世纪后期，德国细菌学家科赫发明了科赫发明了固体培养基固体培养基，尤其是用琼脂做凝固剂的固，尤其是用琼脂做凝固剂的固体培养基，成功解决这一问题，科赫体培养基，成功解决这一问题，科赫将微生物样品稀将微生物样品稀释后，用针尖沾取少量稀释菌液在固体培养基上连续释后，用针尖沾取少量稀释菌液在固体培养基上连续划线划线，由于微生物在固体培养基上由于微生物在固体培养基上生长

17、部位固定生长部位固定，不，不久就会在培养基表面长出久就会在培养基表面长出多种菌落多种菌落，科赫推断相同的，科赫推断相同的菌落来自同一个种，于是挑选某一种菌落的微生物，菌落来自同一个种，于是挑选某一种菌落的微生物，经过几次相同的培养过程后，就得到了纯种。应用固经过几次相同的培养过程后，就得到了纯种。应用固体培养基，科赫分离出了炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、体培养基，科赫分离出了炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌、结核杆菌等。结核杆菌等。19051905年科赫因结核杆菌的研究成果而年科赫因结核杆菌的研究成果而获诺贝尔生理学奖。获诺贝尔生理学奖。单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就单个或少数细菌在固体培养基上大

18、量繁殖时，就会形成一个肉眼可见、具有一定形态结构子细胞会形成一个肉眼可见、具有一定形态结构子细胞群体，叫做群体，叫做菌落菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落是鉴定菌种的重要依据。1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基物质物质牛肉膏牛肉膏蛋白胨蛋白胨NaClNaCl琼脂琼脂水水重量重量5g5g10g10g5g5g20g20g定溶至定溶至100mL100mL 称量称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖称取时动作要迅速，称

19、后及时盖上瓶盖。计算计算溶化：溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL100mL。灭菌：灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（包上牛皮纸），连同培养皿（3 35 5套，用几层报纸包好

20、）套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。一起放到高压锅内灭菌。2 2、制备培养基的操作排序、制备培养基的操作排序 溶化（使各种原料、琼脂等加热溶化）溶化（使各种原料、琼脂等加热溶化） 灭菌灭菌 调调PHPH值值 计算（各成分用量）计算（各成分用量） 称量称量 倒平板倒平板( (培养基冷却至培养基冷却至50,50,倒入培养皿倒入培养皿) ) 正确的操作顺序：正确的操作顺序：_ 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？的细菌的数量，

21、选用的稀释范围相同吗？接种环接种环接种针接种针否；可以无碳源，也可无氮源否；可以无碳源，也可无氮源否；碳源和氮源也可能是无机物否；碳源和氮源也可能是无机物否；光能或化学能否；光能或化学能病毒无细胞结构，只能寄生在活细胞中生存。病毒无细胞结构，只能寄生在活细胞中生存。所以，要利用所以，要利用活细胞活细胞培养病毒。培养病毒。3 3、代谢特点：异常旺盛、代谢特点：异常旺盛微生微生物所物所需的需的营养营养要素要素碳源碳源氮源氮源水水无机盐无机盐无机碳源：无机碳源：CO2等等自养型自养型有机碳源：有机碳源：葡萄糖等葡萄糖等异养型异养型N2：固氮菌（根瘤菌等）：固氮菌（根瘤菌等）NH3：硝化细菌：硝化细菌

22、其他：铵盐、硝酸盐、尿素、其他：铵盐、硝酸盐、尿素、蛋白胨蛋白胨特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、特殊营养物质（维生素、氨基酸和碱基等）、PHPH、温度、氧气等、温度、氧气等练习：练习：（1010全国）全国）某细菌固体培养基的组某细菌固体培养基的组成成分是成成分是KHKH2 2POPO4 4、NaNa2 2HPOHPO4 4、MgSOMgSO4 4、葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固葡萄糖、尿素、琼脂和蒸馏水，其中凝固剂是剂是，碳源是，碳源是，氮源是。已知只有能合成脲酶氮源是。已知只有能合成脲酶的细菌才能在该培养基上生长，故该培养的细菌才能在该培养基上生长，故该培养基属于培养基。按照化

23、学成分分基属于培养基。按照化学成分分类，该培养基属于培养基。从同化类，该培养基属于培养基。从同化作用类型上看，用该培养基培养的细菌属作用类型上看，用该培养基培养的细菌属于于。葡萄糖葡萄糖尿素尿素琼脂琼脂选择选择合成合成异养型异养型高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌消毒消毒需要需要2 2、实验操作、实验操作大肠杆菌的纯化培养大肠杆菌的纯化培养 1）制备培养基：）制备培养基：计计算算称称量量溶溶化化调调PHPH值值灭灭菌菌倒倒平平板板人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