重组人胰岛素的研究历史与生产工艺

1、讲解：马文瑞（讲解：马文瑞（201020132152201020132152）组员：谷萌组员：谷萌(201020132022)(201020132022) 杜京京杜京京(201020132072) (201020132072) 王宇蓉王宇蓉(201020132232)(201020132232)一、胰岛素简介一、胰岛素简介二、胰岛素研究历史二、胰岛素研究历史三、胰岛素制备工艺三、胰岛素制备工艺四、重组人胰岛素四、重组人胰岛素 4.1 4.1菌种制备菌种制备 4.2 4.2胰岛素的产生和精制（即菌种的发胰岛素的产生和精制（即菌种的发酵培养）酵培养） 4.3 4.3药物检测药物检测五、问题与展望五

2、、问题与展望胰岛素是由胰岛素是由胰岛胰岛 细胞细胞受内源性或外源受内源性或外源性物质刺激而分泌的一种性物质刺激而分泌的一种蛋白质蛋白质激素。激素。胰岛素是机体内唯一降低胰岛素是机体内唯一降低血糖血糖的激素，的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来外源性胰岛素主要用来糖尿病糖尿病治疗。治疗。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。3D Structure of Insulin胰岛素二聚体（胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（胰岛素六聚体（hexamer ）二、胰岛素的研究历史二、胰岛素的研究历史 1921年年-由加拿

3、大人由加拿大人F.G.班廷和班廷和C.H.贝斯特贝斯特从动物胰腺中提取出胰岛素，从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年年-重结晶胰岛素重结晶胰岛素1930s-传统中、长效动物胰岛素传统中、长效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和单峰胰岛素和 单组分胰岛素单组分胰岛素 70年代末年代末-半合成胰岛素半合成胰岛素1982年年-采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。采用基因重组技术生产的人胰岛素正式上市。90年代至今年代至今-重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。和长效人胰岛素类

4、似物。 胰岛素的发展史胰岛素的发展史1920192019301930194019401950195019601960197019701980198019901990200020001923 1923 动物胰岛素动物胰岛素1973 1973 单组分胰岛素单组分胰岛素1987 1987 人胰岛素人胰岛素1996 1996 胰岛素类似物胰岛素类似物1946 NPH 1946 NPH 胰岛素胰岛素1953 1953 长效胰岛素长效胰岛素到1987第一支人胰岛素第一支人胰岛素问世，并于同年应用于人，因为与人的天然胰岛素氨基酸序列完全相同，所以抗原性大大降低。从动物胰岛素到人胰岛素是胰岛素历史的极大进步，

5、之后动物胰岛素时代终结。美国的美国的礼来公司礼来公司已经获准大规模工业化生已经获准大规模工业化生产胰岛素产胰岛素 诺和诺德诺和诺德制造的胰岛素开始在市场上大量制造的胰岛素开始在市场上大量销售销售 法国赛诺菲安万特法国赛诺菲安万特全球第一个生产甘精胰全球第一个生产甘精胰岛素类似物的企业岛素类似物的企业通化东宝通化东宝中国最大的重组人胰岛素生产厂中国最大的重组人胰岛素生产厂家家此外，还有此外，还有甘李药业、江苏万邦、联邦制甘李药业、江苏万邦、联邦制药等药等三、胰岛素制备工三、胰岛素制备工艺艺 以动物胰脏为原料提取胰岛素以动物胰脏为原料提取胰岛素 -酸醇提取法酸醇提取法 传统胰岛素传统胰岛素-猪、牛

6、胰脏提取，只经一步重结晶猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶 单峰胰岛素单峰胰岛素-凝胶过滤纯化凝胶过滤纯化 单组分胰岛素单组分胰岛素-凝胶过滤、离子交换纯化凝胶过滤、离子交换纯化从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个个氨基酸不同，牛胰岛素中有氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体个氨基酸不同，因而易产生抗体 半合成胰岛素半合成胰岛素-将猪胰岛素第将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素半合成人胰岛素 重组重组

7、DNADNA技术生产人胰岛素技术生产人胰岛素 AB链合成：分别表达链合成：分别表达AB链，化学方法连接链，化学方法连接 逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素（广泛）（广泛）通过基因工程酵母菌通过基因工程酵母菌E Ecolicoli发酵生发酵生产产hPIhPI，经后加工形成，经后加工形成hIhI。提取目的基因提取目的基因提取质粒提取质粒基因重组基因重组将质粒送回大肠杆菌将质粒送回大肠杆菌 胰岛素的产生胰岛素的产生 重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年 的发酵工程为基础，结合现在的基因工程技基因工程技术术的产物，

8、在菌种制备后的发酵培养过程 更是可靠和安全的。 发酵培养流程见下图表：菌种扩培菌种扩培种子罐培养种子罐培养发酵罐培养发酵罐培养发酵液固液分离发酵液固液分离P1P1纯化纯化P1P1沉淀、干燥沉淀、干燥 P2P2纯化纯化 P2P2沉淀、干燥沉淀、干燥 脱帽脱帽 成品粗纯化成品粗纯化 成品精纯化成品精纯化 过滤冻干过滤冻干 菌种扩陪：菌种库中取出菌种进行活化及初步扩大培养 种子罐培养：在种子罐中进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期时转入发酵罐培养 发酵罐培养：分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表达目的产物，HPLC检测目的产

9、物含量 发酵液固液分离：目的产物存在于发酵液上清液中，此步骤主要控制目的产物回收率 P1纯化：通过两步柱层析，主要试剂为乙醇与异丙醇，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白，利用紫外检测仪控制目的产物回收率P1沉淀、干燥：调节PH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I固体 控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇 P2纯化：再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇 P2沉淀、干燥：调节PH值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II固体 脱帽：通过控制湿度与温度进行脱帽反应，得到终产物胰岛素 主要试剂为丙酮，产品为半固体 成品粗纯化：经过两步柱层析对胰岛素进行提纯，试剂为Tris-HCl

10、和异丙醇 通过超滤对提纯后的胰岛素进行浓缩，通过管道传递到下工序 成品精纯化：通过制备色谱对胰岛素粗品进行精制，主要试剂为色谱乙腈 然后经两步结晶后通过管道过滤除菌到百级区 过滤冻干：对胰岛素成品进行一次结晶和水洗 对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品 这种重组人工胰岛素的检测重点应该是这种重组人工胰岛素的检测重点应该是 测定生物活性测定生物活性 效价测定效价测定 控制产品中杂质潜在有害物质控制产品中杂质潜在有害物质 保证产品安全性和有效性保证产品安全性和有效性胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，胰岛素在糖尿病治疗中具有无可替代的作用和地位，但因注射给药让许多患者产但因注射给药让许多患者产 生畏惧心理，使其作生畏惧心理，使其作用发挥受到限制。用发挥