第五章蛋白质组研究方法概论

1、 第三章第三章 蛋白质蛋白质 组研究方法概论组研究方法概论 一、三大基本技术一、三大基本技术 三大基本技术的功能：三大基本技术的功能：1D、2D电泳（色谱）技术电泳（色谱）技术-分离分离 计算机辅助图象处理技术计算机辅助图象处理技术-识别识别 生物质谱技术生物质谱技术-鉴定鉴定pH3 10MW 100Kd10Kd2D map of HL-60 cell treated with ATRAZoom gel469113107622周龄胎肝周龄胎肝 2-DE 图谱图谱3104.55.54.55.5466.55窄范围胶条双向电泳图谱窄范围胶条双向电泳图谱RH20和和RH35之间差异表达蛋白质点之间差异

2、表达蛋白质点MS鉴定：鉴定：1287212872Subunit Identification by MALDI-TOF MSJing 411(N, 7+8, 2+12)Single Subunit Identification by MALDI-TOF MSPMF of Emmer 87(1Ax 2.1*)1Ax 2.1*Single Subunit Identification by MALDI-TOF MSPMF of Emmer 87(1Bx 17*)1Bx 17*DNA与蛋白质分析方法比较与蛋白质分析方法比较二、蛋白质组研究的基本思路与策略二、蛋白质组研究的基本思路与策略基因组基因组(

3、genome = gene + chromosome): 生物体所拥有的全套染色体上的全部基因生物体所拥有的全套染色体上的全部基因转录组转录组(transcriptome=transcript + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套全套mRNA蛋白质组蛋白质组(proteome = protein + genome): 一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质全套蛋白质l表达蛋白质组表达蛋白质组(compositional proteomics) Human Plasma Pr

4、oteome, Human Liver Proteome Yeast Proteome Database (YPD, 6145 proteins) l差异蛋白质组差异蛋白质组(comparative proteomics) Disease proteome Pharmaceutical proteome l基本生物学问题基本生物学问题Post-translational modificationProtein-protein interactionl临床应用问题临床应用问题Disease marker-diagnosisDrug target-therapy l Profiling l Ide

5、ntificationl Quantificationl Localizationl Modificationl Interactionl ActivitiesFunction蛋白质组总体研究方案蛋白质组总体研究方案Image AnalysisDatabase Built SampleCell or TissueDatabaseSearchingProteinCharacterizationPMFEndoproteinaseDigestion MALDI/TOF/MSPeptide mixture2D-GelPSD/MALDI/TOF/MSESI/MS/MSPeptideSequence Ta

6、gsPeptide LadderSequenceSchematic Overview of Proteome Analysis Based 2DEPost-translationalmodification蛋白质组研究技术路线流程图蛋白质组研究技术路线流程图数据库一次检索数据库一次检索未知蛋白未知蛋白已知蛋白已知蛋白翻译后修饰鉴定翻译后修饰鉴定PSD-MALDI-MSPSD-MALDI-MSESI-MS-MSESI-MS-MS肽序列测定肽序列测定数据库二次检索数据库二次检索蛋白质鉴定蛋白质鉴定凝胶图象分析凝胶图象分析（蛋白质作图（蛋白质作图基因产物作图基因产物作图蛋白质表达水平的分析蛋白质表达

7、水平的分析）膜转印膜转印生物样品生物样品SDS-PAGE + HPLCSDS-PAGE + HPLC2D-PAGE2D-PAGEMALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS精确分子量精确分子量酶酶 解解羧肽酶酶解羧肽酶酶解Edman降解降解氨基酸分析氨基酸分析肽混合物肽混合物MALDI-MSMALDI-MS肽指纹图肽指纹图PMFPMFN-端序列端序列C-端序列端序列蛋白质数据库蛋白质数据库Global Protein AnalysisDifferential Proteome Analysis Disease Control Analytical 2-DE Analytical 2-DES

8、ubtractive AnalysisVariation, Additional spots, Missing spots, Intensity differencesPreparative 2-DEIn-gel digestionPeptide mixtureMALDI-TOF-MS, ESI-MS-MSPMF, SequencingDatabase searchingIdentity of the query protein, Function of protein Gene knock-out, transfection Yeast two-hybrid Immunohistochemi

