实时荧光定量PCR技术

1、基因有限公司基因有限公司市场部市场部 潘娜潘娜Tel:256Tel:256Email: Email: 实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 技术、应用及产品技术、应用及产品l 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR定义定义：在在PCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光信号累积实现了，利用荧光信号累积实现了实时监测整个实时监测整个PCR进程，对进程，对起始模板起始模板进行定量分析的方法。进行定量分析的方法。l 与普通与普通PCRPCR的区别的区别 普通普通PCRPCR技术：技术： 在在PCR结束后对结束后对终点产物终点产

2、物进行定量分析。进行定量分析。 实时定量实时定量PCRPCR技术：技术： 实时检测实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对扩增，在扩增的指数期对起始模板起始模板进行定量进行定量。定量定量PCRPCR技术原理技术原理荧光标记方法荧光标记方法 SYBR Green法工作机理法工作机理- SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光；变性时，DNA双链分开，无荧光；- 随着双链DNA的不断扩增，会结合越来越多的荧光基团，在每个循环的延伸结束阶段采集荧光信号。定量定量PCRPCR技术原理技术原理荧光标记法荧光标记法 TaqMan探针法探针法- 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM

3、、VIC等- 3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)- 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光- Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针定量定量PCRPCR技术原理技术原理SYBR Green法法TaqMan法法优点 对DNA模板没有选择性 使用方便 价格便宜对目标序列的高特异性引物设计相对简单重复性比较好缺点 容易与非特异性双链DNA结合， 产生假阳性 对引物特异性要求高 只适合一个特定的目标价格较高定量定量PCRPCR技术原理技术原理绝对定量和相对定量绝对定量和相对定量绝对定量：通过标准曲线检测起始模板数的精确拷贝数绝对定量：通过标准曲线检测起始模

4、板数的精确拷贝数相对定量：通过内标确定经过不同处理的样本之间基因的表达差异相对定量：通过内标确定经过不同处理的样本之间基因的表达差异HRM分析分析 HRM（High Resolution Melt），即），即“高分辨率熔解曲线高分辨率熔解曲线”，是近几年，是近几年来在国外兴起的最新来在国外兴起的最新SNP及突变研究工具，是一种简单、快速、低成本的及突变研究工具，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型突变扫描和基因分型。 HRM是基于核酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控是基于核酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解

5、曲线变熔解曲线变化而进行分析的一种技术。该技术仅仅只是在标准化而进行分析的一种技术。该技术仅仅只是在标准PCR试剂的基础上再加试剂的基础上再加入双链入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。nHRM应用主要基于两种技术的进步：应用主要基于两种技术的进步：双链双链DNA嵌入型饱和荧光染料如嵌入型饱和荧光染料如LC Green具有精确控温装置和高密度数据采集的仪器具有精确控温装置和高密度数据采集的仪器HRM发明者Carl W

6、ittwer博士原始曲线随着DNA熔解，插入DNA双链中的染料被释放，荧光信号骤降导数图“速率”曲线的最高峰是分离速率最大的点，即等于熔解温度对PCR的扩增子进行加热，温度 从50逐渐上升到95。扩增子逐渐解链，到达熔解温度（Tm）时，DNA双链完全分开。初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度下降。通过检测器，记录荧光变化的过程。对数据作图，就生成了熔解曲线 。HRM分析过程分析过程n嵌入型染料-非饱和染料SYBR Green InSYBR Green I 对PCR有抑制作用，必需使用低浓度；即使是高浓度，也不能饱和插入DNA双螺旋结构中的小沟n非饱和态结合使染料在熔解

7、过程中发生重排，染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，特异性下降 n嵌入型染料-饱和染料LC Greenn饱和染料在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR；高浓度的染料饱和插入DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，熔解曲线有更高的分辨率n饱和染料主要有LC Green、LC Green Plus、CYTO 9等 n目前市场上HRM分析仪器的供应商，有专用于HRM的仪器，还有附带HRM功能的Real Time PCR仪HRM对检测仪器的要求n扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突变，就会改变DNA链的解链温度。n解链温度差异

8、极小，零点几摄氏度，使用高分辨率的仪器才可以检测。 孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020-0.264），孔间温度均温度均一性要达到一性要达到0.2640.264 以内才能保证HRM分析结果的准确性。大多数Real Time PCR仪的孔间温度差在0.3-0.5，决定了无法胜任HRM 熔解速率（最低要求：0.1/秒） 数据密度（最低要求：10个数据点/）成功的HRM分析的先决条件分析小片段分析小片段DNA：将引物的退火温度设计在60 度左右，片段长度100-250bp 分析纯度单一的产物起始模板浓度均一化：起始模板浓度均一化：建议用分光光度计检测核酸的浓度和纯度检查扩增曲线是否异

9、常检查扩增曲线是否异常保持扩增产物浓度接近保持扩增产物浓度接近确保样品间的均一性确保样品间的均一性采集足够的数据采集足够的数据实验设计实验设计样品准备防止核酸降解避免过量的抑制剂,如乙醇为使结果更佳，尽可能保证起始样品浓度一致建议用分光光度计检测核酸的浓度和纯度注意注意:260 nm 时1OD等于 50 g/mL的双链DNA纯的其260 nm/280 nm 应为 2试验设计准则对目标序列进行充分了解对目标序列进行充分了解 确定目标序列内的各种变化形式 检查种属同源性 内含子外显子边界 剪切位点 已知SNP等将引物的退火温度设计在将引物的退火温度设计在60 度左右，片段长度度左右，片段长度100

