植物组织培养培养基及操作技术

1、第三章第三章 培养基及一般培养技术（培养基及一般培养技术（4学时）学时）3.1 3.1 培养基的种类和成份（培养基的种类和成份（1 1学时）学时）3.2 3.2 培养基的制备（母液的配制和保存；培养基的制备（母液的配制和保存；MSMS培养基的配制）（融入实培养基的配制）（融入实验课）；一般操作技术（灭菌、接种、培养、移栽驯化）（验课）；一般操作技术（灭菌、接种、培养、移栽驯化）（2 2学时）学时）3.3 3.3 组培常见问题与对策（污染、褐化、玻璃化）（组培常见问题与对策（污染、褐化、玻璃化）（1 1学时）学时）第一节第一节 培养基的培养基的成分成分和和种类种类一、培养基的成分1 1、无机营养

2、元素、无机营养元素(inorganic element) (inorganic element) 1)1)大量元素：大量元素：指浓度大于指浓度大于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 NN、P P、K K、MgMg、S S和和CaCa等等 。2)2)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol0.5mmolL L的元素。的元素。 FeFe，B B，MnMn，CuCu，MoMo，ClCl等等 。 在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。 种类：种类：VBl(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、 VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、 Vpp(

3、烟酸烟酸)、 Vc（抗坏血酸）、（抗坏血酸）、 VH(生物素生物素)、 VB11(叶酸叶酸)、 VB12（钴胺素（钴胺素)等。等。 使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.11.0mgL。 又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。 使用浓度使用浓度：一般为：一般为lOOmglOOmgL L， 作用作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。对细胞壁的形成也有作用。 培养基及

4、其配制培养基及其配制 作用作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 使用浓度使用浓度：为：为1010200mg200mgL L。培养基及其配制培养基及其配制5、有机附加物 （天然复合物）培养基及其配制培养基及其配制6 6、植物生长调节物质、植物生长调节物质(hormone) (hormone) 培养基及其配制培养基及其配制 * *作用作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进主要

5、被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。 在促进生长方面，根对生长素最敏感。在在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，极低的浓度下，(10(10-5-51010-8-8mgmgL)L)就可促进生就可促进生长，其次是茎和芽。长，其次是茎和芽。培养基及其配制培养基及其配制吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid）萘乙酸：萘乙酸：NAA（naphthalene acetic acid）吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（indolebutyric acid）2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4D (2,4-dic

6、hlorophenoxybutyric acid) 培养基及其配制培养基及其配制生长素作用强弱顺序：生长素作用强弱顺序：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4D(2,4二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制种类：种类： 6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤) Kt (kinetin 激动素激动素) Zt (zeatin 玉米素玉米素) 培养基及其配制培养基及其配制细胞分裂素作用强弱顺序细胞分裂素作用强弱顺序Kt ( 激动素激动素)6BA(6苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt (玉米素玉米素)强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制GAGA3 3（

7、赤霉酸）：（赤霉酸）：作用作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。植株。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当有影响：当生长素赤霉素比值高生长素赤霉素比值高时有利于时有利于木质木质部部分化，分化，比值低比值低时有利于时有利于韧皮部韧皮部分化。分化。培养基及其配制培养基及其配制7、培养材料的支持物 -琼脂(agar) 固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂。 用量：用量：6 610g10gL L。 琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合

8、物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40 40 即凝固为固体状即凝固为固体状凝胶。凝胶。 琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时高压灭菌时的温度、时间、的温度、时间、pHpH值值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。 培养基及其配制培养

9、基及其配制固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点优点: :操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点缺点: :培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触( (即吸收即吸收) )面积小，各种面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。产生毒害作用。固体培养固体培养液体培养液体培养培养基及其配制培养基及其配制8、抗生物质(antibiotic) 种类：卡那霉素、头孢霉素、种类：卡那霉素、头孢霉素、青

10、霉素、链霉素、庆青霉素、链霉素、庆大霉素等。大霉素等。 浓度：浓度：520mg/L。 作用：作用：可可防止菌类污染防止菌类污染。培养基及其配制培养基及其配制9 9、活性炭、活性炭(active carbon) (active carbon) 目的：目的：是是利用其吸附能力，减少一些有毒物质利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响的影响；利于生根。；利于生根。 使用浓度：使用浓度：15gL。 它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。减弱，甚至不吸附。培养基及其配

