第九章 原生质体育种

1、 原生质体育种原生质体育种 微生物原生质体融合育种微生物原生质体融合育种 细菌原生质体融合育种细菌原生质体融合育种 放线菌原生质体融合育种放线菌原生质体融合育种 酵母菌原生质体融合育种酵母菌原生质体融合育种 霉菌原生质体融合育种霉菌原生质体融合育种第一节第一节 原生质体育种原生质体育种原生质体具有的新特性：原生质体具有的新特性：1 1、对诱变剂敏感、对诱变剂敏感2 2、对噬菌体不敏感、对噬菌体不敏感3 3、不受感受态影响、不受感受态影响什么是原生质体？什么是原生质体？包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原包括：原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原

2、生质生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质体育种。体育种。一、微生物一、微生物原生质体再生育种原生质体再生育种 1 1原生质体再生育种的一般程序原生质体再生育种的一般程序 ：出发菌株的选择出发菌株的选择菌种活化和预培养菌种活化和预培养原生质体原生质体制备制备原生质体再生原生质体再生高产菌株分高产菌株分离离（初筛）（初筛）复筛复筛遗传稳定性鉴定遗传稳定性鉴定菌种特性及发酵特菌种特性及发酵特性研究。性研究。2 2原生质体再生育种实例原生质体再生育种实例 小单孢菌福小单孢菌福堤堤霉素霉素微生物制备原微生物制备原生质体后直接生质体后直接再生，从再生再生，从再生菌落中分离筛菌落中分离筛选变异菌株，

3、选变异菌株，最终得到优良最终得到优良性状提高的正性状提高的正突变株。突变株。 敏感，细胞壁的重建敏感，细胞壁的重建和分裂能力的再生，和分裂能力的再生，对数期细胞，不需要对数期细胞，不需要遗传标记遗传标记二、微生物原生质体诱变育种二、微生物原生质体诱变育种 （一）原生质体诱变育种方法（一）原生质体诱变育种方法1 1物理诱变剂诱变原生质体的一般程序：物理诱变剂诱变原生质体的一般程序： 取取10 ml10 ml对数生长期微生物培养物，离心收集菌体，对数生长期微生物培养物，离心收集菌体，无菌无菌水水洗洗涤涤离心，菌体离心，菌体沉沉淀物用酶液悬浮，水解去壁制淀物用酶液悬浮，水解去壁制成原生质体成原生质体

4、离离心，高渗溶液洗涤原生质体心，高渗溶液洗涤原生质体原生质体悬原生质体悬浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内浮液稀释至一定密度，取适量放入无菌培养皿内将培养将培养皿移至紫外灯下诱变处理皿移至紫外灯下诱变处理置暗处后处理一定时间置暗处后处理一定时间移入移入再生培养基中再生培养（由再生培养基中再生培养（由于于原生质体较脆弱，用双层平原生质体较脆弱，用双层平板法再生）板法再生）分离优质菌株分离优质菌株突变株稳定性试验突变株稳定性试验突变株突变株鉴定。鉴定。 是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变是以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再

5、生菌落剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。中筛选高产突变菌株。2 2化学诱变剂诱变原生质体的一般程序化学诱变剂诱变原生质体的一般程序 通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及通常操作程序包括：出发菌株培养和原生质体制备及再生再生选选择择合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度合适的化学诱变剂，配制成合适的浓度加入加入原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体）原生质体悬浮液，混合（含有高渗溶液，稳定原生质体）诱变处理诱变处理离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤离心弃诱变剂、原生质体沉淀用稳定液洗涤稀释、分离到再生平板上（双层平板法）稀释、分离到再生平板上

6、（双层平板法）再生培养再生培养观察、筛选突变株观察、筛选突变株复筛复筛突变株鉴定。突变株鉴定。 原生原生质体诱变周期一般质体诱变周期一般比常规诱变育种要长，难度更比常规诱变育种要长，难度更大。大。（二）原生质体诱变育种实例（二）原生质体诱变育种实例1 1扩展青霉原生质体扩展青霉原生质体制备制备2 2、原生质体再生、原生质体再生3 3、原生质体诱变、原生质体诱变4 4、突变株筛选、突变株筛选三、微生物原生质体转化育种三、微生物原生质体转化育种 整条整条DNADNA或或DNADNA片段的转化片段的转化四、微生物原生质融合育种四、微生物原生质融合育种五、其他微生物原生质体育种五、其他微生物原生质体育