9、stryPeptide synthesis Gene Protein-protein interaction Protein localization AntibodyProteome database三、蛋白质组研究新技术三、蛋白质组研究新技术 同位素编码亲和标签技术同位素编码亲和标签技术 （用于定量蛋白质组学研究）（用于定量蛋白质组学研究） isotope-coded affinity tags, ICATisotope-coded affinity tags, ICAT 双色荧光技术双色荧光技术 酵母双杂交技术酵母双杂交技术（蛋白质（蛋白质- -蛋白质相互作用研究）蛋白质相互作用研究）

10、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术 多维色谱多维色谱- -质谱联用技术质谱联用技术 蛋白质翻译后修饰质谱检测技术蛋白质翻译后修饰质谱检测技术 蛋白质芯片技术等。蛋白质芯片技术等。四、大规模的蛋白质分离技术四、大规模的蛋白质分离技术 蛋白质种类繁多，如：蛋白质种类繁多，如：酵母：酵母：6145个；个；人类：人类：2.8-4万个基因，万个基因， 编码十几万个蛋白质。编码十几万个蛋白质。包括：酸性、碱性、疏水、亲水、分子量包括：酸性、碱性、疏水、亲水、分子量 大、大、 分子量小等。分子量小等。1、2-DE（二维电泳）（二维电泳） Smithies and Pouli

11、k: Nature, 1956, 177: 1033 (首先提出双向电泳思路首先提出双向电泳思路) Raymond and Weintraub: Science, 1959, 30: 711 (发明发明PAGE). 1969: 发明发明 IEF-PAGE。1975，OFarrel：JBC, 250: 4007-4021. Klose: Humangenetik, 26: 231-243. Scheele: JBC, 250: 5375-5385.进一步优化后建立进一步优化后建立2-DE。 80年代初：固相化年代初：固相化pH梯度梯度（immobilized pH gradient, IPG）等

12、电聚）等电聚焦电泳技术，使重复性、上样量大大提高。焦电泳技术，使重复性、上样量大大提高。 微量鉴定技术：微量鉴定技术： Edman微量测序技术微量测序技术 （microsequencing） 高灵敏度质谱技术。高灵敏度质谱技术。细胞、组织、生物体蛋白质（蛋细胞、组织、生物体蛋白质（蛋白群）表达谱白群）表达谱（磷酸化蛋白质谱，糖基化蛋白（磷酸化蛋白质谱，糖基化蛋白质谱）质谱）蛋白质差异表达蛋白质差异表达（细胞周期、疾病、应激条件下（细胞周期、疾病、应激条件下蛋白质表达变化，细菌分类蛋白质表达变化，细菌分类 ）平衡平衡SDS、尿素、尿素1、DTT2、碘乙酰胺、碘乙酰胺固相固相pH梯度等电梯度等电聚

13、焦（聚焦（IPG IEF）SDS-PAGECH2CHCONHCH2NHCH2CHCOCH2CHCH2CHCONH2nCH2CHCONHCH2NHCH2CHCOCH2CHCONH2nCH2CH2CHCONH2nCH2CH2CHCH2CHCONH2nCONHCH2NHCOCH2CHCH2CHCONH2nCH2CH2CHCH2CHCONH2nCONH丙烯酰胺甲 叉 丙烯酰胺聚 丙烯酰胺 凝 胶CH2CHCONH2聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶构成聚丙烯酰胺凝胶的两个单体的结构构成聚丙烯酰胺凝胶的两个单体的结构及聚合物的网状结构示意图及聚合物的网状结构示意图丙稀酰胺丙稀酰胺甲叉丙稀酰胺甲叉丙稀酰胺聚丙烯

14、酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶PAGPolyacrylamide gel单体及聚合物单体及聚合物Gel 组成：组成：T= a + b / m x 100 (%)C= b / a + b x 100 (%)T- 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺浓度丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺浓度%C- 甲叉双丙烯酰胺浓度甲叉双丙烯酰胺浓度% %：一般：一般3%3%a- 丙烯酰胺质量丙烯酰胺质量gb- 甲叉双丙烯酰胺质量甲叉双丙烯酰胺质量g第一维：等电聚焦第一维：等电聚焦 isoelectric focusing, IEF原理：原理： 蛋白质的等电点蛋白质的等电点pI： 某一溶液中蛋白质静电荷为零的某一溶液中蛋白质静电荷为零的pH值

