基础分子生物学学习教案VIP

1、会计学1基础基础(jch)分子生物学分子生物学第一页，共116页。mRNA只能识别tRNA而不是氨基酸？DNAx106bp, Cot1/2=9, 有一生物，其Cot1/2=3x10-1，求其细胞(xbo)中的DNA总量。 三、问答题1 .说说DNA组装成染色体的主要过程。2 .写出肽链合成起始、延伸和终止三个阶段的主要步骤和主要因子。第1页/共115页第二页，共116页。第五讲第五讲 分子生物学研究法分子生物学研究法 一、一、 重组重组 DNADNA 技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件 1.1. 4040 年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载年代确定了遗传信息的携带者，即基因的

2、分子载体是体是 DNADNA 而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；题； 2.502.50 年代提示了年代提示了 DNADNA 分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制保留复制机制, ,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3.503.50 年代末至年代末至 6060 年代，相继提出了“中心法则”和操年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说纵子学说, ,成功地破译了遗传密码， 充分认识了遗传信息成功地破译了遗传密码， 充分认识了遗传信息的流动的流动和表达。和表达。 第2页/共115页第三页，共116

3、页。重组重组 DNA 技术历史上的主要事件技术历史上的主要事件 年份年份 事事 件件 1869 F Miescher 首次从莱茵河鲑鱼精子中首次从莱茵河鲑鱼精子中分离分离 DNA。 1944 O.T. Avery 证实证实 DNA 是遗传物质。是遗传物质。 1952 A.D. Hershey 和和 M.Chase再次证实噬再次证实噬菌体的遗传物质是菌体的遗传物质是 DNA。 1953 J.D.Watson 和和 F.H.C.Crick提出提出 DNA分子结构的双螺旋模型。分子结构的双螺旋模型。 M.Wilkins 用用 X-射线衍射法证实了这射线衍射法证实了这一结构。一结构。 第3页/共115

4、页第四页，共116页。1957 A.Kornberg 从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA 聚合酶聚合酶 I。 1958 M. Meselson 和和 F. W. Stahl 证实了证实了DNA 的半保留复制模型。的半保留复制模型。 1959- 1960 S. Ochoa 发现发现 RNA 聚合酶和信使聚合酶和信使RNA， 并证明， 并证明 mRNA 决定了蛋白质分决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg 破译了第一个遗传密码；破译了第一个遗传密码； F. Jacob和和 J. Monod提出了调节基因提出了调节基因表达的操纵子模型。表达的操纵子模

5、型。 1964 C. Yanofsky 和和 S. Brenner 等人证明，等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列核苷酸序列存在着共线性关系。存在着共线性关系。 第4页/共115页第五页，共116页。1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA的的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”通常由“质粒”DNA 所决定。所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S. Ochoa、H.G. Khorana、F.H.C.Crick 等人破译了全部等人破译了全部遗传密码。遗传密码

6、。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox 和和 T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。分离了第一种限制性核酸内切酶。 H.M.Temin和和D.Baltimore从从RNA肿瘤肿瘤病毒中发现反转录酶。病毒中发现反转录酶。 第5页/共115页第六页，共116页。 1972 - 1973 H.Boyer，P.Berg 等人发展了等人发展了 DNA 重组重组技术，于技术，于 72 年获得第一个重组年获得第一个重组 DNA 分分子，子，73 年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。 1975 - 1977 F.Sanger 与与 A.Maxam、W.Gilbert

7、 等人等人发明了发明了 DNA 序列测定技术。序列测定技术。1977 年完年完成了全长成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组基因组测定。测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。可以专利化。 第6页/共115页第七页，共116页。 1981 R. D. Palmiter 和和 R. L. Brinster 获得获得转基因小鼠；转基因小鼠； A. C. Spradling 和和 G. M. Rubin

