氨基酸含量的测定-茚三酮比色法

1、实验九实验九 氨基酸含量的测定氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）（茚三酮比色法）1. 实验原理实验原理 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三氨基酸（脯氨酸除外）在碱性溶液中与水合茚三酮共热时，产生酮共热时，产生紫色化合物紫色化合物，最大吸收波长在，最大吸收波长在570nm处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基处，在一定浓度范围内，颜色深浅与氨基酸含量成正比，可用比色法进行测定。酸含量成正比，可用比色法进行测定。 氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：2. 实验材料、仪器与试剂实验材料、仪

2、器与试剂材料：材料：酱油酱油仪器：仪器：可见分光光度计，分析天平，容量可见分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管，具塞刻度试管。瓶，移液管，具塞刻度试管。试剂：试剂：茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、茚三酮、氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。磷酸氢二钠、标准氨基酸（异亮氨酸）。3. 实验步骤实验步骤（1）样品的处理：）样品的处理：准确吸取准确吸取0.5mL酱油于酱油于100mL烧杯中，加入烧杯中，加入5g活性炭和活性炭和50mL蒸馏水，置于蒸馏水，置于80水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣水浴锅中，保持半小时后过滤，用蒸馏水将滤渣清洗数遍，收集滤液于清洗数遍，收集滤液

3、于100mL容量瓶中，定容至容量瓶中，定容至刻线，摇匀备用。刻线，摇匀备用。各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴各种试剂加到比色管后混匀，于电炉上沸水浴15min，取出冷却至室，取出冷却至室温后加水至温后加水至10mL刻度线，静置刻度线，静置15min后，在后，在570nm处测定吸光度，处测定吸光度，以氨基酸含量以氨基酸含量(g)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）标准曲线的绘制）标准曲线的绘制管号管号1234567氨基酸标准溶液氨基酸标准溶液/mL00.50.60.70.80.91.0水水/mL1.61.11.00.90.80.70.6磷酸盐

4、缓冲液磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.40.40.40.4茚三酮茚三酮/mL0.40.40.40.40.40.40.4氨基酸含量氨基酸含量/g0100120140160180200 按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行按上表加样后混匀，按标准曲线的步骤进行实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标实验，在相同条件下测定样品的吸光度，并在标准曲线上查出氨基酸含量微克数。准曲线上查出氨基酸含量微克数。（3）样品测定）样品测定管号管号891011样品溶液样品溶液/mL00.50.50.5水水/mL1.61.11.11.1磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液/mL0.40.40.40.4茚三酮茚三酮/m

5、L0.40.40.40.44. 结果计算结果计算5. 说明及注意事项说明及注意事项（1）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可）该法是微量法，对氨基酸的最低检出量可达达0.5g，其其灵敏度高，重现性好。，其其灵敏度高，重现性好。（2）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，）脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，最大吸收波长在最大吸收波长在440nm处。处。（3）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎）通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎后的样品后的样品5g10g或吸取液体样品或吸取液体样品5mL10mL，置于烧杯中，加入置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和蒸馏水和5g左右的活性炭，左右的活性炭，加热煮沸，过滤。用加热煮沸，过滤。用30mL40mL热水洗涤活性热水洗涤活性炭，收集滤液于炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至刻度线，容量瓶中，加水至刻度线，摇匀备用。摇匀备用。6. 思考题思考题（1