蛋白质组学与分析技术课复习思考题终结

1、蛋白质组学与分析技术复习思考题名词解释1. 蛋白质组学：是研究与基因对应的蛋白质组的学科。指一种基因组所表达的全套蛋白质，即包括一个基因组、一种细胞或组织，乃至一种生物所表达的全部蛋白质。 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质；其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。2. 双向电泳原理：根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离（等点聚焦（IEF），在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离（SDS凝胶电泳（SDS-PA

2、GE） 二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。 3. 三步纯化策略：粗提：分离、浓缩和稳定样品；把蛋白质从原来的组织和细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然活性。中度纯化：取出大部分杂质；一般使用盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离和超滤等。精细纯化：进一步纯化、达到最高纯度。一般使用凝胶过滤、离子交换层析等层析技术。4. 高效液相色谱：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入

3、检测器进行检测，从而实现对试样的分析。在蛋白组学的研究中可以从复杂混合物中分离某种蛋白质组分5. 吸附色谱：又叫液固色谱，流动相是液体，吸附剂是固相；当混合物随着流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离。这是一种早期的色谱分离技术，主要适用于分子量不大的物质的分离。 6. PCR扩增：即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。7 基因组文库：基因文库(gene library)，也称基因组文库（genomic library）：这是一种直接从基因组中分离目的基因的方

4、法。即用适当的方法将某一种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将这些片段与适当的载体进行体外重组，在引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA分子的群体。 从理论上讲，这些重组子应包含整个基因组DNA序列，即包含某种生物细胞的全部基因。因此，称之为基因组文库，或基因文库。8. cDNA文库：细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。9. 基因芯片：又叫DNA芯片（DNA chip)，DNA微阵列（DNA microarray), DNA集微芯片（DNA microchip）,寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。是一种将核酸分子杂交原理与

5、微电子技术相结合而形成的高新生物技术。 将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体（硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等）上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。10. 基因敲除：基因敲除（gene knock out），又称基因打靶（gene targeting）,是指用外源的DNA与受体细胞基因组中顺序相同或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序

6、相近基因取代，然后从整体观察实验动（植）物，推测相应基因的功能。11. 同源建模：是一种蛋白质结构预测方法，具体指是利用同同源蛋白质结构为模板来预测未知蛋白质的结构。同源性大于50时，结果比较可靠；3050之间， 其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。12. 蛋白质一级结构：蛋白质氨基酸序列为蛋白质的一级结构。简答题1 蛋白质组学主要包括那些分析技术及各自特点蛋白质组学分析主要包括：样品的制备、蛋白质的分离纯化、蛋白质结构的测定、蛋白质的互作样品的制备：主要包括超声波破碎、液氮冷冻破碎、细胞研磨。酶解法等。蛋白质的分离与纯化：

7、根据分子大小不同的纯化方法：透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤；利用溶解度差别的纯化方法 ：等电点沉淀；盐溶和盐析；有机溶剂分级分离法 ；依据蛋白质的电荷：电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析；吸附性质：羟磷灰石层析、疏水层析；对配体的特异亲和力：亲和层析蛋白质结构的测定蛋白质高级结构的测定：X射线衍射、圆二色谱、核磁共振、同源建模等蛋白质和多肽的氨基酸序列测定：Edman化学降解法、酶降解法、质谱法、根据核苷酸序列的推定法 。蛋白质的互作：酵母双杂交、双分子荧光互补、pull-down assay、表面等离子体共振（SPR技术）、免疫共沉淀等。此外还包括有：

8、基因芯片、基因敲除、双向电泳、蛋白质芯片、蛋白质杂交、蛋白质酶学技术、蛋白质的生物信息等。2 蛋白质组研究的技术路线流程图功能蛋白蛋白分离（硫酸氨、乙醇沉淀、离心、获得功能粗蛋白制品纯化（液相色谱、蛋白质分析制备仪、双向电泳、液质联仪氨基酸测序基因克隆蛋白质药物作用于植物的蛋白表达谱药物与植物的相互作用。 3 蛋白样品的制备原则与纯化原理（一）实验样品的制备原则1)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 2)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 3)防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。4)完全去除样品中的核

9、酸和某些干扰蛋白。 5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。（二）、蛋白质的分离纯化原理 根据分子大小不同的纯化方法：透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤、 利用溶解度差别的纯化方法 ：等电点沉淀；盐溶和盐析；有机溶剂分级分离法 依据蛋白质的电荷：电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析吸附性质：羟磷灰石层析、疏水层析对配体的特异亲和力：亲和层析4 简述高效液相色谱、气相色谱、质谱、液质联仪的工作原理及用途高效液相色谱：高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固

10、定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相色谱具有快速、灵敏、高效的特点，其使用的固定相支持及颗粒很细，表面积大；溶剂系统采用高压，洗脱速度大。主要应用于蛋白质的分离纯化、氨基酸分析、与质谱联合使用、样品纯度的初步鉴定。气相色谱：在该层析系统中，以气体为流动相，多为氢气、氮气、氦气等；固定相为涂在固体颗粒表面的液体。利用气相层析进行分离也是基于分配过程，即利用样品组分在流动相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同达到分离的目的。样品在进样之后有一个气化的过程。气相色谱仪适用于分析具有一定蒸气压且热稳定性好的组分，多用于化工组分的分析，也可以分离、分析