8、 得到转基因果蝇。得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物美、英批准使用第一例基因工程药物胰岛素；胰岛素；Sanger 等人完成了入噬等人完成了入噬菌体菌体 48,502bp 全序列测定。全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组 DNA 的专的专利。利。 第7页/共115页第八页，共116页。1986GMO首次在环境中释放。首次在环境中释放。 1988J. D. Watson出任出任“人类基人类基因组计划因组计划”首席科学家。首席科学家。 1989DuPont公司获得转肿瘤基因公司获得转肿瘤

9、基因小鼠小鼠“Oncomouse”。 1992欧共体欧共体35个实验室联合完成个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定酵母第三染色体全序列测定(315kb)。第8页/共115页第九页，共116页。 1994 第一批基因工程西红柿在美第一批基因工程西红柿在美国上市。国上市。 1996 完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。得克隆羊。 第9页/共115页第十页，共116页。基因工程中常见的名词：基因工程中常见的名词： 遗传工程遗传工程genetic engineering， 基因操作基因操

10、作gone manipulation， 重组重组 DNA 技术技术 recombinant DNA technology， 基因克隆基因克隆gone cloning， 分子克隆分子克隆molecular cloning。 第10页/共115页第十一页，共116页。基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤 从生物有机体基因组中，分离出从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的带有目的基因的 DNA 片段。片段。 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源 DNA 片片段连接到能够自我复制的并具有段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重选择记号的载体分子上，形成重组组 DNA

11、 分子。分子。 将重组将重组 DNA 分子转移到适当的分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。之一起增殖。 第11页/共115页第十二页，共116页。4 4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组得了重组DNADNA分子的受体细胞，并筛选出分子的受体细胞，并筛选出已经得到已经得到(d do)(d do)扩增的目的基因。扩增的目的基因。5 5、将目的基因克隆到表达载体上，导入、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。功能表达

12、，产生出人类所需要的物质。第12页/共115页第十三页，共116页。第13页/共115页第十四页，共116页。无规则ab c aba超大分子，不能超大分子，不能有效有效(yuxio)地地被一般电泳所分被一般电泳所分离。离。a、b表示表示(biosh)每次电每次电泳的不同方向，泳的不同方向，c为为DNA分子的分子的最终移动方向。最终移动方向。应用脉冲电场应用脉冲电场技术，可分离技术，可分离高达高达107bp的的DNA分子。分子。第14页/共115页第十五页，共116页。二、二、 基因操作的主要技术原理基因操作的主要技术原理 1 1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 (Agarose (Agarose

13、 & Polyacrylamide& Polyacrylamide) ) 将某种分子放到特定的电场将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。电极移动。 某物质在电场作用下的迁移某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等） 。粘度系数等） 。 第15页/共115页第十六页，共116页。 在生理条件下，

14、核酸分子中的磷酸在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，基团是离子化的，所以，DNADNA 和和 RNARNA 实实际上呈多聚阴离子状态（际上呈多聚阴离子状态（PolyanionsPolyanions） 。） 。 将将 DNADNA、RNARNA 放到电场中，它就会由放到电场中，它就会由负极正极移动。负极正极移动。 AgaroseAgarose 的分离范围在的分离范围在 50bp50bp数十数十 kbkb (4.0%) (0.3%) (4.0%) (0.3%) Polyacrylamide(PAGE)Polyacrylamide(PAGE)，1 11000bp1000bp (20%

15、) (4%) (20%) (4%) 第16页/共115页第十七页，共116页。第17页/共115页第十八页，共116页。 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（锭（EB）ethidium bromide 染染色， 此时， 核酸分子在紫外光下发出色， 此时， 核酸分子在紫外光下发出荧光， 肉眼能看到约荧光， 肉眼能看到约 50ng DNA 所形所形成的条带。成的条带。 第18页/共115页第十九页，共116页。D DN NA A的的 脉脉 冲冲 电电 泳泳 技技 术术 ( (P PF FG GE E P Pu ul ls se e- -f fi ie el ld d g g

16、e el l e el le ec ct tr ro op ph ho or re es si is s) ). . 第19页/共115页第二十页，共116页。2 核酸的分子杂交技术核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳凝胶电泳 分离的分离的DNA或或RNA分子，分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”动地“吸印” 转移到滤膜上的。常用转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、 硝酸纤维素滤膜，的滤膜有尼龙滤膜、 硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素