11、制培养基及其配制作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。代谢过程的介质和溶媒。 注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。水。培养基及其配制培养基及其配制二、培养基的二、培养基的PHPH值值 (pH value)(pH value)1、多数植物要求、多数植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI调节调节. .3、注意：注意：p经高压灭菌后，培养基经高压灭菌后，培养基pHpH

12、会下降会下降0.2-0.8,0.2-0.8,故故调整调整pHpH值时值时, ,应高于应高于0.50.5；ppHpH的大小会影响琼脂的凝固能力，当的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0pH6.0时，培养基将会变硬，时，培养基将会变硬，pH 5.0pH 5.0时，琼脂凝固时，琼脂凝固不好。不好。培养基及其配制培养基及其配制种类种类最适最适pH值值种类种类最适最适pH值值杜鹃杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡萝卜、石刁胡萝卜、石刁柏柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7培养基及其配制培养基及其配制不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表) 培养基

13、培养基(culture medium) ：是植物组织培养的重要基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功合适的培养基，培养才有可能成功。 三、培养基的种类、配方及特点三、培养基的种类、

14、配方及特点培养基及其配制培养基及其配制1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、 生根培养基生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、 改良培养基。改良培养基。培养基及其配制培养基及其配制F 若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为的培养基，称为基本培养基基本培养基。F 在基本培养基的基础上，添

15、加各种各样的生在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全完全培养基。培养基。初代培养基：初代培养基： 指用来第一次接种外植体的培养基。指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：继代培养基：指用来接种初代培养之后培养物的培养基指用来接种初代培养之后培养物的培养基 。培养基及其配制培养基及其配制1 1、MSMS培养基：培养基：它是它是19621962年由年由MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为培养为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。 特点：特

16、点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的是无机盐离子浓度较高，有高含量的N N、K K，硝，硝酸盐量大，营养丰富。酸盐量大，营养丰富。培养基及其配制培养基及其配制成分名称成分名称药品药品名称名称原配方量原配方量(mg)/L大量元素大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170微量元素微量元素MnSO4H2O22.3ZnSO47H2O8.6CoCl26H2O0.025CuSO45H2O0.02H3BO36.2Na2MoO42H2O0.25KI0.83铁盐铁盐FeSO47H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物有机物烟酸烟酸(Vpp)

17、0.5盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1肌醇肌醇100甘氨酸甘氨酸22 2、WhiteWhite培养基：培养基：19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根为培养番茄根尖而设计的。尖而设计的。特点：特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。无机盐浓度较低，适于生根培养。培养基及其配制培养基及其配制(4)B(4)B5 5培养基培养基: :是是19681968年由年由GalmborgGalmborg等为培养大豆等为培养大豆根细胞而设计的。根细胞而设计的。特点：特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。硫胺素。(5)KM(5)KM8

18、P8P培养基培养基: :它是它是19741974年为原生质体培年为原生质体培养而设计的。养而设计的。特点：特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。单糖和维生素。培养基及其配制培养基及其配制2 2、WhiteWhite培养基培养基 19431943年由年由WhiteWhite为培养番茄根尖而设计为培养番茄根尖而设计 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高MgSOMgSO4 4的浓度和增加硼元素的浓度和增加硼元素 无机盐浓度较低无机盐浓度较低 使用广泛使用广泛 在生根培养、胚胎培养中有良好的效果在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素

19、含量含量(mg/L）微量元素微量元素含量含量铁盐铁盐含量含量有机物有机物含量含量(mg/L其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸烟酸0.3琼脂琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO42003 3、B5B5培养基培养基 19681968年由年由GamborgGamborg等为培养大豆

20、根细胞而设计等为培养大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分组成成分数量数量(mg/l）组成成分组成成分数量数量(mg/l)KNO32500FeSO47H2O27.8CaCl22H2O150CuSO45H2O0.025MgSO47H2O250蔗糖蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇肌醇100H3BO43.0烟酸烟酸1.0MnSO44H2O10盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇1.0ZnSO47H2O2.0激动素激动素0.1Na2MoO42H2O0.252,4D0.11.0CoCl26H2O0.025盐酸硫铵素盐酸硫铵素10

