经典液相色谱(2011年3月)10-11-2

1、l第一节第一节 经典柱色谱经典柱色谱l第二节第二节 薄层色谱法薄层色谱法TLCl第三节第三节 薄层扫描法薄层扫描法l第四节第四节 纸色谱法纸色谱法液相色谱法液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称。（HPLC等）液固吸附柱色谱、液液分配柱色谱、离子交换柱色谱等。一一. 液液固吸附柱色谱固吸附柱色谱:固体吸附剂固体吸附剂: 一些多孔性物质,表面布满吸附点位(吸附中心)。吸附吸附: 溶质在液固、气固 两相交界面上集中浓缩的现象。 它发生在固体表面上。(一一) 色谱分离过程色谱分离过程: X : 样品中各组分分子 Y : 流动相分子 Xm: 流动相中溶质 Ya: 吸附剂表面的流动相分子 Xa: 吸附剂吸

2、附的溶质分子 Ym: 流动相由Ya回到流动相中 Xm nYa Xa nYm +吸附 解吸附 吸附平衡常数: 由于流动相分子是大量的,所以Ym/ Ya 可视为常数。 Ka = Xa / Xm 吸附常数组分Ka越大, tR越长。(组分易被吸附,移行速度慢,保留值就大)。 洗脱曲线: Ka = XaYm nXmYanR(二二)吸附等温线吸附等温线(不要求）不要求） 一定温度,某组分在吸附剂表面吸附平衡,该组分在两 相中的浓度相关曲线。 1、直线形等温线直线形等温线是理想等温线,其所对应的色谱峰为对称 峰。即吸附剂表面没被溶质所饱和，斜率K=Cs/Cm，组 分流出速度不受浓度的影响。峰前不变形，后不拖

3、尾。2、凸形凸形：由于固体吸附剂表面活性不同，大多数液相色谱 非线形，且凸形较多。吸附剂表面具有吸附能力不同的 吸附点位，溶质在其表面的分配系数不同。溶质分子先 占据强吸附点位，然后再占据次强的、弱的、最弱的。 强的吸附点位被饱和，在洗脱过程中，被强吸附的溶质 洗脱较慢，所以其洗脱峰呈拖尾峰。（减少进样量）3、凹形凹形：由于进样量较大，影响了固定相的物理性质。随 溶质量的增加, 吸附越强，Cs/Cm增加，所以呈凹形;开始难洗脱,洗到一定程度吸附变弱,快速被洗下来。伸舌峰或前沿（延）峰。 。（减少进样量） 结论：为防止流出曲线变形（伸舌或拖尾），应控制溶质进样量。(三三). 吸附剂的选择和吸附活

4、度：吸附剂的选择和吸附活度： 1. 对吸附剂的要求：对吸附剂的要求： (1)表面积大，具有一定的吸附能力。 (2)不应与流动相发生化学反应。 (3)粒度要细，一般要200目。 2. 吸附剂：吸附剂：常用的有：氧化铝、聚酰胺、硅胶等。 酸性pH = 54 分离酸性与中性物质. 如氨基酸 (1) 中性pH = 7.5 氧化铝 分离酸性碱性中性物质.P459 碱性pH =910 分离碱性与中性物质. 如生物碱 酸碱性氧化铝能分离的中性氧化铝都能分离,在酸碱中不稳定的的苷类等中性氧化铝也能分离,所以中性氧化铝应用广泛. (2) 硅胶: 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸或中性物(如 有机酸、氨基酸、甾

5、体等)。硅醇基硅醇基是使硅胶有一 定吸附能力的活性基团。 l颗粒目数的定义：所谓目数，是指物料的粒度或粗细度，一般定义是指在1英寸*1英寸的面积内有多少个网孔数，即筛网的网孔数，物料能通过该网孔即定义为多少目数：如200目，就是该物料能通过1英寸*1英寸内有200个网孔的筛网。以此类推，目数越大，说明物料粒度越细，目数越小，说明物料粒度越大。筛孔尺寸与标准目数对应：筛孔尺寸：4.75mm 标准目数： 4目筛孔尺寸：4.00mm 标准目数： 5目筛孔尺寸：3.35mm 标准目数： 6目筛孔尺寸：2.80mm 标准目数： 7目筛孔尺寸：2.36mm 标准目数： 8目筛孔尺寸：2.00mm 标准目数

6、：10目筛孔尺寸：1.70mm 标准目数：12目筛孔尺寸：1.40mm 标准目数：14目筛孔尺寸：1.18mm 标准目数：16目筛孔尺寸：1.00mm 标准目数：18目筛孔尺寸：0.850mm标准目数：20目筛孔尺寸：0.710mm标准目数：25目筛孔尺寸：0.600mm标准目数：30目筛孔尺寸：0.500mm标准目数：35目筛孔尺寸：0.425mm标准目数：40目筛孔尺寸：0.355mm标准目数：45目筛孔尺寸：0.300mm标准目数：50目筛孔尺寸：0.250mm标准目数：60目筛孔尺寸：0.212mm标准目数：70目筛孔尺寸：0.180mm标准目数：80目筛孔尺寸：0.150mm标准目数