7、种 用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细胞壁，制细胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色方法，诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得具有双亲优良性状于一体的稳定融合子良性状于一体的稳定融合子。 聚乙二醇诱导和电融和聚乙二醇诱导和电融和 聚乙二醇种内融合率可高达聚乙二醇种内融合率可高达27%27%，种间的融合率也，种间的融合率也可达可达10%10%，

8、比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱，比常规的杂交重组频率提高千倍以上。电场诱导融合又将融合率提高导融合又将融合率提高1010倍。倍。 原生质体融合育种的特点原生质体融合育种的特点1 1、杂交率高、杂交率高2 2、受接合型或致育型的限制小、受接合型或致育型的限制小3 3、遗传物质传递更为完整、遗传物质传递更为完整4 4、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能5 5、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株6 6、提高菌株产量的潜力较大、提高菌株产量的潜力较大7 7、有助于建立工业微生物转化体系、有

9、助于建立工业微生物转化体系 原生质体融合育种五大步骤原生质体融合育种五大步骤：直接亲本及其遗传标记选择直接亲本及其遗传标记选择；双亲本原生质体制备与再生双亲本原生质体制备与再生；亲本原生质体诱导融合亲本原生质体诱导融合；融合重组体（称为融合子）分离融合重组体（称为融合子）分离；遗传特性分析与测定遗传特性分析与测定； 二、原生质体制备与再生二、原生质体制备与再生（一）（一）原生质体制备原生质体制备 最有效和最常用最有效和最常用的是酶法。的是酶法。一、直接亲本及其遗传标记的选择一、直接亲本及其遗传标记的选择 一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为一般把诱变系谱中筛选获得的不同正突变株作为直接亲

10、本直接亲本 直接亲本都带有遗传标记直接亲本都带有遗传标记 超声波处理菌体释放原超声波处理菌体释放原生质体生质体酶解脱壁释放原生质体酶解脱壁释放原生质体处理细菌细胞壁用酶处理细菌细胞壁用酶 溶菌酶溶菌酶LysozymeLysozyme处理放线菌细胞壁用酶处理放线菌细胞壁用酶 Lytic EnzymeLytic Enzyme裂解酶、裂解酶、 LysozymeLysozyme溶菌酶溶菌酶纤维素酶纤维素酶 CellulaseCellulase 酵母裂解酶酵母裂解酶 Zymolyase Zymolyase -1,3-1,3葡聚糖酶葡聚糖酶几丁质酶几丁质酶 ChitinaseChitinase商品酶商品酶

11、 Novozyme234Novozyme234来自来自 Trichoderma harzianumTrichoderma harzianum Lywallzyme Lywallzyme 广东微生物研究所溶壁酶广东微生物研究所溶壁酶 Glucuronidase Glucuronidase 葡聚糖苷酸酶葡聚糖苷酸酶 ( (for yeastfor yeast) 原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处原生质体的好坏与培养基成分、培养条件，菌龄和预处理等因素有关。理等因素有关。 1 1、 酶法分离原生质体的影响因素酶法分离原生质体的影响因素 （1 1）培养基组成）培养基组成 （2 2）菌体培

12、养方式：）菌体培养方式：丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌丝状菌常用平板玻璃纸法，细菌和酵母菌多用振荡沉没培养法。和酵母菌多用振荡沉没培养法。 （3 3）菌体菌龄：）菌体菌龄：丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生丝状真菌以年轻的菌丝用来分离原生质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前质体最佳。尤其是菌丝体尖端细胞。认为对数期的前期和对数期效果最好期和对数期效果最好。 酵母菌酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高制备原生质体时，要使菌体同步化，才能大幅度地提高制备率；制备率；放线菌放线菌制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想，制备原生质体，以对数期到静止期的转换期比较理想，不