21、Na2-EDTA37.3B5培养基的组成和配方4 4、N6N6培养基培养基 19741974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 KH2PO4和（和（NH4NH4）SO4SO4含量高，不含钼含量高，不含钼组成成分组成成分数量数量(mg/l)组成成分组成成分(mg/l)KNO32.3Na2EDTA37.3CaCl22H2O166FeSO47H2O27.8MgSO47H2O185蔗糖蔗糖50KH2PO4400pH5.8(NH4)2SO4463烟酸烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸甘氨酸2.0MnSO44H2O4.4盐酸硫

22、铵盐酸硫铵1.0ZnSO47H2O1.5N6培养基组成及配方第二节第二节 培养基的培养基的配制配制 一、一、 培养基的配制培养基的配制 （一）、母液（一）、母液(stock solution)的配制和保存的配制和保存 所谓所谓母液母液是欲配制液的是欲配制液的浓缩液浓缩液。 意义意义: 保证各物质成分的准确性保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取配制时的快速移取 便于低温保藏。便于低温保藏。 一般母液配成比所需浓度高一般母液配成比所需浓度高10-10010-100倍。倍。 母液配制时可分别配成母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等盐、有机物和激素类

23、等。培养基及其配制培养基及其配制单配法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用浓度的母液。一般用mg/ml mg/ml 或或mg/Lmg/L表示。表示。混配法：混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。倍数称量，分别溶解后再混合成母液。配制生长素类：配制生长素类：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒酒精助溶精助溶。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。配制细胞分裂素类：配制细胞分裂素类：一般先用少量一般先用少量0.5

24、-1N0.5-1N盐酸加热盐酸加热溶解溶解。浓度为：。浓度为：1-5mg1-5mgmlml。培养基及其配制培养基及其配制母液的配制方法：母液的配制方法：培培养养基基母母液液的的配配制制 母液名称母液名称药品药品名称名称原配方量原配方量(mg)/L扩大倍数扩大倍数 称取量称取量(mg)母液体积母液体积(ml)移取量移取量(ml)/L大量元素母液大量元素母液NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl22H2O440104400MgSO47H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液微量元素母液MnSO4H2O22.310022301

25、00010ZnSO47H2O8.6100860CoCl26H2O0.0251002.5CuSO45H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MoO42H2O0.2510025KI0.8310083铁盐母液铁盐母液FeSO47H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液有机物母液烟酸烟酸(Vpp)0.5502550010盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.55025盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.1505肌醇肌醇100505000甘氨酸甘氨酸250100培养基及其配制培养基及其配制配制方法：配制方法：1 1）、将母液按）、将母液按顺序顺序摆放摆放2 2）、

26、取适量的蒸馏水）、取适量的蒸馏水( (所需培养基量的所需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3）、按需要量依次取母液及生长调节物质）、按需要量依次取母液及生长调节物质4 4）、加入蔗糖）、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5）、加琼脂）、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5）、）、定容定容6)6)、调、调PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7)7)、分装培养瓶，封口分装培养瓶，封口8)8)、高压灭菌、高压灭菌培养基及其配制培养基及其配制第三节第三节 组培技术（组培技术（灭菌、接种、培养、移栽驯化灭菌、接种、培养、移栽

27、驯化）消毒消毒:是指杀死、消除或充分是指杀死、消除或充分抑制抑制部分微生物，部分微生物，使之不再发生危害作用。使之不再发生危害作用。灭菌灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的体表面和孔隙内的一切微生物或生物体一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。即把所有生命的物质全部杀死。培养基及其配制培养基及其配制一、培养基的灭菌一、培养基的灭菌常用的灭菌方法常用的灭菌方法物理方法物理方法化学方法化学方法干热灭菌干热灭菌(烘烧和灼烧烘烧和灼烧)湿热灭菌湿热灭菌(常压或高压蒸煮常压或高压蒸煮)射线处理射线处理(紫外线、超声波、微波紫外线、超声波、微波)过滤