17、滤纸（叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。等。 第20页/共115页第二十一页，共116页。核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法 、 斑 点 和 狭 线 印 迹 法法 、 斑 点 和 狭 线 印 迹 法 (dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法、 菌落和

18、噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的性标记或其它标记的 DNA 或或 RNA 探针进探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交迹杂交。 第21页/共115页第二十二页，共116页。第22页/共115页第二十三页，共116页。第23页/共115页第二十四页，共116页。第24页/共115页第二十五页，共116页。3 细菌的转化细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌菌株由于捕获了来自另

19、一种细菌菌株的株的 DNA，而导致性状特征发生遗，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化传改变的生命过程。这种提供转化DNA 的菌株叫做供体菌株，而接受的菌株叫做供体菌株，而接受转化转化 DNA 的寄主菌株则称做受体的寄主菌株则称做受体菌株。菌株。 第25页/共115页第二十六页，共116页。 大大肠肠杆杆菌菌是是最最广广泛泛使使用用的的实实验验菌菌株株。在在加加入入转转化化 DNA 之之前前，必必须须预预先先用用 Cacl2 处处理理大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，使使之之呈呈感感受受态态 （Competent Cells） 。 Mg2+对对维维持持外外源源 DNA 的的稳稳定定性性起

20、起重重要要作作用用，质质粒粒 DNA 中中的的抗抗生生素素是是筛筛选选标标记记。 对对绝绝大大多多数数 hsdR-，hsdM-突突变变体体菌菌株株 （k12） ， 每每 ug DNA 可可得得 107-108个个转转化化子子。 第26页/共115页第二十七页，共116页。4 DNA 序列分析序列分析 a. Sanger 的双脱氧链终止法的双脱氧链终止法 Cambridge的的F. Sanger在在1977年发明用双脱年发明用双脱氧链终止法测定单链氧链终止法测定单链 DNA 的序列，其基本原的序列，其基本原理如下：理如下： DNA 聚合酶能够用单链聚合酶能够用单链 DNA 作为模板， 合作为模板

21、， 合成准确的成准确的 DNA 互补链；互补链； 该酶能够用该酶能够用 2，3双脱氧核苷三磷酸作双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，末端，从而终止其延伸反应。从而终止其延伸反应。 第27页/共115页第二十八页，共116页。 在在 DNA 测测序序反反应应中中，加加入入模模板板 DNA，引引物物（特特异异性性引引物物，如如 T7，T3，M13 等等） ，DNA 聚聚合合酶酶，dA，dT，dG，dC 和和一一种种 ddNTP。 常常用用 Klenow 大大片片段段，无无 53外外切切酶酶活活性性。 第28页/共115页第二十九页，共116页

22、。第29页/共115页第三十页，共116页。b b MaxamMaxam- -GilbertGilbert 化学修饰法化学修饰法( (哈哈佛大学佛大学) ) 该方法的基本原理是用化学试剂该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的处理具有末端放射性标记的 DNADNA 片片段，造成碱基的特异性切割并产生一段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的组具有不同长度的 DNADNA 链降解产物，链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测可直接读出待测 DNADNA 片段的核苷酸序片段的核苷酸序列。列。 第30页/共115页第三十一页，共1

23、16页。 该反应的关键在于使该反应的关键在于使 DNA的的 4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有 1-2 种发生特异种发生特异性的化学切割反应：性的化学切割反应： 碱基的特异性修饰；碱基的特异性修饰； 被修饰的碱基从核糖环上转被修饰的碱基从核糖环上转移；移； 失去碱基的糖环部位发生失去碱基的糖环部位发生 DNA链断裂。链断裂。 第31页/共115页第三十二页，共116页。 专门用来对核苷酸作化学修饰，专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸 二 甲 酯酸 二 甲 酯 (dimethylsulphate) 和 肼和 肼(hydrazine)。 硫酸

