感受态细胞的制备及检测

1、感受态细胞的制备及检测感受态细胞的制备及检测 2010 2010级硕士生：张瑶级硕士生：张瑶2013-6-1微生物学实验课感受态细胞（感受态细胞（Competent cell） 细胞处于能够吸收外源细胞处于能够吸收外源DNA的状态的状态称感受态，经称感受态，经特殊处理特殊处理后处于此状态的后处于此状态的细胞称感受体细胞。细胞称感受体细胞。 电击法、电击法、CaCl2 、KCl等化学试剂法处理后，等化学试剂法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许外细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许外源源DNA分子进入分子进入 ； 进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实分子通过复制

2、，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。状。感受态细胞（感受态细胞（Competent cell）常用大肠杆菌感受态细胞的区别常用大肠杆菌感受态细胞的区别 BL21感受态主要用用于蛋白表达的优化实验。感受态主要用用于蛋白表达的优化实验。 DH5大肠杆菌感受态是一种常用于质粒克隆的菌株大肠杆菌感受态是一种常用于质粒克隆的菌株 JM109感受态在使用感受态在使用pUC系列质粒载体进行系列质粒载体进行DNA转转化或用化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体载体进行转染时，由于载体DNA产产生的生的LacZa多肽和多肽和JM09编码的编码

3、的LacZM15进行进行-互补，互补，从而显示从而显示-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。菌株。电击法与电击法与CaCl2 制备法的区别制备法的区别 电击法电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部。胞膜上的空洞进入细胞内部。 CaCl2 法法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细胞膜结构发生

4、变化，使得细胞在热激时（胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42，90s）变得很容易从溶液中摄取）变得很容易从溶液中摄取DNA。感受态细胞可以用来做什么？感受态细胞可以用来做什么？将构建好的载体转入感受态细将构建好的载体转入感受态细胞进行表达胞进行表达(转化转化)，不仅可以，不仅可以检验重组载体是否构建成功，检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。验，如蛋白质表达纯化等工作。-互补现象：因为许多载体都带有一个互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头基因的调控序

5、列和头146个氨基酸的编码信息，编码个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（半乳糖苷酶实现基因内互补（-互补）。互补）。当这种载体转入可编码当这种载体转入可编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，端部分序列的宿主细胞中时，在在IPTG的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质，所以称这种酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质，所以称这种现象为现象为-互补现象。互补现象。由互补产

6、生的由互补产生的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物能够作用于生色底物X-gal而产生而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成片段时，会造成LacZ()基基因的失活，破坏因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。蓝白斑筛选蓝白斑筛选单菌落划线单菌落划线

7、一、实验目的一、实验目的1.了解并掌握感受态细胞的制备；了解并掌握感受态细胞的制备；2.掌握感受态细胞的检测方法；掌握感受态细胞的检测方法；二、实验原理二、实验原理 细菌处于细菌处于0的的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的外源的外源DNA形成抗形成抗DNase的羟基的羟基-钙磷酸复合物钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经粘附于细胞表面，经42 短时间热激处理，促进短时间热激处理，促进细胞吸收细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，在选择

8、培养基时后，球状细胞复原并分裂增值，在选择培养基上便可获得所需的转化子。上便可获得所需的转化子。三、实验材料及试剂三、实验材料及试剂超低温离心机超低温离心机水浴锅水浴锅三、实验材料及试剂三、实验材料及试剂恒温金属浴恒温金属浴摇床摇床三、实验材料及试剂三、实验材料及试剂制冰机制冰机超净工作台超净工作台准备物品（按准备物品（按2020个感受态计算）个感受态计算）(1) 50 mL离心管离心管 2个，洗净，灭菌，干燥，预冷。个，洗净，灭菌，干燥，预冷。(2) 1.5 mL离心管：离心管：25个，灭菌，干燥，预冷。个，灭菌，干燥，预冷。(3) LB 液体培养基：液体培养基：50 mL液体液体LB放于放

9、于500 mL三角瓶（洗净）中，灭菌。三角瓶（洗净）中，灭菌。(4) LB 液体培养基：液体培养基：3 mL液体液体LB放于小试管中，灭菌。放于小试管中，灭菌。(5) LB固体平板固体平板2个，无个，无Amp。(6) 氯化钙：氯化钙：0.1 M，25 mL，灭菌，使用前置于冰浴中预冷，灭菌，使用前置于冰浴中预冷 称取称取CaCI22H2O 0.37 g，定容至，定容至25 mL(7) 氯化钙氯化钙-氯化镁混合液：（氯化钙氯化镁混合液：（氯化钙 20 mM，氯化镁，氯化镁 80 mM）200 mL，灭，灭菌，使用前置于冰浴中预冷菌，使用前置于冰浴中预冷 称取称取CaCI22H2O 0.59 g，