28、除菌过滤除菌大量无菌水冲洗大量无菌水冲洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福尔马林福尔马林)过氧化氢过氧化氢高锰酸钾高锰酸钾来苏儿来苏儿漂白粉漂白粉次氯酸钠次氯酸钠酒精酒精培养基及其配制培养基及其配制培养基的灭菌湿热灭菌法培养基的灭菌湿热灭菌法 培养基在制备后的培养基在制备后的24h内完成灭菌。内完成灭菌。 高压灭菌的原理高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108kPa108kPa的压力的压力下，锅内下，锅内温度达温度达1

29、21121。在此蒸气温度下，可以。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。培养基及其配制培养基及其配制将锅内将锅内空气空气完全排除后，关闭完全排除后，关闭放气阀。放气阀。当压力表上升达当压力表上升达108kPa108kPa时，锅内温度达时，锅内温度达121121（在此蒸气温度下，可以很快（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持芽孢），维持15-30min15-30min。培养基及其配制培养基及其配制灭菌方法：灭菌方法： 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式

30、高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：汽灭菌锅，使用时要注意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；、锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空、装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响、增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响 灭菌效果；灭菌效果；4、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵、灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进行；、排气降压时应缓慢进行；6、只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才、只有待高压锅内压

31、力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；能开启压力锅；7、高压锅工作时，应有专人看守。、高压锅工作时，应有专人看守。高压灭菌的原理 在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达的压力下，锅内温度达121。在。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。热的芽孢。 注意事项注意事项 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才

32、能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到表上升达到0.1MPa时时,开始计时，维持压力开始计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。分钟。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，在同一温

33、度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三其原因有三：一是湿热中细菌菌体：一是湿热中细菌菌体吸收水分，吸收水分，蛋白质较易凝固蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大湿热的穿透力比干热大；三是；三是湿热的蒸汽有潜热湿热的蒸汽有潜热存在，每存在，每1克水在克水在100时，由时，由气态变为液态时可放出气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，在使用高压蒸汽灭菌

34、锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 如果压力未降到如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生，造成棉塞沾染培养基而发生污染，需逐渐减

35、压。污染，需逐渐减压。 过滤灭(除)菌（不耐热的物质 ） 一些生长调节剂一些生长调节剂( (赤霉素、玉米素赤霉素、玉米素) )、某些维生素是不耐热的，常用某些维生素是不耐热的，常用过滤过滤灭菌灭菌- -细菌过滤器细菌过滤器方法。方法。 防细菌滤膜网孔的直径为防细菌滤膜网孔的直径为0.45m0.45m以以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过。通过。培养基及其配制培养基及其配制空间及物体表面灭菌空间及物体表面灭菌培养基及其配制培养基及其配制l熏蒸剂熏蒸剂: :甲醛甲醛和和高锰酸钾，高锰酸钾，1 1周后通风周后通风1 1天天。(1)紫外线灭菌紫外线灭菌(2)熏蒸灭菌熏蒸灭

36、菌l10-2010-20分钟分钟 灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用，检验灭菌效果。 检验方法：检验方法： 将培养基置于培养室中将培养基置于培养室中3 3天，若没有污染现象，说明灭菌可天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。靠，可以使用。 保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。 保存时间不可过长。保存时间不可过长。培养基的保存培养基的保存二、外植体的选择和灭菌二、外植体的选择和灭菌 1、 外植体的选择外植体的选择 2、 外植体的灭菌方法外植体的灭菌方法 3、 污染原因和预

37、防措施污染原因和预防措施 1 1、外植体的选择、外植体的选择 植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、植物组织培养的主要过程大致包括：培养基的制备、外植体外植体的选择的选择、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。 1 1）、选择优良的种质）、选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究，选取选取性状优良的种质，性状优良的种质，或或特殊的基因型特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目。对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。的，具有一定的代表性，提高成

38、功机率，增加其实用价值。 2 2）、选择健壮的植株）、选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取选取发育正常的器官或组织发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。比较容易培养成功。3 3）、选择最适的时期）、选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节、植物的生长发组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节、植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，

39、这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高高，而且生长速度快，增殖率高。4 4）、选取适宜的大小）、选取适宜的大小 培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太培养无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。脱毒培养的材料，则应更小。三、外植体的灭菌方法三、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常

