药物设计学 11第十一章 基于片段的药物分子设计

1、第十一章第十一章 基于片段的药物分子设计基于片段的药物分子设计 Fragment-Based Drug Design内容提要第一节第一节 基于片段的分子设计原理基于片段的分子设计原理第二节第二节 活性片段的检测技术活性片段的检测技术 磁共振技术磁共振技术 质谱技术质谱技术 X-射线单晶衍射技术射线单晶衍射技术第三节第三节 从片段到先导化合物从片段到先导化合物2基于片段的基于片段的药物设计药物设计 Fragment-Based Drug Design FBDD 是一种将随机筛选随机筛选和基于结构的药物设基于结构的药物设计计结合的药物发现新方法。 首先筛选得到低分子量低分子量和低亲和力低亲和力的片

2、段，然后基于药靶结构信息将片段进行优化优化或连接连接，得到与药靶亲和力高且类药性强的新分子。31.1.发展背景发展背景高通量筛选的缺陷高通量筛选的缺陷I.盲目性大，命中率很低。盲目性大，命中率很低。理论计算，含有30个重原子的化合物有1060种，而高通量筛选的化合物数即使以百万计(106)，筛选也只占很少部分。II. 对于部分药物靶点很难筛选得到理想的化合物，对于部分药物靶点很难筛选得到理想的化合物，命中化合物的类药性较差。命中化合物的类药性较差。化合物分子量比较大，亲脂性强，优化成药的难度大。一、发展历程和基本理论一、发展历程和基本理论4第一节 基于片段的分子设计原理III. 许多药靶的活性

3、位点是由多个口袋口袋组成。高通量筛选的化合物过于“成熟成熟”，通常不能与靶蛋白很好地结合，而对于其中单个片段的优化往往会影响整个分子，甚至导致结合位置的改变。5IV. 苗头化合物苗头化合物(hit)多以活性强度为衡量标准。多以活性强度为衡量标准。hit-to-lead和先导物优化先导物优化，大都加入或变换基团，以增加与靶标结合的机会和强度。一般“不敢”轻易去除基团或片断，以免丢失参与结合的原子或基团(即药效团药效团)。V. 公司之间的化合物的结构类型相似，筛选靶标相同，易有知识产权纠葛。6设计理念设计理念 药靶的活性位点是由多个口袋组成；药靶的活性位点是由多个口袋组成； 寻找能与药靶各个口袋特

4、异性结合的片段；寻找能与药靶各个口袋特异性结合的片段； 将上述各个片段用合适的连接子连接起来，组成将上述各个片段用合适的连接子连接起来，组成高活性的化合物。高活性的化合物。将片段连接后会引起结合自由结合自由能能跳跃式下降，从而导致亲和力大幅度提高。2. 2. 应对策略应对策略基于片段的药物设计基于片段的药物设计7 基于片段的药物设计分为三个阶段基于片段的药物设计分为三个阶段I.片段筛选。片段筛选。采用灵敏的检测技术筛选片段库，发现能与药靶结合的片段。结合力较弱，一般为mM级。II. 确定片段与药靶结合的结构信息。确定片段与药靶结合的结构信息。考察片段与药靶结合区域结合区域以及如何相互作用如何相

5、互作用。III. 根据片段与药靶相互作用的结构信息来指导对片段进行优化优化或衍生化衍生化，或将作用于不同口袋的片段连接连接，构建新分子。二、研究方法二、研究方法81. 片段库的建立片段库的建立片段库三因素片段库三因素 库容量(100010000)、化学结构多样性、类药性片段类药性三原则片段类药性三原则(RO3) 分子量300(160250)、氢键供体或受体数目3、脂水分配系数log P 3避免具有不合理的基团且易于衍生化避免具有不合理的基团且易于衍生化2. 片段库的筛选片段库的筛选生物化学检测、磁共振、质谱、生物化学检测、磁共振、质谱、X-射线单晶衍射线单晶衍射射二、研究方法二、研究方法93.

6、 结构信息的确定结构信息的确定确定片段与药靶结合的结构信息对于指导片段转指导片段转化为先导化合物化为先导化合物起至关重要的作用。磁共振、质谱、磁共振、质谱、X-射线单晶衍射射线单晶衍射4. 基于片段构建新分子基于片段构建新分子基于片段药物设计的最终目标就是要发现先导化发现先导化合物甚至是候选药物合物甚至是候选药物。利用药靶活性位点与片段相互作用的结构信息，在片段基础上进一步设计新的分子。二、研究方法二、研究方法101. 化学结构多样、命中率高化学结构多样、命中率高高通量筛选高通量筛选106 /1060 VS 片段筛选片段筛选104 /107 化学结构多样化学结构多样二、基于片段分子设计的优点二