10、MgCI26H2O 3.25 g，定容到，定容到200 mL(8) 甘油：甘油：4 mL，灭菌，预冷。，灭菌，预冷。(或或DMSO 1 mL)(10) 颗粒状小冰块。颗粒状小冰块。(11) 蓝枪头、黄枪头各一盒，灭菌，预冷。蓝枪头、黄枪头各一盒，灭菌，预冷。(12) LB培养基：胰蛋白胨培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物，酵母提取物 5 g/L， NaCl 10 g/L，琼脂，琼脂粉粉 16 g/L（固体培养基），调节（固体培养基），调节pH至至7.0，高压灭菌。，高压灭菌。四、实验步骤四、实验步骤-感受态制备感受态制备(1) 划线接种工程菌到划线接种工程菌到LB平板上，培养出单菌落。

11、平板上，培养出单菌落。(2) 挑取单菌落至盛有液体挑取单菌落至盛有液体LB的小试管中，的小试管中， 37过夜培养。过夜培养。(3) 将小试管中的菌液转移至盛有将小试管中的菌液转移至盛有50 mL液体液体LB的三角瓶中，的三角瓶中，37振荡振荡（200 r/min）约）约1 h，至呈云雾状，冰浴，至呈云雾状，冰浴10 min。(4) 把菌液倒入预冷的把菌液倒入预冷的50 mL离心管中，（每管放离心管中，（每管放25 mL）共）共2管。管。(5) 4，4500 r/min离心离心10 min，充分弃上清。，充分弃上清。(6) 每管加入每管加入15 mL预冷的氯化钙预冷的氯化钙-氯化镁混合液，重悬细

12、胞，冰浴氯化镁混合液，重悬细胞，冰浴10 min。(7) 4，4500 r/min离心离心10 min，充分弃上清。，充分弃上清。(8) 每管加入每管加入1 mL预冷的氯化钙溶液，重悬细胞，冰浴预冷的氯化钙溶液，重悬细胞，冰浴10 min。(9) 每管加入每管加入0.25 mL 预冷的无菌甘油，冰浴预冷的无菌甘油，冰浴10 min，分装到，分装到20个个1.5 mL EP管中，每个管中，每个EP管分装管分装100 L，放于，放于-70冰箱中，备用。冰箱中，备用。注：第注：第8步可以加入步可以加入DMSO替换甘油作为保护剂。替换甘油作为保护剂。四、实验步骤四、实验步骤-感受态检测感受态检测1）连

13、接）连接2）转化）转化纯化后的纯化后的PCR产物与产物与pMD18-T载体连接（载体连接（16 ，8-10h ） 从冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置冰上缓缓融化；从冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置冰上缓缓融化； 将连接产物（将连接产物（10 L）全部加入）全部加入100 L感受态中，混合均匀，冰浴感受态中，混合均匀，冰浴30 min； 42热激热激90 s，冰浴，冰浴2 min；42热激热激1 min，冰浴，冰浴2 min； 加入加入800 l液体液体LB培养基培养基(不含不含Amp)，37摇床培养摇床培养1-1.5 h； 4000 r/min离心离心5 min，弃上清，剩余约，弃上清，剩余约

14、100 L； 凃布氨苄凃布氨苄LB固体平板（氨苄终浓度为固体平板（氨苄终浓度为100 g/mL），），37正置正置30 min，再倒，再倒置培养置培养12 h左右；左右；3）蓝白斑筛选，菌落）蓝白斑筛选，菌落PCR验证验证四、实验步骤四、实验步骤-感受态检测感受态检测五、实验注意事项五、实验注意事项1.细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从-80甘油保存的菌种中直接转接用甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。于制备感受态细胞的菌液。2.细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，也可通过监细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，也可通过监测培养液的测培养液的OD600 来控制。密度过高或不足均会影响转来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。化效率。3.实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。菌体破裂，影响转化。4.感受态细胞制备过程中均需在冰上操作。感受态细胞制备过程中均需在冰上操作。5.菌种转接前最好培