13、仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；不仅制备量多，而且细胞壁再生能力也比较强；细菌细菌适合在对数期分适合在对数期分离原生质体离原生质体（4 4）稳定剂）稳定剂：高渗溶液；：高渗溶液；无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇无机盐对丝状真菌效果较好，而糖和糖醇对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或对酵母更为合适，细菌多使用蔗糖或NaClNaCl，（5 5）酶解前的预处理）酶解前的预处理：SH-SH-化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母自化合物（如巯基乙醇）广泛应用于酵母自和某些丝状真菌中和某些丝状真菌中 ，（6 6）酶系和酶的浓度）酶系和酶的浓度：真菌：真菌-0.5-0.5蜗牛酶和蜗牛酶和0.5%0.5

14、%纤维素酶纤维素酶 ，（7 7）酶的作用温度和作用）酶的作用温度和作用pHpH值值：通常细菌水解细胞壁的温度在：通常细菌水解细胞壁的温度在 35 35左右。一般放线菌的温度在左右。一般放线菌的温度在 30 303232。 （8 8）菌体密度）菌体密度：（9 9）酶解方式）酶解方式：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡可促进原生：酶解时保持较好的通气条件和适当振荡可促进原生质体释放和分离。质体释放和分离。 2 2原生质体的鉴别原生质体的鉴别（1 1）低渗爆破法：）低渗爆破法： （2 2）荧光染色法：）荧光染色法：0.05%-0.1%0.05%-0.1%的荧光增白剂（的荧光增白剂（VBLVBL）3

15、3原生质体的收集和纯化原生质体的收集和纯化（1 1）过滤法：使用砂芯漏斗。）过滤法：使用砂芯漏斗。（2 2）密度梯度离心法：）密度梯度离心法： （3 3）界面法：）界面法： （4 4）漂浮法：）漂浮法： 4 4原生质体的活力鉴定原生质体的活力鉴定（1 1）荧光素双醋酸盐（）荧光素双醋酸盐（FDAFDA）染色法）染色法（2 2）酚藏花红染色法（）酚藏花红染色法（0.01%0.01%染料染色，活红，死白）染料染色，活红，死白） （3 3）伊文思篮染色法）伊文思篮染色法 （0.25%0.25%伊文思篮，活无色，死蓝色）伊文思篮，活无色，死蓝色）5 5原生质体的保存原生质体的保存 （1 1）立即进行融

16、合或其它方式育种）立即进行融合或其它方式育种（2 2） 5 5的二甲亚砜或甘油等其他保护剂；液氮。的二甲亚砜或甘油等其他保护剂；液氮。 （二）原生质体再生（二）原生质体再生 l l、原生质体再生的影响因素、原生质体再生的影响因素菌体生理状态菌体生理状态 稳定剂稳定剂 酶浓度和酶作用时间酶浓度和酶作用时间 再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能再生培养基：丝状真菌、酿酒酵母等的原生质体仅能在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不在固体培养基上再生，在液体培养基中细胞壁再生不彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制，彻底，不能完全复原。再生培养基要用稳定剂配制，还含有还含有CaC

17、a2+2+和和MgMg2+2+, ,浓度和原生质体形成时的酶解液相浓度和原生质体形成时的酶解液相类似，菌种不同稍有差别。类似，菌种不同稍有差别。 残存菌体的分离残存菌体的分离原生质体密度原生质体密度 排除再生培养基上的冷凝水，排除再生培养基上的冷凝水， 再再生方法，生方法， 大分子的合成和大分子的合成和原生质体生长；原生质体生长；细胞壁的合成与细胞壁的合成与再生；分裂能力再生；分裂能力的恢复并开始分的恢复并开始分裂繁殖裂繁殖细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液；霉菌多细菌、放线菌和酵母菌多用糖醇系统的稳定液；霉菌多用盐溶液系统。用盐溶液系统。2 2再生率及其计算再生率及其计算再生频率再生频

18、率= =（再生培养基上的总菌落数（再生培养基上的总菌落数- -酶处理后酶处理后未原生质化菌落数）未原生质化菌落数）/ /原生质体数原生质体数100%细菌原生质体再生频率在细菌原生质体再生频率在9090以上，以上，放线菌的放线菌的50506060，真菌为真菌为20207070。三、原生质体融合三、原生质体融合（一）原生质体融合过程（一）原生质体融合过程 两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定液中，两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定液中，在在PEGPEG的诱导下，两个或两个以上凝聚成团，相邻的诱导下，两个或两个以上凝聚成团，相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质原生质体紧密接触的质膜面扩大，相

