第2章1生化实验中的缓冲液

1、生化实验中的缓冲液生化实验中的缓冲液 缓冲溶液的正确配制和缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，值下进行的，而且受到而且受到H+的严格调控，能够做到这一点是因为生物体的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的需要一定的pH值，体内值，体内pH环境的任何改变都将引起与代环境的任何改变都将引

2、起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试

3、剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。值，就是非常重要的基础实验工作。适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： pKa值在值在68之间；之间； 在水中的溶解度高；在水中的溶解度高； 不易穿透生物膜；不易穿透生物膜； 盐效应小；盐效应小； 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； 不与金属离子生成复合物或沉淀；不与金属离子生成复合物或沉淀； 该缓冲剂化学稳定；该缓冲剂化学稳定； 紫外

4、和可见光波长范围内光吸收小；紫外和可见光波长范围内光吸收小； 易制得高纯度的盐。易制得高纯度的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。来配制所需的缓冲溶液。人体体液的人体体液的pH值：值：体体 液液pH体体 液液pH血血 清清7.357.45 大肠液大肠液8.38.0成人胃液成人胃液0.91.5泪泪6.66.9 唾唾 液液6.37.1尿尿4.87.5胰胰 液液7.58.0脑脊液脑脊液7.357.45（一）磷酸盐缓冲液（一）磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲

5、剂，由於它们是二级解离，有二个由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制值，所以用它们配制的缓冲液，的缓冲液，pH范围最宽：范围最宽： NaH2PO4： pKa12.12， pKa27.21 Na2HPO4： pKa17.21， pKa212.32 配酸性缓冲液：配酸性缓冲液： 用用 NaH2PO4，pH14， 配中性缓冲液：配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，用混合的两种磷酸盐，pH68， 配碱性缓冲液：配碱性缓冲液： 用用 Na2HPO4，pH1012。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝

6、胶电泳的缓冲液时，只能聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：磷酸盐缓冲液的优点为： 容易配制成各种浓度的缓冲液；容易配制成各种浓度的缓冲液； 适用的适用的pH范围宽；范围宽； pH受温度的影响小；受温度的影响小； 缓冲液稀释后缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后变化小，如稀释十倍后pH的变化小的变化小于于0.1。 其缺点为：其缺点为： 易与常见的钙易与常见的钙Ca2+离子、镁离子、镁Mg2+离子以及重金属离子离

7、子以及重金属离子缔合生成沉淀；缔合生成沉淀； 会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。会产生某种程度的抑制作用。 应用：应用： 1、PB缓冲液：缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4; 2、PBS缓冲液：缓冲液：Na2HPO4-KH2PO4 , NaCl+KCl (二二) Tris（三羟甲基氨基甲烷，（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris (hydroxymethyl) aminomethane）缓冲液）缓冲液 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在

8、超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效缓冲液的常用有效pH范围是在范围是在“中性中性”范围，范围， 例如：例如： Tris-HCl缓冲液：缓冲液： pH7.58.5 Tris-磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液： pH5.09.0 配制常用的缓冲液的方法有两种：配制常用的缓冲液的方法有两种： 按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列溶液，然

9、后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；用另一种方法； 若配若配1L 0.1mol/L的的Tris-HCl缓冲液：先称缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于碱溶于950mL970mL 无离子水中，边搅拌边滴加无离子水中，边搅拌边滴加4mol/L HCl，用，用pH计测定溶液计测定溶液pH值至所需的值至所需的pH值，然值，然后再加水补足到后再加水补足到1L。 Tris-HCl缓冲液的优点是：缓冲液的优点是： 因为因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制系配制pH范

10、围由酸性到碱性的大范围范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；值的缓冲液； 对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。属离子发生沉淀。 其缺点是：其缺点是： 缓冲液的缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，倍，pH值的变化大于值的变化大于0.1； 温度效应大，温度变化对缓冲液温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，值的影响很大，即：即：pKa0.031 ，例如：，例如：4时缓冲液的时缓冲液的pH8.4，则，则37时的时的pH7.4，所以一定要在使用温度下进，所以一定要在使用温度下进行

11、配制，室温下配制的行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于缓冲液不能用于04; 易吸收空气中的易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封，所以配制的缓冲液要盖严密封; 此缓冲液对某些此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以电极发生一定的干扰作用，所以要使用与要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。溶液具有兼容性的电极。 （三）（三） 有机酸缓冲液有机酸缓冲液 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即范围为酸性，即pH3.06.0，最常用的是甲酸、，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。乙酸、柠檬酸和琥珀酸等

12、。 甲酸甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用甲酸甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸乙酸钠和柠檬酸柠檬后可以用减压法除之。乙酸乙酸钠和柠檬酸柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：值：pKa13.10，pKa24.75， pKa36.40。琥珀酸有二个。琥珀酸有二个pKa值：值：pKa14.18， pKa25.60。 有机酸缓冲液的缺点是：有机酸缓冲液的缺点是： 所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；应过程可能发生干扰作用； 柠檬酸盐和琥珀酸盐

13、可以和过渡金属离子（柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn2+、Mg2+等）结合而使缓冲液受到干扰；等）结合而使缓冲液受到干扰； 这类缓冲液易与这类缓冲液易与Ca2+离子结合，所以样品中有离子结合，所以样品中有Ca2+离离子时，不能用这类缓冲液。子时，不能用这类缓冲液。 （四）硼酸盐缓冲液（四）硼酸盐缓冲液 常用的有效常用的有效pH范围是：范围是：pH8.510.0，因而它是碱，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与

14、糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。冲液受到干扰。 （五）氨基酸缓冲液（五）氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽，可用于此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.011.0，例如，例如最常用的有：最常用的有： 甘氨酸甘氨酸HCl缓冲液：缓冲液：pH=2.05.0， 甘氨酸甘氨酸NaOH缓冲液：缓冲液：pH=8.011.0， 甘氨酸甘氨酸Tris缓冲液：缓冲液：pH=8.011.0，（此缓冲液，（此缓冲液用于广泛使用的用于广泛使用的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），液）， 组氨酸缓冲液：组氨酸缓冲液：pH=5

15、.56.5， 甘氨酰胺缓冲液：甘氨酰胺缓冲液：pH=7.88.8， 甘氨酰甘氨酸缓冲液：甘氨酰甘氨酸缓冲液：pH=8.09.0。 此类缓冲体系的优点是：此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。供更接近的天然环境。 其缺点是：其缺点是： 与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。物化学反应过程，如代谢过程等。 试剂的价格较高。试剂的价格较高。 （六）两性离子缓冲液（六）两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称），又称Goods缓冲液缓冲液 1960

16、年，年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有特有的要求和特性。他们合成的一系些缓冲体系应具有特有的要求和特性。他们合成的一系列列Goods缓冲液可查阅有关的资料。缓冲液可查阅有关的资料。 Goods缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专反应过程，对酶化学反应等

17、无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶敏感的蛋白质和酶的研究工作。的研究工作。 其缺点是：其缺点是： 价格昂贵，价格昂贵， 对测定蛋白质含量的双缩脲法和对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。为它们会使空白管的颜色加深。Goods缓冲液的配制缓冲液的配制(七) pH值的测定 测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。 广泛pH试纸的变色范围是pH=1-14、9-14等，只能粗略确定溶液的pH值。 精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2-3个pH单位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。 测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸，用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。 精确测