10、-250bp 可以使用长片段，但长片段检测的灵敏度会受影响确定产物和引物在退火温度时的折叠特征 (使用如DINAMelt，并确定特异性 (BLAST 搜索)扩增子的设计方法第一步：确定正确的周边序列第一步：确定正确的周边序列在数据库中寻找含有多态性位点的序列，NCBI SNP 在线搜索引擎(/SNP)第二步：鉴定其它序列特性第二步：鉴定其它序列特性 将你的序列与全基因组序列进行BLAST，以确定目标序列内是否存在其它多态性位点（这些位点会以蓝色标出，而目标位点以黄色标出）第三步：拷贝含有目标位点的序列，避免那此蓝色位点第三步：拷贝含有目标位点

11、的序列，避免那此蓝色位点第四步：将目标序列粘贴到扩增子设计软件（这里用第四步：将目标序列粘贴到扩增子设计软件（这里用Primer 3软件软件 /cgibin/primer3/primer3_www.cgi）第五步：建立引物设计参数。第五步：建立引物设计参数。如片段长度6090bp (最多达 250 bp)，引物长度18-27 bp，TM 值 57-63 ，GC 含量 20-80%第六步：选择引物。第六步：选择引物。分别选择两三条上下游引物第七步：检查二级结构第七步：检查二级结构。用二级结构解释软件检查引物和扩增子的折叠特性。这里使用了DINAMelt

12、 Servers(/applications/hybrid/twostate-fold.php)第八步：将引物序列与该物种基因组序列相第八步：将引物序列与该物种基因组序列相BLAST，以确定其特异性，以确定其特异性第一步：确定正确的周边序列例（Factor V Leiden）：第二步：鉴定其它序列特性第三步：拷贝含有目标位点的序列，避免那些蓝色位点第四步：将目标序列粘贴到扩增子设计软件第五步：建立引物设计参数第六步：选择引物第七步：检查二级结构第八步：将引物序列与该物种基因组序列相BLAST，以确定其特异性反应体系反应体系ComponentCo

13、ncentrationDiluent (Mol. Biol. Grade water)-PCR Buffer1XMgCl21.5 mMdNTPs0.2 mMForward primer300 nMReverse primer300 nMSYTO91.5 MEvaGreen1-2XTaq DNA polymerase1.25 UDNA Template3 x 109copies/L所需的试剂与耗材 试剂 耗材热启动TaqPlatinum Taq DNA polymerase (Invitrogen)Hotstart Taq (Qiagen)10X PCR 缓冲液随Taq酶50 mM MgCl2随

14、Taq酶100 mM dNTP溶液Invitrogene, NEB等饱和内掺染料SYTO 9 (Invitrogen)EvaGreen (Biotium)LC Green (Idaho Technology)Eco platesEco Adhesive Seals试剂的处理与保存条件ReagentStorage Temp.Storage StateTaq DNA polymerase20oCNot Critical10X PCR Buffer20oCNot Critical50 mM MgCl21824oCNot Critical100 mM dATP Solution20oCNot Crit

15、ical内掺染料20oCDark软件设置软件设置 演示结果分析结果分析标准视图：差异视图：1. 突变发现/筛查/扫描2. SNP 基因分型/等位基因区分3. 物种鉴定4. 甲基化位点的筛查/甲基化程度分析5. 法医学鉴定、亲子鉴定。检测单核苷酸多态性SNP鉴定，插 入/缺失多态性DIP鉴定等 HRM应用n可以区分单碱基差异可以区分单碱基差异nHRM基因分型不需要设计特异性的基因分型不需要设计特异性的TaqMan探针，只是通过溶解曲线探针，只是通过溶解曲线的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。的分析来区分等位基因，从而大大降低了检测成本。n使用两种不同的等位基因特异性正向引物，正向引物使

16、用两种不同的等位基因特异性正向引物，正向引物3 端的最后一个端的最后一个碱基对应于碱基对应于SNP位点的两等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染位点的两等位基因，反向引物都一样，并使用荧光染料来检测料来检测PCR产物。纯合子基因组产物。纯合子基因组DNA只能被与其完全匹配的正向只能被与其完全匹配的正向引物扩增，而杂合子基因组引物扩增，而杂合子基因组DNA能同时和两种正向引物结合扩增出能同时和两种正向引物结合扩增出两种两种PCR产物。产物。HRM应用nHRM区分单碱基差异n同源双链（Homoduplex）n纯合子通过Tm值（CT）容易区分T ACGHRM应用T ACGnHRM区分单碱基差异n异源

17、双链+T ACG+T GCAn杂合形的样品在经过扩增后形成四种不同双链的混合，其中杂合形的样品在经过扩增后形成四种不同双链的混合，其中G:C、A:T的混合的混合使杂合型的熔解曲线表现为前两种熔解曲线的整合形，而使杂合型的熔解曲线表现为前两种熔解曲线的整合形，而A:C、G:T的错配双的错配双链使它的熔解曲线更趋向低温区，综合以上使杂合型的熔解曲线与纯合型的熔链使它的熔解曲线更趋向低温区，综合以上使杂合型的熔解曲线与纯合型的熔解曲线呈现交叉。解曲线呈现交叉。HRM应用应用已知已知SNP分析分析Factor V Leiden（G1691A）突变的HRM检测。HRM应用应用种属鉴定种属鉴定临床分枝杆菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行临床分枝杆菌的鉴定。对临床细菌的培养物进行16SrDNA的实时扩增，的实时扩增，并进行并进行HRM分析，每个菌种的熔解曲线模式就如同该物种的分子指纹，分析，每个菌种的熔解曲线模式就如同该物种的分子指纹，从而可以根据从而可以根据HRM的不同对细菌种属进行鉴定