7、：100目筛孔尺寸：0.125mm标准目数：120目筛孔尺寸：0.106mm标准目数：140目筛孔尺寸：0.090mm标准目数：170目筛孔尺寸：0.075mm标准目数：200目筛孔尺寸：0.063mm标准目数：230目筛孔尺寸：0.053mm标准目数：270目筛孔尺寸：0.045mm标准目数：325目筛孔尺寸：0.040mm标准目数：400目筛孔尺寸：0.013mm标准目数：500目 三种存在形式: 吸附能力 ： 活性大小 ： SiOHSiO HOSiOHOSi 自由型束缚型活泼型 (3) 聚酰胺:由酰胺聚合而成的高分子物质。 其吸附原理利用分子内酰胺基和羰基,可与酚、酸、硝基 化合物等形成

8、氢键。吸附力与能形成氢键的基团有关。 对位间位取代基均能形成氢键的,吸附力增大。邻位基团 间能形成分子内氢键的,吸附力减小。芳香核具有较多共 轭键时,吸附力增大。CH2CH2CH2CH2CH2CNHOn3. 吸附剂的活度：吸附剂的活度：P459表表18-1 氧化铝、硅胶的吸附力的大小, 与其含水量有较大的关系： 活度级数 含水量 活度 吸附能力 小 少 大 强 大 多 小 弱 所以，加热除水，活度提高，吸附力加强。 加一定水，活度下降，吸附力减弱。 活化：105110加热除水为活化。 脱活：加一定水份，降低活性。 P459表18-1要求掌握(具体数字不要求,掌握之间关系)组分 极性 吸附能力

9、洗脱次序 B 大 强 后 A 小 弱 先极性小的先流出，极性大的后流出(掌握)4. 薄层色谱法测薄层色谱法测Al2O3的活度的活度: 把柱色谱法配置的染料溶液点在待测活性的氧化铝薄层板上(软板), 每种点24g , 用石油醚展开, 展距10cm, 观察染料斑点中心移动距离在10.5cm, 则此吸附剂为级。 填空题：硅胶（SiO2H2O）含水量越大，活性级越大，活性越弱，吸附能力越小(四四) 流动相，固定相的选择流动相，固定相的选择: 流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。 要求: 1. 纯度高 2. 稳定(对样品和吸附剂不反应) 3. 对样品溶解度大 4. 粘度小(易洗脱)。 流动相的洗脱实质上是

10、流动相分子与被分离分子竟占吸附 剂表面活性中心的过程。选择流动相应考虑三个方面: 1. 被分离物质的极性与结构: (1) 基本母核相同 , 基团极性愈大 , 分子极性愈大。 基本母核相同 , 极性基团数目愈多 , 分子极性愈大。(2) 分子双键多, 吸附力 , 共轭度, 吸附性 。 (3) 空间排列 , 影响极性。 如：样品极性大小顺序: 烷烃 烯烃 醚类 硝基化合物 二甲胺 脂类 酮类 醛类 硫醇 胺类 酰胺 醇类 酚类 羧酸类 2. 吸附剂的活度: 被分离物质的极性 吸附剂活度 大 应选 小 防吸附太牢,难洗脱 小 大 防tR太小,不易分离 COOHOHCHOOHO3. 流动相: 相似相溶

11、的原则 被分离物质的极性 吸附剂活度 流动相极性 大 小 大 小 大 小 常用流动相极性强弱顺序: 石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 甲苯 乙醚 氯仿 醋酸乙酯 正丁醇 丙醇 乙醇、甲醇 1 , 说明B+ 较牢地结合在树脂上 KB/A 1 , 说明A+ 较牢地结合在树脂上 所以KB/A说明了树脂对A+、 B+两种离子选择性交 换的能力,故也称之为选择性系数选择性系数。 KB/A , B与树脂结合能力强 , 洗脱慢 , tR 。KB/A=B+ A+r A+ B+ rR A+ B+ R B+ A+熟悉p4632. 选择性系数与分配系数的关系: 即: 分配系数不同是离子交换分离的先决条件。 KB/A=B

12、+ A+r A+ B+ r=AKKB 第二节第二节 薄层色谱法薄层色谱法TLC 操作流程: 铺板 活化 点样 饱和 展开 显色 定性 , 定量。 一一. 原理原理: 将混合组分的试液, 点在铺了吸附剂的玻璃板一端, 在密闭容器中用适当的溶剂 (展开剂、流动相) 展开, 各组分不断地被吸附, 解吸附 随展开剂前移, 利用吸附剂对不同组分的吸附力吸附力 (吸附常数吸附常数)不同不同, 产生差速迁移差速迁移, 而达到分离。 特点: 快速、灵敏(几几十微克)、 高选择、显色方便。 (Thin Layer Chromatography)二二 参数参数: (一一) 定性参数定性参数: 比移值 讨论: Rf

