第01章蛋白质

1、目目 录录蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能第第 一一 章章Structure and Function of Protein目目 录录一、什么是蛋白质一、什么是蛋白质?蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)相连相连形成的高分子含氮化合物。形成的高分子含氮化合物。目目 录录二、蛋白质的生物学重要性二、蛋白质的生物学重要性1. 蛋白质是生物蛋白质是生物 体重要组成成分体重要组成成分分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。细胞的各个部分都含有蛋白质

2、。含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的分子，占人体干重的45，某些组织含量更，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。目目 录录1 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶）2 2）代谢调节作用）代谢调节作用3 3）免疫保护作用）免疫保护作用4 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储5 5）运动与支持作用）运动与支持作用6 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递2. 蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能3. 氧化供能氧化供能目目 录录蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 组组 成成The

3、Molecular Component of Protein第第 一一 节节目目 录录一一. 组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素.主要有主要有C、H、O、N和和S。 有些蛋白质含有少量有些蛋白质含有少量磷磷或金属元素或金属元素铁、铁、铜、锌、锰、钴、钼铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有，个别蛋白质还含有碘碘 。目目 录录 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：下公式推算出蛋白质

4、的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 ( g % )= 每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16% 蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点目目 录录一、一、蛋白质的基本单位蛋白质的基本单位- -氨基酸氨基酸( (一一) )氨基酸的结构氨基酸的结构( (通式通式) ) 存在自然界中的氨基酸有存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有体蛋白质的氨基酸仅有20种种(20-22)，且均属，且均属 L-氨氨基酸基酸（甘氨酸除外）如图示。（甘氨酸除外）如图示。目目 录录H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式

5、RC+NH3COO-H目目 录录 非极性側链氨基酸非极性側链氨基酸 非电离极性側链氨基酸非电离极性側链氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 碱性氨基酸碱性氨基酸( (二）氨基酸的分类二）氨基酸的分类* * 20 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下: :目目 录录甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalan

6、ine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.30非极性側链氨基酸非极性側链氨基酸目目 录录目目 录录色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.602. 非电离极性側链氨

7、基酸非电离极性側链氨基酸目目 录录目目 录录天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸酸性氨基酸4. 碱性氨基酸碱性氨基酸目目 录录目目 录录几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2目目 录录-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-C

8、H-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3目目 录录* 以肽键相连接以肽键相连接,肽键肽键(peptide bond)是由一是由一个氨基酸的个氨基酸的 -羧基上的羟基与另一个氨羧基上的羟基与另一个氨基酸的基酸的 -氨基上的氢原子脱水缩合而形氨基上的氢原子脱水缩合而形成的化学键成的化学键,如图示如图示:三三. 氨基酸在蛋白氨基酸在蛋白质中的连接方式质中的连接

9、方式目目 录录NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO目目 录录* * 肽肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。合物。* * 两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽，三分子氨，三分子氨基酸缩合则形成基酸缩合则形成三肽三肽* * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residu

10、e)。* * 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡寡肽肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连由更多的氨基酸相连形成的肽称形成的肽称多肽多肽(polypeptide)。目目 录录N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有两端多肽链有两端* 多肽链多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。酸之间以肽键连接而成的一种结构。目目 录录N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶目目 录录. . 几种生物活性肽几

11、种生物活性肽 1. 谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione, GSH)目目 录录GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+ NADP+ 目目 录录 体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽神经肽(neuropeptide)2. 多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽目目 录录蛋蛋 白白 质质 的的 分分 子子 结结 构构The Molecular Structure of Protein 第第 二二 节节目目 录录蛋白质的分子结构包括蛋白质的分子结构包括 一级结构一级结构(primary structure)二级结构二级

12、结构(secondary structure)三级结构三级结构(tertiary structure)四级结构四级结构(quaternary structure)高级高级结构结构目目 录录定义定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。顺序。一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构主要的化学键主要的化学键(主键主键)肽键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。，有些蛋白质还包括二硫键。 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。它由遗传密码决定功能的基础。它由遗传密码决定, ,其上有酶切位其上有酶切位点点, ,一级结构可