24、二甲酯是碱性化学试剂，硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使能使 DNA 链中鸟嘌呤的链中鸟嘌呤的 N7 和腺嘌和腺嘌呤的呤的 N6 位发生甲基化，在中性位发生甲基化，在中性 PH环境中就能使糖苷键发生水解，并环境中就能使糖苷键发生水解，并引起引起 DNA 链的断裂。链的断裂。 第32页/共115页第三十三页，共116页。 在碱性条件下，肼能特在碱性条件下，肼能特异性切割异性切割 C 和和 T。如果加。如果加入入 1 mol/L 的的 Nacl，那么，那么，只有只有 C 被特异性切割。被特异性切割。 第33页/共115页第三十四页，共116页。第34页/共115页第三十五页，共116页。第35页/共1

25、15页第三十六页，共116页。第36页/共115页第三十七页，共116页。c c D DN NA A 序序列列分分析析自自动动化化 用用四四甲甲基基若若丹丹明明( (T Te et tr ra am me et th hy yl lr rh ho od da am mi in ne e) ) 作作 为为荧荧光光剂剂标标记记 D DN NA A 引引物物，带带有有这这种种引引物物的的 D DN NA A 片片段段能能在在激激光光诱诱导导下下发发出出荧荧光光。按按照照标标准准的的双双脱脱氧氧终终止止法法或或化化学学终终止止法法进进行行测测序序反反应应，跑跑 D DN NA A 凝凝胶胶后后用用计计

26、算算机机检检测测。 第37页/共115页第三十八页，共116页。第38页/共115页第三十九页，共116页。d d. .D DN NA A杂杂交交测测序序法法( (S SB BH H- -S Se eq qu ue en nc ci in ng g b by y h hy yb br ri id di iz za at ti io on n) ) 如如果果一一段段较较短短的的 D DN NA A 探探针针能能与与较较长长的的 D DN NA A 片片段段杂杂交交，并并形形成成完完全全的的双双链链结结构构，我我们们就就推推测测在在靶靶 D DN NA A 上上存存在在着着相相应应的的互互补补序序

27、列列，这这就就是是 D DN NA A 杂杂交交测测序序法法的的基基本本原原理理。 第39页/共115页第四十页，共116页。 如如果果将将一一种种 12-mer 的的靶靶 DNA 与与完完全全随随机机合合成成的的8-mer 寡寡核核苷苷酸酸控控针针混混合合杂杂交交，在在总总数数为为 48=65536种种 8-mer 的的控控针针群群体体中中，仅仅有有 5 种种探探针针会会与与靶靶 DNA杂杂交交，形形成成完完全全互互补补的的双双链链分分子子。 第40页/共115页第四十一页，共116页。第41页/共115页第四十二页，共116页。第42页/共115页第四十三页，共116页。当靶当靶 DNAD

28、NA 与标记探针形成与标记探针形成 G G- -T T 或或G G- -A A 末端碱基错配的双链体时，检测末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显， 较基错配造成的去稳定效应越明显， 较易与完全的双链体分子相区分。易与完全的双链体分子相区分。 但是，探针短，杂交产物的总体但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信稳定性下降，信/ /噪比下降，影响结噪比下降，影响结果的可靠性。所以，果的可靠性。所以，6 6- -mermer 寡核苷酸寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定矩阵芯片只能用于测定 500bp500bp 的靶的靶D

29、NADNA；7 7- -mer=2000bpmer=2000bp，8 8- -mer=8000bpmer=8000bp。 第43页/共115页第四十四页，共116页。SBH 的应用：的应用： 可有效检测靶可有效检测靶 DNA 中的单碱基突变；中的单碱基突变； 可用于不同可用于不同 DNA 片段之间的序列比较；片段之间的序列比较； 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况；定基因的表达状况； 可用于检验传统测序技术的准确性。可用于检验传统测序技术的准确性。 第44页/共115页第四十五页，共116页。5 基因的定点诱变（基因的定点诱变（site-d