40、用灭菌药剂的使用和效果2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的使用和效果、常用灭菌药剂的使用和效果灭菌剂灭菌剂使用浓度（使用浓度（% %）清除的难易清除的难易消毒时间消毒时间效效 果果次氯酸钙次氯酸钙910910易易530530很好很好次氯酸钠次氯酸钠2 2易易530530很好很好漂漂 白白 粉粉饱和浓度饱和浓度易易530530很好很好氯氯 化化 汞汞0.110.11较难较难210210最好最好酒酒 精精70757075易易0.220.22好好过氧化氢过氧化氢10121012最易最易515515好好溴溴 水水1212易易210210很好很好硝硝 酸酸 银银1 1较难较难5305

41、30好好抗抗 菌菌 素素450mg/L450mg/L中中30603060较好较好2、外植体的灭菌方法、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处预处理理。植物材料一般采取的预处理方法是：。植物材料一般采取的预处理方法是：先对植物组织进行先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌细菌和和真菌真菌，因此还需进一步灭菌。，因此还需进一步灭菌。 常规的表面灭菌处理

42、方法常规的表面灭菌处理方法把材料放进把材料放进70%的酒精中约的酒精中约30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）浸泡）浸泡510min 。 或用或用10%的的次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液浸浸泡泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗无菌蒸馏水冲洗35次。次。灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好灭菌时进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好 的接触。的接触。在灭菌剂里滴入数滴在灭菌剂里滴入数滴0.1%的的Tween20（吐温）（吐温） 或或Tween80湿润剂，则灭菌效果更好。湿润剂，则灭菌效果更好。 四、污染原因和预防措施四、污染原因和预防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在组织培养过程中

43、培养基和培养材料滋生杂菌，导致培是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。养失败的现象。污染的原因：污染的原因：从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。作人员未遵守操作规程等引起的。细菌污染的特点细菌污染的特点：在外植体附近的培养基中出现在外植体附近的培养基中出现浑浊浑浊和和云雾状云雾状痕痕迹。迹。一般在接种后一般在接种后12天即可发现。天即可发现。原因：材料带菌；原

44、因：材料带菌； 培养基灭菌不彻底；培养基灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程。操作人员未遵守操作规程。因此接种人员的手应经常用因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在使用前必须在火焰上烧红。使用前必须在火焰上烧红。真菌污染的特点真菌污染的特点：培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色培养瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝菌丝块。块。在接种后在接种后310天才能发现。天才能发现。原因：周围环境不清洁；原因：周围环境不清洁； 超净工作台的过滤装置失效；超净工作台的过滤装置失效； 培养瓶等器皿的口径过大。培养瓶等器皿的口径过大。为了减少损失，提高工

45、作效率，必须在每个操作环节注意防止污染为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。的发生。 2 2、污染的预防措施、污染的预防措施 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭集中进行高压灭菌菌，再清除污染物，然后洗净备用。，再清除污染物，然后洗净备用

46、。1）防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进行枝条先进行预培养预培养。u枝条枝条 水洗净水洗净 插入无糖的营养液或自来水插入无糖的营养液或自来水 抽枝抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少材料的污染。接种。这样便可大大减少材料的污染。u在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待 抽出的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明抽出的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明 显减少污染。显减少污染。 （2）选择合适的时间去田间

47、采取外植体）选择合适的时间去田间采取外植体 避免避免阴雨天阴雨天去田间采取外植体。去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌真菌。 但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。染

48、效果。2 2）外植体的灭菌）外植体的灭菌（1 1）多次灭菌法：）多次灭菌法： 首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在）； 其次，将切好的外植体放入其次，将切好的外植体放入1.3%1.3%的次氯酸盐溶液中，灭菌的次氯酸盐溶液中，灭菌30min30min； 第三，在无菌蒸馏水中冲洗第三，在无菌蒸馏水中冲洗3-53-5次；次； 第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度； 第五，次日将叶片用第五，次日将叶片用2.6%2.6%次氯酸钠灭菌次氯酸钠灭菌30min30min，然后

49、用蒸馏水，然后用蒸馏水洗洗3-53-5次。次。（2 2）多种药液交替浸泡法）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料：对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片； 第第2，将材料放入，将材料放入70%酒精酒精中灭菌数秒钟；中灭菌数秒钟； 第第3，在，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min； 第第4，放入，放入