19、互接触的质膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异膜消失，细胞质融合，形成一个异核体细胞，异核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体，合二倍体，通过染色体交换，产生各种重组体，称为融合子称为融合子 原生质体原生质体 、PEG PEG 及适量的及适量的CaClCaCl2 2、MgClMgCl2 2（二）原生质体融合的影响因素二）原生质体融合的影响因素 1 1融合剂融合剂： 化学融合剂：不同种类微生物对化学融合剂：不同种类微生物对P PE EG G分分子量的要求不尽子量的要求不尽相同。相同。 物理融合剂：电场和激

20、光物理融合剂：电场和激光 2 2温度：温度：丝状真菌适宜融合的温度约为丝状真菌适宜融合的温度约为3030；而细菌；而细菌原生质体融合的适温往往偏低，据认为原生质体融合的适温往往偏低，据认为44或或2020比比3737更好；放线菌通常在常温（约更好；放线菌通常在常温（约2020）下进行融合。）下进行融合。总的来说在总的来说在20-3020-30下进行融合效果较理想。融合处理下进行融合效果较理想。融合处理时间从时间从1min-1h1min-1h，但大多数微生物，但大多数微生物1 110 min10 min， 3 3、亲株的亲和力和原生质体的活性、亲株的亲和力和原生质体的活性 4 4无机离子：无机离

21、子： 在在PEGPEG介导融合时，介导融合时，通常需要一定梯度的通常需要一定梯度的CaCa2+2+、MgMg2+2+有效地促进融合有效地促进融合 5 5其他条件其他条件 ：细胞密度细胞密度，不少于，不少于10106 6/ml/ml；应采用年轻；应采用年轻的含残余菌丝少的的原生质体进行融合。的含残余菌丝少的的原生质体进行融合。 四、融四、融合合体再生体再生（一）融合体再生（一）融合体再生 双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌双亲融合后形成的融合体不等于重组体，以霉菌来来说说，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融，可能是异核体或杂合二倍体或重组体，它们融合后营养互补，经过再生，均可在基本

22、培养基上形成合后营养互补，经过再生，均可在基本培养基上形成菌落。菌落。 融合体的再生包括融合体细胞壁的合成、重建和融合体的再生包括融合体细胞壁的合成、重建和融合体的再生。融合体的再生。 酵母菌、细菌常用双层平板法，酵母菌、细菌常用双层平板法，与融合前原生与融合前原生质再生率测定相同。霉菌和放线菌除了用双层平板法质再生率测定相同。霉菌和放线菌除了用双层平板法外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上，外，也可把原生质体直接分离到高渗培养基平板上，同样能得到再生菌落。同样能得到再生菌落。 复原：原生质体本身形成细胞壁，而且还能从原生质复原：原生质体本身形成细胞壁，而且还能从原生质体细胞上长出有细

23、胞壁的菌丝体体细胞上长出有细胞壁的菌丝体（二）融合体的检出与分离（二）融合体的检出与分离1 1利用营养缺陷型标记选择融合体利用营养缺陷型标记选择融合体2 2利用抗性选择融合体利用抗性选择融合体3 3用灭活用灭活原生原生质体检出融合体质体检出融合体4 4利用荧光染色法选择融利用荧光染色法选择融合合体体5 5双亲对碳源利用不同而检出融合双亲对碳源利用不同而检出融合体体6 6融合体的其他选择方法融合体的其他选择方法对昆虫的毒力测定进行融合体的选择对昆虫的毒力测定进行融合体的选择利用形态差异选择利用形态差异选择 生化测定指标选择融合体生化测定指标选择融合体 五、融合重组体检出与遗传分析五、融合重组体检出与遗传分析分离重组体，并试验其遗传稳定性研究分离重组体，并试验其遗传稳定性研究 （一）重组体的检出和鉴别的方法（一）重组体的检出和鉴别的方法1 1直接法直接法2 2间接选择法间接选择法3 3钝化选择法钝化选择法（二）融合率（二）融合率 如采用直接法，