13、测定一级结构可测定, ,并不同种属间有同源性并不同种属间有同源性. .目目 录录目目 录录二、蛋白质的空间结构二、蛋白质的空间结构指蛋白质分子空间的三维结构指蛋白质分子空间的三维结构, ,即立体即立体, ,空间的构象，在蛋白质分子中各元素围绕空间的构象，在蛋白质分子中各元素围绕某些化学键进行旋转某些化学键进行旋转, ,从而形成各种空间排从而形成各种空间排布及相互关系布及相互关系( (一一). ).蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构1. 1.肽键平面肽键平面( (肽单元肽单元, ,肽平面肽平面, ,酰胺平面酰胺平面) ), ),是蛋白质的基本结构单位是蛋白质的基本结构单位. .如图如图: :目目

14、录录参与肽键的参与肽键的6个原子个原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一平位于同一平面，此同一平面上的面，此同一平面上的6个原子个原子构成了所谓的构成了所谓的肽单元肽单元 (peptide unit) 。目目 录录有关对肽键平面的描述？有关对肽键平面的描述？目目 录录NCNN:目目 录录 2. 2.二级结构的概念与基本形式二级结构的概念与基本形式A.A.概念概念: :一条多肽链中局部原子一条多肽链中局部原子的空间排佈的空间排佈B.B.二级结构的基本形式二级结构的基本形式 - -螺旋螺旋 ( -helix ) - -折叠折叠 ( -pleated sheet ) - -转角转角 ( -tur

15、n ) 不规则卷曲不规则卷曲 ( random coil ) - -螺旋螺旋目目 录录目目 录录 - -折叠折叠目目 录录 -折叠折叠目目 录录 -转角转角 - -转角转角目目 录录-转角转角 180的转角部位的转角部位由由4个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成由第由第一个残基的羰基氧（一个残基的羰基氧（O）与第四个残基的氨基氢（）与第四个残基的氨基氢（H）可形成氢键可形成氢键多含脯氨酸和甘氨酸多含脯氨酸和甘氨酸目目 录录不规则卷曲环或卷曲结构 ：无规卷曲是用来阐述没无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。有确定规律性的那部分肽链结构。 相对没有规律性的排布，但是其同样表现重要生物学功用

16、。 C.二级结构的维系力:氢键目目 录录. .模体模体在许多蛋白质分子中，可发现二个或在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体模体(motif)。目目 录录钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌指结构锌指结构 目目 录录.氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成 -

17、 -螺旋螺旋或或-折叠，它就会出现相应的二级结构。折叠，它就会出现相应的二级结构。 目目 录录(二二)、蛋白质的三级结构、蛋白质的三级结构氢键、氢键、离子键、疏水键、离子键、疏水键、Van der Waals力等。力等。 2.主要的化学键主要的化学键（维系力）（维系力）一条多肽链中全部氨基酸残基一条多肽链中全部氨基酸残基(全部元素全部元素)的的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。包括主链，側链的全部内容排布位置。包括主链，側链的全部内容1. 概念概念 为非共价键，次级键目目 录录目目 录录 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) 肌红蛋白为单肽链肌

18、红蛋白为单肽链蛋白质，含蛋白质，含153个个氨基酸残基，它含氨基酸残基，它含有有8个个螺旋区，依螺旋区，依次称为次称为A到到H螺旋，螺旋，并含有并含有转角及环转角及环-卷曲等二级结构。卷曲等二级结构。 目目 录录2. 2.维系力亚基之间的结合力主要是疏水作维系力亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。用，其次是氢键和离子键。（三）蛋白质的四级结构（三）蛋白质的四级结构( (或蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚或蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的蛋白质的四级结构四级结构。) )1. 1.概念概念 有些蛋白质分子含有二

19、条或多条多有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的四级结构为蛋白质的四级结构. .而每条多肽链被称为而每条多肽链被称为亚基亚基 (subunit)。目目 录录.蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构具有四级结构蛋白质具有四级结构蛋白质目目 录录review目目 录录Summary目目 录录三三 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系(一一)、蛋白质的一级结构与功能的关系、蛋白质的一级结构与功能的关系 (二二)、蛋白质的空间结构与功能的关系、蛋白质的空间结构与功能的关系目目 录录.一级结构是空间构象的基础一级结构是空