11、氨基酸等生物组分。质谱：基本原理是待测样品通过一定方式发生电离、形成带电的分子或分子碎片，再借助电场或磁场的作用使这些离子依质荷比的不同获得分离，并按质合比大小为序冲击检测器，获得质朴图，通过对质谱的分析（试样分子可能产生的各种离子碎片分析）和根据已知的大量化合物质谱图的信息，来了解试样分子的结构、组成及其分解历程。质谱分析是解决核酸一级结构测定的最有利手段之一，包括分子量测定、核酸的序列分析； 同时利用质谱测定寡糖和多糖的结构。 利用质谱可以测定寡糖链和多肽链的序列液质联用（HLPC-MS）：以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。蛋白质样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分

12、析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图、通过质谱图进一步分析鉴定。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。5 高效液相色谱有哪些主要特点高效液相色谱有三高一广一快的特点：高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。2高效，分离效能高，可选择固定相和流动相分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。3：灵敏度高，紫外检测器可达0.001ng,进样两在uL级。4、应用范围广，百分

13、之七十的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、极性强的化合物的分离和分析。5：分析速度快、载液流速快：比经典液体色谱法速度快很多，通常分析样品在1530分钟之内。6 怎样进行蛋白质和多肽的氨基酸序列测定1、 策略：测定蛋白质分子中多肽链的数目，根据蛋白质N端或C端的摩尔数和蛋白质的相对分子质量可以确定蛋白质分子中的多肽数目。2、 如果蛋白质是由一条以上多肽链构成，则需要拆分多肽链，常用尿素等变性剂。3断开多肽链的二硫键。4、分析每一条多肽链的氨基酸组成，经分离纯化的多肽链的部分样品进行完全水解，测定氨基酸组成，计算出氨基酸的分子比和数目。5、鉴定多肽链的N端C端。6、裂解多肽链

14、成较小的片段。7、测定各肽段的氨基酸序列8、利用多套多肽段的氨基酸序列彼此间的交错重叠拼凑出原来完整的氨基酸序列。肽段氨基酸序列测定的方法：1、 Edman化学降解法：又称为苯异硫氰酸酯（PITC）法，反应时，PITC与多肽链末端游离氨基作用，每次从多肽链氨基端切下一个氨基酸，切下的氨基酸可以被氨基酸分析仪检测出来。这样每进行一轮反应就可以测定一个氨基酸序列。2、 酶降解法：有一种肽链外切酶或称外肽酶，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分别从肽链的N端和C端逐个向里切，因此，只要跟随酶水解的过程分别测量释放出来的氨基酸，就能测定氨基酸序列。3、 质谱法：多肽链被处理成带有不同质荷比的分子碎片，经过质谱仪

15、检测器，获得质朴图，通过对质谱的分析 就能得到多肽链N段或C端的氨基酸序列，但是仅能测定较短的序列，长度不超过15个氨基酸残基。4、 根据核苷酸序列的推定法通常首先测定多肽链N端或c端的一小段氨基酸序列（例如：质谱） ，根据这个序列设计PCR引物，通过PCR获得多肽链对应的核苷酸序列，再根据密码子就可以推导出对应多肽链氨基酸序列 。7 基因组文库和cDNA文库的构建各有哪些基本步骤基因组文库的构建 （1）细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备； （2）载体DNA的制备；（3）载体与外源大片段连接；（4）体外包装及基因组DNA文库的扩增；（5）重组DNA的筛选和鉴定。 构建cDNA文库通常包

16、括 1）mRNA的提取及其完整性的确定； 2）cDNA的合成和克隆； （1）cDNA第一链的合成 （2）双链cDNA的合成 （3）cDNA基因与载体的重组 （4）转化 （5）目的cDNA克隆的鉴定 （6）特定cDNA的克隆 3） 目的cDNA的鉴定等步骤。8 简述基因芯片操作流程制作芯片、合成探针、杂交、结果扫描、分析数据 1）DNA微阵列的制备 靶DNA的制备和纯化：以cDNA文库克隆作为靶DNA. 点样：选用Corning GAPS玻片（用-amino saline包被）,自动点样仪点样 点样后处理：玻片置于下紫外交联仪中交联（ 70 mj ），80下烘烤2-4h 2）探针的制备和纯化：提

17、取两个不同基因品系中的mRNA，用氨基酸修饰的dUTP合成cDNA,分别用Cy3和Cy5标记3）预杂交：制备预杂交溶液4）杂交：制备杂交缓冲液；探针变性；探针与芯片杂交5）杂交后处理：洗去未结合的探针6）扫描、数据读取和分析：将玻片置于激光共聚焦扫描显微镜（扫描仪）中进行扫描，应用数据读取和分析软件进行分析。 9 酵母双杂交技术具有哪些用途1、检验对功能已知蛋白间的相互作用 优点快速和高灵敏度，且反映了蛋白在体内的相互作用；还能检测出瞬间发生的信号反应，而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程，常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是

18、由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。 2、研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域 可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要的结构域，当证实了两个蛋白有相互作用后，可以对其进行缺失实验而找到相互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能。通常需要对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。3、发现新的作用蛋白质 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径，寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白，是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。4、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽 通过双杂交系统筛选和目标蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是药物设计的目标，则有可能得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物。 5、分析新基因的生物学功能 即以功能未知的新基