30、irected mutagenesis） 使已克隆基因或使已克隆基因或 DNA片段中的任何片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。和蛋白质工程的重要手段。 a. 盒式诱变盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。种方式。 第45页/共115页第四十六页，共116页。第46页/共115页第四十七页，共116页。第47页/共115页第四十八页，共116页。b 寡寡核核

31、苷苷酸酸引引物物诱诱变变 应应用用化化学学合合成成的的含含有有突突变变碱碱基基的的寡寡核核苷苷酸酸短短片片段段做做引引物物，进进行行 DNA 复复制制，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物成成为为新新合合成成的的 DNA 子子链链的的一一个个部部分分。 第48页/共115页第四十九页，共116页。第49页/共115页第五十页，共116页。CPCRG 与与 PCR 诱诱变变 第50页/共115页第五十一页，共116页。第51页/共115页第五十二页，共116页。第52页/共115页第五十三页，共116页。第53页/共115页第五十四页，共116页。第54页/共115页第五十五页，共116页。6 6 利用

32、利用 DNADNA 与蛋白质的相互与蛋白质的相互作用进行核酸研究作用进行核酸研究. . a.a. 凝 胶 滞 缓 实 验凝 胶 滞 缓 实 验 (Gel (Gel retardation assay)retardation assay)，又称，又称 DNADNA迁移率变化试验迁移率变化试验(DNA mobility (DNA mobility shift assayshift assay-EMSA)EMSA)。 第55页/共115页第五十六页，共116页。第56页/共115页第五十七页，共116页。第57页/共115页第五十八页，共116页。b DNase I 印迹试验（印迹试验（DNase

33、I foot printing） 第58页/共115页第五十九页，共116页。第59页/共115页第六十页，共116页。第60页/共115页第六十一页，共116页。主要步骤：主要步骤： 用用32P标记标记DNA双链末端，并用双链末端，并用RE切去一端；切去一端； 加入细胞特定周期蛋白质提取加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；物，温育； 加入适量加入适量DNaseI或硫酸二甲酯或硫酸二甲酯六氢吡啶，使六氢吡啶，使DNA链发生断裂链发生断裂(dun li)。这一反应中，这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂量非常关键，要保证一条链只发生一次断

34、裂(dun li)！第61页/共115页第六十二页，共116页。沉淀沉淀 DNA（包括与（包括与 DNA 相结合的蛋白相结合的蛋白质） ；质） ； 进行进行 DNA 凝胶分析。凝胶分析。 如果某个蛋白质已经与如果某个蛋白质已经与 DNA 的特定区段相的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段结合，那么，它就会保证该区段 DNA 免受免受消化或降解作用。消化或降解作用。 在电泳凝胶的放射自显影在电泳凝胶的放射自显影图片上， 相应于蛋白质结合的部位不产生放图片上， 相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。射性标记的条带。 第62页/共115页第六十三页，共116页。c c 甲基化干扰试验甲基化

35、干扰试验(Methylation (Methylation interference assay)interference assay)。 用用 DMSDMS 处理靶处理靶 DNADNA，使平均每条，使平均每条链上只有一个链上只有一个 G G 被甲基化。将局部被甲基化。将局部甲基化的甲基化的 DNADNA 与含与含 DNADNA 结合蛋白的结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种试验。分离各种 DNADNA 条带，并用六条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。氢吡啶切割甲基化的残基。 第63页/共115页第六十四页，共116页。如果因某个如果因某个(mu

36、 )G(mu )G残基的残基的甲基化作用而阻止了蛋白质甲基化作用而阻止了蛋白质与与DNADNA的结合，那么，六氢吡的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化啶对这个甲基化G G残基的切割残基的切割作用，就只能在没有蛋白质作用，就只能在没有蛋白质结合的结合的DNADNA中观察到。中观察到。第64页/共115页第六十五页，共116页。第65页/共115页第六十六页，共116页。d 体体内内足足迹迹试试验验 用用适适量量 DMS 处处理理完完整整的的游游离离细细胞胞，使使染染色色质质中中的的 G 残残基基甲甲基基化化，提提取取 DNA 并并加加入入六六氢氢吡吡啶啶切切割割 DNA 链链。与与对对照照的的裸裸