20、间构象的基础 (一一)、蛋白质一级结构与功能的关系、蛋白质一级结构与功能的关系 牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一级结构一级结构二二硫硫键键目目 录录 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性目目 录录. .一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系例：镰刀形红细胞贫血例：镰刀形红细胞贫血N-val his leu thr pro glu glu C(146) HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-val his leu thr pro val glu C(146) 这种由蛋白质分子发生变异

21、所导致的疾病，这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为称为“分子病分子病”。目目 录录.肌红蛋白与血红蛋白的结构肌红蛋白与血红蛋白的结构 (二二)、蛋白质空间结构与功能的关系、蛋白质空间结构与功能的关系 目目 录录目目 录录Hb与与Mb一样能可逆地与一样能可逆地与O2结合，结合， Hb与与O2结合后称为结合后称为氧合氧合Hb。氧合。氧合Hb占总占总Hb的百的百分数（称分数（称百分饱和度百分饱和度）随）随O2浓度变化而改变。浓度变化而改变。.血红蛋白的构象变化与结合氧血红蛋白的构象变化与结合氧 目目 录录肌红蛋白肌红蛋白(Mb)和血红蛋白和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线的氧解离曲线目目 录录*

22、协同效应协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为力的现象，称为协同效应协同效应。 如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)如果是抑制作用则称为如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应 (negative cooperativity)目目 录录目目 录录O2血红素与氧结血红素与氧结合后，铁原子半径合后，铁原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中

23、，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。目目 录录变构效应变构效应(allosteric effect)蛋白质空间结构的改变伴随其功蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为能的变化，称为变构效应变构效应。目目 录录.蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。致疾病发生。目目 录录蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些

24、蛋：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。目目 录录疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的正常的Pr

25、P富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病目目 录录第三节第三节蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters of Protein目目 录录（一）蛋白质的两性解离和（一）蛋白质的两性解离和等电点等电点 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液

26、pHpH条条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的荷为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。目目 录录蛋白质等电点Protein pIPepsin 1.0Serum albumin 4.9Urease 5.0Hemoglobin 6.8Myoglobin 7.0Chymotryp

27、sinogen 9.5Lysozyme 11.0目目 录录PrNH+目目 录录二二. .蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至万至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。，为胶粒范围之内。 * * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜目目 录录+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳

28、定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉目目 录录三三. .蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。物活性的丧失。目目 录录 造成变性的因素造成变性的因素如如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、加热、乙醇等有

29、机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。质的一级结构。目目 录录变性蛋白质的特点: 粘度增加，溶解度降低，易沉淀粘度增加，溶解度降低，易沉淀,易被易被蛋白酶降解蛋白酶降解,丧失生物学活性丧失生物学活性.目目 录录 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 目目 录录若蛋

30、白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为象和功能，称为复性复性(renaturation) 。目目 录录 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性目目 录录* * 蛋白质沉淀蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质

31、发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 目目 录录四四. .蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收波长处有特征性吸收峰。蛋白质的峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因与其浓度呈正比关系，因此可作蛋

32、白质定量测定。此可作蛋白质定量测定。目目 录录五五 蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。三酮反应。 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双双缩脲反应缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。程度。目目 录录二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化（一）透

33、析及超滤法（一）透析及超滤法* 透析透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。开的方法。* * 超滤法超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。目目 录录（一）透析（一）透析目目 录录（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀时，必须在时，必须在04低温下进行，低温下进行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白倍于蛋白质溶液体积。蛋

34、白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。外，也可用乙醇沉淀。 *盐析盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。沉淀。 目目 录录* * 免疫沉淀法：免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体体识别相应的抗原蛋白，并形成抗

35、原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。离获得抗原蛋白。 目目 录录bindingwashelution免疫沉淀免疫沉淀抗体Protein A-agarose目目 录录（三）电泳（三）电泳蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术, , 称为称为电泳电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物

36、的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。胶电泳等。 目目 录录几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电聚焦电泳等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技是蛋白质组学研究的重要技术。术。目目 录录SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳目目 录录（四）层析（四）层析层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个待分离

37、蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。目目 录录蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* * 离子交换层析：离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，又称分子筛层析，利利用用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。目目 录录目目 录录目目 录录（五）超速离心（五）超速离心* * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用蛋白质在离心场