15、。值。分辩率高：分辩率高：0.01pH单位（精确度和重复性）。单位（精确度和重复性）。高度浓缩，可一次实验测出等电点。高度浓缩，可一次实验测出等电点。蛋白质所处环境的蛋白质所处环境的pHpH值与其等电点不符，则该蛋白质会值与其等电点不符，则该蛋白质会带一定量的正电荷或负电荷。带一定量的正电荷或负电荷。在强电场中，带电的蛋白质分子会向正极或负极漂移，在强电场中，带电的蛋白质分子会向正极或负极漂移，当达到其等电点位置时，蛋白不带电，就不再漂移。当达到其等电点位置时，蛋白不带电，就不再漂移。连续分布的连续分布的pH值被固相化在一维干胶条上，当蛋白质值被固相化在一维干胶条上，当蛋白质样本进胶条后，在强

16、电场下按等电点不同分离蛋白质。样本进胶条后，在强电场下按等电点不同分离蛋白质。等电聚焦等电聚焦 等电点方向分离等电点方向分离a) 胶条和胶条和IPG缓冲液缓冲液c) 去除去除IPG胶保护膜胶保护膜b) 加入样品和重泡胀液加入样品和重泡胀液d) 放入胶条，铺展样品放入胶条，铺展样品e) 用覆盖油封胶用覆盖油封胶f) 封闭持胶槽封闭持胶槽 g) 转移持胶槽转移持胶槽h) 编程并运行编程并运行一维等电聚焦操作流程一维等电聚焦操作流程等电聚焦：结果等电聚焦：结果pH3pH10BIO-RAD公司公司PROTEAN IEF一维等电聚焦一维等电聚焦仪仪Amersham Bioscience 公司公司IPGp

17、hor公司公司 Amersham Bioscience Bio-Rad 胶条长度胶条长度 （cm） 7、11、13、18、24 7、11、17、24 pH 范围范围 3.5-4.5、4.0-5.0、4.5-5.5、5.0-6.0 5.5-6.7、 6-9、 3-7 NL、 3-10、 3-10 NL 4-7 (胶条长度为胶条长度为 18cm 或或 24cm) 3-6 5-8 7-10 3-10 等电聚焦胶条的规格等电聚焦胶条的规格l了解所要检测的样品了解所要检测的样品离子浓度，可溶性，溶液体系离子浓度，可溶性，溶液体系l准备使用的重泡胀液类型及体积准备使用的重泡胀液类型及体积l胶条胶条pH值范

18、围的选择及相应的两性电解质选择值范围的选择及相应的两性电解质选择l避免外来污染避免外来污染IEFIEF的优点：的优点： 1 1、分辨度高：、分辨度高：0.01pH0.01pH 2 2、样品体积和加样位置不严格、样品体积和加样位置不严格 3 3、测定蛋白质、测定蛋白质p pI I 4 4、分离快，薄层、分离快，薄层IEFIEF：2h2h 5 5、可保持原有蛋白的生物活性、可保持原有蛋白的生物活性IEFIEF的缺点：的缺点： 1 1、pI 附近会产生沉淀，影响分离效果附近会产生沉淀，影响分离效果 2 2、样品要不含盐、样品要不含盐 3 3、两性电解质可与蛋白质结合，使抗体、两性电解质可与蛋白质结合

19、，使抗体反应、酶活性降低。反应、酶活性降低。 第二维：第二维： 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）123456789101112131415161718192021222324252627282930SMNVero Vero SARS SARSMarker94,00067,00043,00030,00020,10014,400SARS攻击攻击Vero E6细胞系病毒结构蛋白质鉴定结果细胞系病毒结构蛋白质鉴定结果一维胶条平衡一维胶条平衡目的：目的：1.打开链内及链间二硫键，并封闭自由巯基打开链内及链间二硫键，并封闭自由巯基 2. SDS和蛋白质以质量比和蛋白质以质量比1.4

20、：1结合，使亚基表面结合，使亚基表面携带过量负电荷，在电场中向正极移动携带过量负电荷，在电场中向正极移动SDS-PAGE+一维胶条一维胶条分子量标准分子量标准琼脂糖封胶琼脂糖封胶SDS-PAGE 胶类型胶类型浓度分布浓度分布 梯度胶，连续胶梯度胶，连续胶制胶方式制胶方式 自制胶，预制胶自制胶，预制胶电泳方向电泳方向 水平胶，垂直胶水平胶，垂直胶Bio-Rad Protean II xi Cell 二向二向分析系统分析系统水平电泳仪水平电泳仪Multiphor II及其附件及其附件SDS-PAGE胶染色胶染色染色槽染色槽 Sensitivity limit Quantification Livi