37、露露DNA 经经甲甲基基化化处处理理后后形形成成的的梯梯度度相相对对照照，就就能能发发现现 DNA 链链上上的的蛋蛋白白质质结结合合区区。 第66页/共115页第六十七页，共116页。第67页/共115页第六十八页，共116页。三三、分子克隆技术、分子克隆技术 1 1、高质量、高质量 mRNAmRNA 的制备的制备 应用应用 Promega PolyAT tract mRNA Promega PolyAT tract mRNA Isolation SystemIsolation System 分离分离 Poly(A)RNAPoly(A)RNA。将将 Biotinylated Oligo(dT)

38、Biotinylated Oligo(dT)引物与细引物与细胞总胞总 RNARNA 共温育，加入与微磁球相连共温育，加入与微磁球相连的的 StreptavidinStreptavidin，用磁场吸附与，用磁场吸附与 PMPPMP相连的相连的 SASA- -Biotinylated Oligo(dT)Biotinylated Oligo(dT)mRNAmRNA。 第68页/共115页第六十九页，共116页。第69页/共115页第七十页，共116页。2 反转录成反转录成 cDNA 可同时在反转录系统中加入可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer 及随机引物及随机引物R6，以保证

39、得到全长，以保证得到全长 cDNA； 应选用活性较高的反转录酶应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase） ；） ； 应选用甲基化应选用甲基化 dCTP； 应保证所获得双链应保证所获得双链 cDNA 的方向的方向性。性。 第70页/共115页第七十一页，共116页。第71页/共115页第七十二页，共116页。第72页/共115页第七十三页，共116页。Super Script Choice cDNA 合成系统中所用合成系统中所用的的 poly（dT）引物）引物 5GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTA GAGA序列序列 GTCTCGAGTTTTTTTTTTT

40、TTTTTTT3 XhoI Poly(dT) 与与 EcoR I 酶切位点相连的接合序列酶切位点相连的接合序列 5 AATTCGGCACGAG 3 3 GCCGTGCTC 5 第73页/共115页第七十四页，共116页。 因为绝大多数大肠因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带杆菌细胞都会切除带有有 5-methyl C 的外源的外源DNA，所以，应选用，所以，应选用mcrA- mcrB-菌株。菌株。 第74页/共115页第七十五页，共116页。3分子克隆的主要方法分子克隆的主要方法 （1）构建）构建 cDNA、核、核 DNA 文库，文库，应用现有核酸探针分离新的目的应用现有核酸探针分离新的目的基因

41、；基因； （2） 差式杂交） 差式杂交(differential screen)和扣除杂交和扣除杂交(subtractive hybridization)技术；技术； （3）DD-RT-PCR 法及差别显示法及差别显示技术；技术； 第75页/共115页第七十六页，共116页。（4）差别分析法）差别分析法 (RDA法，即法，即Representational difference analysis）；）；（5）酵母）酵母(jiom)双杂交体系双杂交体系Two-hybrid system；（6）图位克隆法（）图位克隆法（map-based cloning）与染色体步移）与染色体步移 （genomi

42、c DNA Walking）。）。 第76页/共115页第七十七页，共116页。习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从 同 一 受 精 卵 分 裂 而 来 的 单 卵 双 生 子从 同 一 受 精 卵 分 裂 而 来 的 单 卵 双 生 子（monozygotic twins）便属于同一克隆。）便属于同一克隆。 细 胞 学 上 ， 克 隆 是 指 由 同 一 个 祖 细 胞细 胞 学 上 ， 克 隆 是 指 由 同 一 个 祖 细 胞（progenitor cell）分裂