50、5%10%次氯酸钠次氯酸钠溶液中并滴入溶液中并滴入“吐温吐温80”数滴，灭菌数滴，灭菌1530min，或浸入或浸入0.1%0.2%升汞升汞溶液中并加入溶液中并加入“吐温吐温80”数滴，灭菌数滴，灭菌510min； 第第5，用无菌水冲洗，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 3）玻璃器皿的灭菌）玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可

51、延长达25min30min。干热灭菌法干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。行灭菌。煮沸灭菌煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。菌。4 4）金属器械的灭菌）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：火焰灭菌法：即把金属器械放在即把金属器械放在95%的酒的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。干热灭菌法：干热灭菌法：即将擦洗干净或烘干的金属即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱器械用纸包好，盛在金属盒内，放

52、在烘箱中灭菌。中灭菌。 湿热灭菌法：湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，质品，放入高压锅中，121 C的温度，灭菌的温度，灭菌20 min30min。5 5）布质制品的灭菌）布质制品的灭菌 6 6）无菌操作室的灭菌）无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔灭或的新洁尔灭或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20-30min。使用前用。使用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落的酒精喷雾

53、，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。7 7）操作人员在接种时一定要严格按）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行照无菌操作的程序进行 在接种前要在接种前要剪除指甲剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好在新最好在新洁尔灭溶液中浸泡洁尔灭溶液中浸泡10min，后用，后用75%的酒精擦手，并用的酒精擦手，并用75%的酒的酒精擦拭接种精擦拭接种瓶表面瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。 工作人员在接种时，工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话最好不

54、要感冒咳嗽和说话。操作人员操作。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染染。如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变如脱毒培养的茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。干，或不慎感染杂菌。 小小 结结1、外植体的选择、外植体的选择 ：优良种质、健壮植株：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大、最适的时期、适宜的大小。小。 2、外植体的灭菌方法：、外植体的灭菌方法：9种常用灭菌药剂的使用及其效果种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体、外植体的灭菌方法。的灭菌方法。3、污染原因和预防措

55、施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料、污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。程序进行）。 四、 外植体的接种和培养 1、 外植体的接种 2、 培养条件 1 1、外植体的接种、外植体的接种外植体的接种外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中是把经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境中切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养

56、基上的全部操作切割或分离出器官、组织、细胞并转入到无菌培养基上的全部操作过程。过程。操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防止工作人员本身引起的污染。起的污染。整个接种过程均须整个接种过程均须无菌操作：无菌操作：酒精擦拭手酒精擦拭手外植体消毒外植体消毒浸泡浸泡5min器器械械消消毒毒酒精灯灼烧酒精灯灼烧接种的具体操作接种的具体操作旋转灼烧旋转灼烧取外植体取外植体接种接种盖好瓶塞盖好瓶塞1操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口

57、罩、帽子、鞋套。操作人员需穿着经消毒的白色工作服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良进入接种室前，双手必须进行消毒，用肥皂和水洗涤能达到良好的效果好的效果,进行操作前再用进行操作前再用75%的酒精擦洗双手。的酒精擦洗双手。2操作期间经常用操作期间经常用75%的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止的酒精擦拭双手和台面。特别注意防止“双重传递双重传递”的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等的污染，例如器械被手污染后又污染培养基等。3在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是在打开培养瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边管口边沿沿沾染沾染的微生物的微生

58、物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰落入管内，解决这个问题，可在打开前用火焰烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，烧瓶口。如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用以杀死存在的细菌。为避免灰尘污染瓶口，可用纸纸包扎瓶口和包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。4 4工具用后及时消毒，避免交叉污染。工具用后及时消毒，避免交叉污染。5 5工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸时细菌是很少的，但是谈话

59、或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应禁止禁止不必要的谈话不必要的谈话并戴上口罩。并戴上口罩。6 6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应拿应拿成斜角，成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在使用前浸泡在95%95%酒精中，用时在火焰上消毒，待酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后冷却后使用。每次使用前均需进行用具消毒。使用。每次使用前均需进

60、行用具消毒。 外植体的培养条件外植体的培养条件 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育，研究植物的生命活动。培养室的培养条件要生命活动。培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求根据植物对环境条件的不同需求进行调控进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培养基的pHpH值等。值等。1 1、光照光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。对离体培养物的生长发育，光照