13、 = 0 未移行 (被固定完全吸附, K ) Rf = 1 移至前沿 (组分不被固定相吸附, K 0 ) 一般: 0 Rf 1 Rf是薄层色谱的定性参数, 在同一色谱条件下, 同样结构的分子有相同的Rf值。原点到斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离=Rf=L/L0 (掌握)物质极性大, 吸附力强; 反之, 物质极性小, 吸附力弱。 续前续前讨论讨论 Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板 和展开剂的性质有关 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为kVVKRmSf1111LL0fRKffRRk1续前续前 1）K大，Rf小 2）薄层板一定，对于极性

14、组分 展开剂极性大，Rf大（容易洗脱） 展开剂极性小，Rf小 （不容易洗脱） 3）Rf范围：0 Rf 1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.20.8（常用） 0.30.5（最佳） 某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现 形差。有人建议用相对可比值定性。 (了解) 参考斑可以是另加的物质,亦可以样品中另一组分为参考。 Rf值的大小, 主要取决于该组分在两相间的分配系数, 因此: (了解) Vm: 薄层板的死体积; VS: 板固定相体积; K: 该条件的分配系数 原点到斑点中心的距离原点到参考斑的中心距离Rs=VmVm + KVsRf=(二二)分离参数分离参

15、数: 分离度 L1、L2色斑中心到原点的距离。 W1、W2两色斑的峰宽(扫描测定)。一般亦可用纵向直径。21211222/ )(WWdWWLLRR=1.0 二斑点基本分开二斑点基本分开三三. 固定相固定相 1. 吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用, 但相薄层色 谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细粒度比柱色谱更细。 硅胶 40 m (一般要求200目左右) 常用硅胶GF: 吸附剂、硅胶、粘合剂、石膏,掺入荧光剂 254 nm,呈黄绿色。 符号符号: 硅胶G 硅胶+ 石膏 硅胶H 硅胶(未加任何物质) 硅胶HF 硅胶不含粘合剂+荧光物质 硅胶GF 硅胶+石膏+荧光物质n硅胶硅胶GF254

16、锰激活的硅酸锌锰锰激活的硅酸锌锰2. 铺板: 常用平滑的玻璃板,洗净待用。 软板: 吸附剂直接铺涂。最大缺点, 风吹即飞(已不用)。 硬板: 吸附剂+粘合剂糊状铺板凉干活化 常用粘合剂: CMC-Na 羧甲基纤维素钠。( 0.250.75%的 CMC-Na水溶液与吸附剂3：1调粘研磨) 活化: 凉干的板在105110活化0.51小时,于干燥器中备用。 四四. 展开剂选择展开剂选择: (同柱同柱)仅操作方法不同。仅操作方法不同。 分离强极性物质, 选择强极性展开剂, 同时也应考虑固 定相的活性。 物质极性 吸附剂活度 流动相极性 防止 大 小 大 太牢, Rf太小 小 大 小 规律:样品极性与流

17、动相一致,与固定相极性或活度相反. 分离混合样品时, 展开剂选择一般规则: (1)先用单一的中等极性展开剂试一下。 (2)改用二元或多元展开剂, 其比例要摸索。 (3)分离酸性组分,可在展开剂中加入一定比例的酸(甲酸、醋酸、磷酸、草酸等）；分离碱性组分,可在展开剂中加入一定比例的碱(二乙胺、乙二胺、氨水等）。 目的:减少拖尾，改善分离。 解释：改变展开剂的极性；调整展开剂的pH，抑制弱酸或弱碱样品的离解。常用溶剂(记忆)强极性：酸，醇类中等极性：乙酸乙脂，氯仿弱极性：环己烷，石油醚例例: A、B两组分试样 A B 展开剂 苯 Rf 0.45 0.42 分不开 改为 苯+乙醇 Rf 0.38 0

18、.52 可分开 能否说出 A、B哪一组分极性大？ 解：显然B的极性大。因为展开剂极性加大时, 极性大的组分 Rf(相似相溶)。 一般做实验组分Rf控制在0.20.8之间。 五五. 点样与展开点样与展开: (一)点样 点样量一般在一几十g, 23 mm。 点样量太大, 斑易拖尾, 影响分离效果。 注注: 有时用于薄层制备与分离提取时,条状点样。 点样位置: 距底边1.52cm处, 铅笔画线、点点。(二)展开: 先饱和1520分钟,再展开,防止边缘效应边缘效应。 * 展开剂浸薄层板下端0.5cm, 不能浸住起始线, 层析缸 应密闭。 展开方式: 为单向展开,亦可双向展开、多次展开等。 l边缘效应:

19、不饱和或饱和不完全的容器中,强极性和弱极性溶剂混合的展开剂中,同一样品出现两边缘斑点跑得快,中间斑点跑得慢的现象.解释：弱极性溶剂和沸点低溶剂在边缘易挥发,它们在边缘浓度较中部少,边缘含有更多极性较大或沸点较高的溶剂,因此产生了边缘效应. 以上见实验教材P158-159六六. 定性与定量定性与定量: (一一)定性定性: 找斑所在位(求Rf)对照。 1. 显色: 本身有色的可日光下显色 紫外灯下显色:有明显荧光斑或暗斑、用于有紫外吸收的物质。 荧光薄层板: (硅胶掺入少量荧光物质),紫外灯下整板呈黄绿色荧光,被测物质吸收紫外光呈暗斑。用于有紫外吸收本身不发光又无适当显色剂的物质。 显色剂: 无色

20、又无紫外吸收的物质. 2. 定性分析: 比较组分与对照品Rf值。 对未知样品,要几个展开体系均有一致Rf值,才可认为同一物质。 (二二)定量定量: 1. 目视比色:色斑大小、深浅 (误差大, 1030%) 2. 洗脱法:刮下,溶解,光度法测定。 5 % (基本符合微量 分析误差要求)。 3. 薄层扫描: 误差束缚型游离型 2）吸水失活 105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力分析酸性或中性物质 续前续前2. 氧化铝氧化铝 碱性氧化铝 pH 910 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 p

21、H 45 适于分析酸性、中性物质3. 聚酰胺聚酰胺 氢键作用 氢键能力强，组分越后出柱 1. 被测组分性质（极性大小）：被测组分性质（极性大小）： 烃 - - - - - - - - 羧酸，醇 2. 吸附剂的活性：吸附剂的活性： 吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力强 强极性物质强极性物质选择弱吸附剂选择弱吸附剂 弱极性物质弱极性物质选择强吸附剂选择强吸附剂3. 流动相的极性：流动相的极性： 流动相极性大，对被测组分的洗脱能力大 “相似相溶相似相溶”原则原则 ：根据组分性质、吸附剂的活性，：根据组分性质、吸附剂的活性， 选择适当极性的流动相选择适当极性的流动相续前续前4. 4. 三者关系图示：

22、三者关系图示： 组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性（一）概述（二）定性参数（三）吸附剂的选择 （四）展开剂的选择 （五）薄层板的制备（六）定性与定量分析1定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法2操作过程：见图示铺板 活化 点样 展开 定位(定性)/洗脱(定量)3分离机制：吸附吸附（分配，离子交换，空间排阻）4特点：分析快速、灵敏、显色方便5应用：药物杂质检查、纯度测定 next图示图示图示图示L0L1L21. 比移值比移值Rf在展开剂中出现的几率为单位时间内一个分子设R在固定相中出现的几率为单位时间内一个分子设

23、R101010LLtLtLuuRR) 1(R01LLRf原点到溶剂前沿的距离心的距离原点到组分斑点质量中mSVVKR11又110LLLVVKmS定时展开保留比续前续前讨论讨论 Rf与K有关，即与组分性质（溶解度）以及薄层板 和展开剂的性质有关 色谱条件一定，Rf只与组分性质有关，是薄层色谱基本定性参数，说明组分的色谱保留行为smmmSfVKVVVVKRR11fRK续前续前 1）K大，Rf小 2）薄层板一定，对于极性组分 展开剂极性大，Rf大（容易洗脱） 展开剂极性小，Rf小 （不容易洗脱） 3）Rf范围：0 Rf 1 （组分迁移速度和距离小于展开剂迁移速度和距离） Rf = 0.20.8（常用

24、） 0.30.5（最佳）2. 相对比移值相对比移值Rs 讨论讨论参考物与被测组分在完全相同条件下展开 可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性；参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分相对比移值Rs与组分、参考物性质及色谱条件有关，范围可以大于或小于121LLRRRffs中心的距离原点到参考物斑点质量心的距离原点到组分斑点质量中（参）（组）根据被测物极性和吸附剂的吸附能力根据被测物极性和吸附剂的吸附能力 被测物极性强被测物极性强弱极性吸附剂弱极性吸附剂 被测物极性弱被测物极性弱强极性吸附剂强极性吸附剂（四）展开剂的选择（四）展开剂的选择（同液固吸附色谱流动相的选择） 根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性定性分析窄条定量分析1020cm （六）定性与定量分析（六）定性与定量分析 定性分析日光，紫外光，显色 定量分析洗脱法，薄层扫描法将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、定性、和定量的液-液分配色谱法固定相：纸纤维吸附的水