21、ng cells Linear Dynamic Range Coomassie Blue staining 100 ng + no 3 Negative staining 15 ng + no 3 Silver staining 200 pg + no 7 Fluorescent staining 400 pg + no 104 Fluorescent labelling 250 pg + no 104 Radioactive labeling: X-ray film 1 pg + yes 20 Phospor-imager plates 0.2 pg + yes 105 Stable iso

22、tope labelling 3.4 O.D.Scan color selection14 bits / pixel (grey)Linked to ImageMasterlMulti-color fluorescencelPhosphor-imaginglChemiluminescencelZoom Gel (放大胶放大胶)窄范围等电聚焦，提高双向电泳分辨率窄范围等电聚焦，提高双向电泳分辨率l差示荧光电泳（差示荧光电泳（DIGE）保证二维电泳重现性保证二维电泳重现性l虚拟虚拟2-DE技术技术4691131076Zoom gel 技术技术22周龄胎肝周龄胎肝 2-DE 图谱图谱3104.55.

23、54.55.5466.55窄范围胶条双向电泳图谱窄范围胶条双向电泳图谱表达谱构建表达谱构建(蛋白质点数蛋白质点数)1454 1665+1366=3031 1113+1973+1035+1366=5487 IPG 3-10 4-7 6-11 4-5 5-6 5.5-6.74.5-5.5 6-9胶内差示荧胶内差示荧光技术光技术（DIGE）Virtual 2-D (1)IPG胶胶-MALDI/MS分子量测定分子量测定Virtual 2-D (2)IPG IPG 胶条的改进：胶条的改进： pHpH变窄：变窄：1 1 pH pH扩大：扩大：3-123-12 长度：长度： 7 7、1111、1313、18

24、(IEF: 200018(IEF: 2000点点) )、24cm24cm。高通量与自动化：高通量与自动化： molecular scanner: 2-DE/MS 两个两个PVDF膜。膜。 2-DE2-DE的局限性：的局限性： 样品量（样品量（10106 6-10-107 7个细胞）、重复性、个细胞）、重复性、动态范围、丢失、动态范围、丢失、通量与自动化。通量与自动化。 l第一维：等电聚焦第一维：等电聚焦 实现实现pI方向分离方向分离l第二维：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳第二维：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 还原烷基化处理还原烷基化处理 分子量分离分子量分离l基于二维电泳新技术基于二维电泳新技术 Zoom

25、gel, DIGE, Virtual 2-D参考读物参考读物钱小红钱小红, , 贺福初贺福初. .蛋白质组学：理论与方法蛋白质组学：理论与方法，科学出版社，科学出版社郭尧君郭尧君. 蛋白质电泳实验技术蛋白质电泳实验技术. 科学出版社科学出版社Grg A et al. Electrophoresis 2000, 21, 1037Berkelman T. et al. 2-D electrophoreis using immobilized pH gradients principles and methods. Amersham Bioscience.2 2、色谱、色谱- -质谱技术质谱技术（1

26、 1）2D-HPLC-MS-MS2D-HPLC-MS-MS 二维色谱二维色谱- -串联质谱技术串联质谱技术 A. 2D HPLCA. 2D HPLC优点：快速、简单、易于自动化与质谱连优点：快速、简单、易于自动化与质谱连 接、各种蛋白均可分离等。接、各种蛋白均可分离等。有多种组合模式：有多种组合模式： 第一维：离子交换色谱、凝胶过虑色谱第一维：离子交换色谱、凝胶过虑色谱 第二维：反相色谱。第二维：反相色谱。 B. 2D-HPLC/MS-MSB. 2D-HPLC/MS-MS 二维色谱二维色谱- -串联质谱技术串联质谱技术 酵母蛋白质组分析酵母蛋白质组分析 Nature BiotechnolNature Biotechnol., 2001,19:242-247., 2001,19:242-247. 5540 5540个肽段被指认、个肽段被指认、14841484个蛋白被鉴定，个蛋白被鉴定， 并亚细胞定位。并亚细胞定位。 Mass spectrometerRPSCX蛋白鉴定蛋白鉴定变性蛋白混合物变性蛋白混合物肽段肽段 pH 3二维色谱分离二维色谱分离计算机检索计算机检索串联质谱测序串联质谱测序基于二维色谱基于二维色