43、而来的具有同一遗传背）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。景的子细胞群体。 分子生物学上， 把将外源分子生物学上， 把将外源 DNA 插入具有自主复插入具有自主复制能力的载体制能力的载体 DNA 中， 使之得以自主复制和永中， 使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。久保存的过程叫做分子克隆。 第77页/共115页第七十八页，共116页。第78页/共115页第七十九页，共116页。文文库库筛筛选选与与基基因因丰丰度度有有关关。 高高丰丰度度基基因因，如如蚕蚕丝丝心心蛋蛋白白，卵卵清清蛋蛋白白 等等 在在 某某 些些 特特 定定 组组 织织 中中 可可 占占 细细 胞胞 总总mRNA

44、量量的的 50-90%，非非常常容容易易被被分分离离。 低低丰丰度度基基因因，一一般般在在细细胞胞中中只只有有 10-20个个拷拷贝贝，哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中可可含含 10,000 到到40,000 种种不不同同的的 mRNA，如如果果要要达达到到99% 的的 期期 望望 值值 ， 大大 约约 需需 要要 筛筛 选选150,000-170,000 个个克克隆隆子子。 一一般般情情况况下下，每每微微克克 cDNA 可可产产生生10 万万-60 万万个个克克隆隆子子。 第79页/共115页第八十页，共116页。 差式杂交或扣差式杂交或扣除杂交克隆技术除杂交克隆技术 第80页/共115页第八十

45、一页，共116页。第81页/共115页第八十二页，共116页。第82页/共115页第八十三页，共116页。第83页/共115页第八十四页，共116页。第84页/共115页第八十五页，共116页。第85页/共115页第八十六页，共116页。 cRNA 差式显示法差式显示法 除了极少数特例除了极少数特例(如组如组蛋白基因蛋白基因)之外，几乎所有之外，几乎所有的真核基因的真核基因mRNA分子的分子的3-末端，都带有一段多聚末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所的腺苷酸结构，即通常所说的说的 poly(A)尾巴。尾巴。 第86页/共115页第八十七页，共116页。P.Liang等人设计合成了全部等

46、人设计合成了全部12种不种不同的引物，用以反转录同的引物，用以反转录mRNA，合，合成第一链成第一链cDNA。这种引物通常叫。这种引物通常叫作作3-端锚定脱氧核苷酸引物，并用端锚定脱氧核苷酸引物，并用5-T11MN或或5-T12MN通式表示。通式表示。其中其中M为除了为除了(ch le)T以外的任何以外的任何一种核苷酸（即一种核苷酸（即A、G或或C），而），而N则为任何一种核苷酸（即则为任何一种核苷酸（即A、G、C或或T），故），故MN共有共有12种不同的排列种不同的排列组合方式。组合方式。 第87页/共115页第八十八页，共116页。第88页/共115页第八十九页，共116页。第89页/共1

47、15页第九十页，共116页。DDRT-PCR 的的主主要要步步骤骤： .从从不不同同发发育育阶阶段段或或不不同同基基因因型型的的细细胞胞群群体体中中分分离离 mRNA，并并以以 3锚锚定定引引物物作作为为反反转转录录的的引引物物， 合合成成第第一一键键 cDNA； .用用 5随随机机引引物物和和某某个个 3端端锚锚定定引引 物物对对扩扩增增第第一一链链(掺掺入入 32p-dNTP)； .用用 DNA 变变性性测测序序胶胶分分离离扩扩增增产产物物，X 光光片片曝曝光光后后检检测测差差别别条条带带； 第90页/共115页第九十一页，共116页。.回收特异性差别条带；回收特异性差别条带； . .用同

48、一引物对扩增已回用同一引物对扩增已回收的收的 DNADNA 条带；条带； . .用用 Northern，Southern及测序法分析所得的条带；及测序法分析所得的条带； . .以该以该 DNA 片段做探针，片段做探针，筛选全长筛选全长 cDNA 或核基因。或核基因。 第91页/共115页第九十二页，共116页。 c cD DN NA A差差式式分分析析法法( (R Re ep pr re es se en nt ta at ti io on na al l d di if ff fe er re en nc ce e a an na al ly ys si is s) ) R RD DA A