7、、基于片段分子设计的优点112. 发现新药可行性高发现新药可行性高将高通量筛选得到的先导物优化为候选药物，既既要使活性有较大幅度提高，又要保持分子量基本要使活性有较大幅度提高，又要保持分子量基本不变不变，难度较大。而从片段优化至候选药物，分子量和活性同步增分子量和活性同步增长长，更加符合新药发现的一般规律，可行性更强。二、基于片段分子设计的优点二、基于片段分子设计的优点12hit to lead片段片段hit高通量筛选高通量筛选hit药物药物分子量分子量160250250600300500活性活性mMMMnM二、基于片段分子设计的优点二、基于片段分子设计的优点13010020030040050

8、0600700mM药物药物HTS苗头物苗头物候选药物候选药物片断片断相对分子质量相对分子质量uMnM生物活性生物活性u 基本原理基本原理配体与生物大分子结合后，许多NMR参数参数(化学位移)会发生改变，通过检测并分析这些数据，可以来判定配体是否与受体结合是否与受体结合、结合的结合的强弱强弱以及结合模式结合模式。u 分类分类检测检测配体配体的筛选的筛选 LDBS检测检测受体受体的筛选的筛选 TDBS一、磁共振技术一、磁共振技术14第二节 活性片段的检测技术1. 检测配体的筛选检测配体的筛选 LDBS1.1 原理原理 弛豫时间长短与分子大小成反比弛豫时间长短与分子大小成反比，小分子化合物的弛豫时间

9、长，大分子靶蛋白的弛豫时间短。当药物与靶蛋白结合后就变成大分子药物与靶蛋白结合后就变成大分子，弛豫时间变短。只要适度延迟回复能量检测时间适度延迟回复能量检测时间，就可以做到只检测到游离小分子药物，而检测不到大分子靶蛋白及其与小分子化合物的复合物。151. 检测配体的筛选检测配体的筛选 LDBS1.2 操作步骤操作步骤 I.普通条件测定小分子化合物的NMR谱；II. 向小分子中加入靶蛋白；III. 向磁共振仪引入一个适当的延时引入一个适当的延时使靶蛋白分子检测不到，再测一次。谱图不变谱图不变未结合；未结合；谱图改变谱图改变结合，计算结合率。结合，计算结合率。161. 检测配体的筛选检测配体的筛选

10、 LDBS1.3 优点优点I.不仅可检测纯化合物，也可筛选混合物筛选混合物。因此对天然产物的研究天然产物的研究和组合化学研究特别方便。II. 速度快，可直接确定与靶蛋白结合的片段。III. 灵敏度高，弱结合也能检测到。IV. 对靶蛋白要求低，无需确定结构无需确定结构，无需进行放无需进行放射性核素标记射性核素标记，避开对靶蛋白分子量的限制。避开对靶蛋白分子量的限制。171. 检测配体的筛选检测配体的筛选 LDBS1.3 缺点缺点I.不能获得靶蛋白结合位点结合位点的信息以及片段在结合位点的取向取向。II. 受配体溶解性限制，存在非特异性结合的假阳假阳性性问题。181. 检测配体的筛选检测配体的筛选

11、 LDBS1.4 修正修正报告配体筛选方法报告配体筛选方法操作操作I.在筛选样品中加入一个已知能与药靶某一区域一个已知能与药靶某一区域具有弱结合的分子，称为报告配体或者探针具有弱结合的分子，称为报告配体或者探针。II. 片段分子可竞争性竞争性地与报告配体结合药靶，亲亲和力高于和力高于报告配体的片段分子被检测出来。这种方法得到片段与报告配体结合到药靶相同区相同区域域，避免检测到与药靶非功能区域结合的片段，有效降低假阳性。192. 检测受体的筛选检测受体的筛选 TDBS2.1 先决条件先决条件I.已知靶蛋白的结构结构II. 对靶蛋白进行15N标记标记2.2 原理原理当小分子与靶蛋白结合后，会改变结

12、合位点局部的化学环境化学环境，通过15N标记蛋白的二维二维15N-HSQC谱图谱图，可以找到各酰胺信号15N或1H的化学位移变化。 202. 检测受体的筛选检测受体的筛选 TDBS2.3 优点优点I.不仅可以检测是否结合是否结合，还可以检测结合位点结合位点。II. 准确度高，特异性强。2.4 缺点缺点I.仅适于分子量小于小于40000的靶蛋白；II. 需进行15N标记标记，而且能制备200 mg以上的量 。213. 磁共振构效关系研究法磁共振构效关系研究法 SAR-by-NMR3.1 原理原理I.通过二维二维15N-HSQC谱谱中15N或1H的化学位移变化来检测是否是否有小分子与靶蛋白结合。I

13、I. 配体和蛋白结合常数可通过化学位移的变化化学位移的变化和配配体浓度关系体浓度关系测得。III. 筛选得到结合于靶分子活性位点亚区域活性位点亚区域的低亲和性配体，将这些配体连接配体连接可以得到具有较高亲和力的配体。223. 磁共振构效关系研究法磁共振构效关系研究法 SAR-by-NMR3.2 实例实例Stuker发现发现FK506蛋白抑制剂蛋白抑制剂231. 非共价结合非共价结合电喷雾质谱电喷雾质谱 ESI1.1 原理原理将片段与靶蛋白配成混合液，设定合适的离子化条件，将片段-靶蛋白复合物由液相转化为气相，测定荷质比测定荷质比(m/z)，从而得到结合片段，从而得到结合片段的分子量，进而确定是

14、哪一个片段与药靶结合的分子量，进而确定是哪一个片段与药靶结合。继续运用色谱技术分离得到片段片段-靶蛋白复合靶蛋白复合物物，并将片段解离，通过测定浓度，计算得到亲和力。二、质谱技术二、质谱技术241. 非共价结合非共价结合电喷雾质谱电喷雾质谱 ESI1.2 实例实例发现细菌发现细菌U1061A功能域配体功能域配体252. 共价结合共价结合Tether方法方法2.1 原理原理靶蛋白的半胱氨酸残基巯基半胱氨酸残基巯基与连有二硫键侧链二硫键侧链片段片段形成新的二硫键。含二硫键片段组成：片段母体片段母体、连接基团连接基团、离离去基团去基团(2-巯基乙胺巯基乙胺)。二、质谱技术二、质谱技术262. 共价结

15、合共价结合Tether方法方法2.2 操作操作I.考察靶蛋白活性口袋附近是否含有内源性半胱氨是否含有内源性半胱氨酸残基酸残基，如果没有，则采用定点突变引入定点突变引入半胱氨酸残基。II. 将片段库中的片段都连上相同的巯基侧链巯基侧链，将靶蛋白置入片段的高浓度溶液中。在溶液中片段和靶蛋白的二硫键的形成和解离达到动态平衡。III. 片段和靶蛋白结合不仅能形成二硫键，而且片段片段还会与附近的活性口袋结合，从而形成更稳定的还会与附近的活性口袋结合，从而形成更稳定的片段片段-靶蛋白共价复合物靶蛋白共价复合物。272. 共价结合共价结合Tether方法方法2.2 操作操作IV. 溶液中活性片段-靶蛋白复合

16、物的浓度远高于其他复合物，在质谱图上可以轻易识别出活性片段识别出活性片段。根据插入半胱氨酸残基位置的不同，还可以判断结合位置。V. 通过二次二次Tether技术技术可以筛选得到相邻位点的活性片段。然后将两个片段以合适的连接子连接，得到高活性化合物。282. 共价结合共价结合Tether方法方法2.3 优点优点I.片段和药靶之间形成了稳定并且可逆的二硫键稳定并且可逆的二硫键。用质谱快速检测得到与药靶具有较好契合的片段，降低假阳性率。II. 可精确定位片段在药靶活性位点的位置。2.4 缺点缺点I.需要采用定点突变定点突变技术在药靶活性位点引入半胱氨酸残基。II. 片段库中，商业化的二硫键片段很少，

17、需自行合自行合成成，增加了实验的难度。292. 共价结合共价结合Tether方法方法2.5 二次二次Tether技术技术原理原理 用一个已知活性片段已知活性片段对靶蛋白进行共价修饰，然后将片段潜在的另一个巯基游离出来另一个巯基游离出来，用Tether方法去结合新的片段。已知活性片段已知活性片段具有亲电亲电的特征(例如含有易离去基团)；含有一个潜在的巯基潜在的巯基(如硫酯)302.6 实例实例采用二次采用二次Tether方法发现高效方法发现高效caspase-3抑制剂抑制剂31u X-射线单晶衍射技术是研究分子结构最有效最有效和最精确最精确的方法。u 结晶筛选结晶筛选 通过共结晶共结晶和结晶浸润

18、结晶浸润技术，靶蛋白可以快速识别并结合活性片段形成复合物，后者的三维结构可通过高通量X-射线衍射技术快速测定。1. 技术原理技术原理片段库片段库含溴片段含溴片段(利于测定、易于衍生化利于测定、易于衍生化)筛选过程筛选过程靶蛋白晶体结构的测定靶蛋白晶体结构的测定、建立结建立结晶筛选技术平台晶筛选技术平台、片段库的结晶筛选、结果分片段库的结晶筛选、结果分析和片段优化析和片段优化。三、三、X-射线单晶衍射技术射线单晶衍射技术322. 实例实例SGX发现发现Syk抑制剂抑制剂 发现活性片段仅仅是研究的第一步第一步，将活性片段转化变为先导化合物先导化合物甚至是候选药候选药物物才是基于片段药物设计的最终目的。 从片段到先导化合物的设计方法从片段到先导化合物的设计方法片段生长片段生长 fragment growth片段连接