49、法法充充分分发发挥挥了了 P PC CR R 以以指指数数形形式式扩扩增增双双链链 D DN NA A 模模板板的的特特性性，通通过过降降低低 c cD DN NA A 群群体体复复杂杂性性和和更更换换 c cD DN NA A 两两端端接接头头等等方方法法， 特特异异扩扩增增了了目目的的基基因因片片段段。 第92页/共115页第九十三页，共116页。因为试验对象（因为试验对象（TesterTester）和供）和供试探针（试探针（DriverDriver）在接受差式）在接受差式分析前均经一个分析前均经一个4 4碱基切割酶碱基切割酶处理处理(chl)(chl)，形成平均长度，形成平均长度256b

50、p256bp的代表群（的代表群（representationrepresentation）保证绝大部）保证绝大部分遗传信息能被扩增。分遗传信息能被扩增。 第93页/共115页第九十四页，共116页。 每次每次 T减减 D反应后仅反应后仅设置设置 72复性与延伸，复性与延伸，94复性这两个参数共复性这两个参数共20 个个 PCR 循环，循环，PCR产物的特异性和所得探产物的特异性和所得探针的纯度非常高。针的纯度非常高。 第94页/共115页第九十五页，共116页。 mRNAcDNA4 碱基内 切 酶消化加 12/14碱基接 头分 开12碱基 短链PCR填充材 料实 验材料去除 原有 接 头 ,

51、连 上新 接 头去 除 原有 接 头1:100混 合 , 变性 , 杂 交线性 扩 增指数扩 增无扩 增1 差异 产 物第95页/共115页第九十六页，共116页。第96页/共115页第九十七页，共116页。 酵母双杂交体系酵母双杂交体系 Two-hybrid system 也叫也叫interaction trap（相互作用（相互作用陷井） ，是陷井） ，是 90 年代初发展起年代初发展起来的分离基因的新方法，可来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用）相互作用的基因。的基因。 第97页/共115页第九十八页，共116页。

52、基本原理：基本原理： 真核生物的转录因子大多是由真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如构域组成的。如 GAL4 的的 N 端端1-147aa 是是 DNA 结合域（结合域（BD） ，其） ，其C 端端 768-881aa 是转录激活域是转录激活域（AD） 。一般情况下，） 。一般情况下，AD 能与能与GAL4 效应基因启动子上游的特定效应基因启动子上游的特定DNA 区段 （区段 （UAS） 相结合， 而此时，） 相结合， 而此时，AD 则推动了转录起始。则推动了转录起始。 第98页/共115页第九十九页，共116页。 若用基因工程的

53、方法， 将若用基因工程的方法， 将GAL4 ADGAL4 AD 和和 BDBD 分别克隆到分别克隆到不同的载体上，导入同一不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因细胞株中表达，效应基因无法被激活无法被激活, ,但可把来自但可把来自不同转录因子的不同转录因子的 ADAD 或或 BDBD区域连成一个功能基因。区域连成一个功能基因。 第99页/共115页第一百页，共116页。第100页/共115页第一百零一页，共116页。主主要要实实验验过过程程： a. 选选择择缺缺失失 GAL4编编码码基基因因的的酵酵母母寄寄主主菌菌株株SFY526 或或 HF7c； b. 构构建建带带有有 GAL1 UAS-启启动动子子-lac Z（His3）的的转转化化载载体体; c. 把把已已知知的的靶靶蛋蛋白白质质编编码码基基因因克克隆隆到到 pGBT9 的的多多克克隆隆位位点点上上，把把所所有有 cDNA 都都克克隆隆到到 pGAD424 载载体体上上，构构成成 cDNA 表表达达文文库库。 第101页/共115页第一百零二页，共116页。从大肠杆菌中分别提取这从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒两种重组质粒 DNA，共转化，共转化感受态酿酒酵母菌株。感受态酿酒酵母菌株。 将共转化的酵母菌株涂布将共转化的酵母菌株涂布于缺少于缺少 Leu，Trp 和和 H