第三讲-核酸的制备2

1、核酸的的制备核酸的的制备2 2核酸样品的分析与检测核酸样品的分析与检测一、凝胶电泳一、凝胶电泳-Gel electrophoresis琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳变性琼脂糖变性琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳脉冲场脉冲场凝胶电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳1，琼脂糖，琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳一般性检测采用一般性检测采用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳：SAGESAGE-submerged agarosesubmerged agarose gel electrophoresis gel electrophoresis核酸样品从核酸样品从负极向正极移动负极向正极移动。Nucleic acid sa

2、mples placed in the gel will Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrodemigrate towards the positive eletrode from from negative electrode in horizontal direction. negative electrode in horizontal direction. 在在中性中性pHpH条件下，条件下，核酸带负电荷核酸带负电荷，主要来自磷酸二，主要来自磷酸二酯键骨架上的磷酸

3、基团。酯键骨架上的磷酸基团。Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due to the multiple negative charges due to the phosphate groups on the phosphodiesterphosphate groups on the phosphodiester backbone.backbone.样品的样品的分离效果分离效果与凝胶基质的与凝胶基质的孔

4、隙度孔隙度有关。有关。随随DNADNA分子增大分子增大，凝胶浓度应降低。，凝胶浓度应降低。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶可以分离长度为可以分离长度为100bp至至60kb的的DNA分子。分子。核酸染料核酸染料溴乙锭溴乙锭。紫外线观察。紫外线观察。The degree of separation depended on the porosity The degree of separation depended on the porosity of the matrix.of the matrix.影响泳动率的因素：影响泳动率的因素：包括包括分子大小分子大小、电荷多少电荷多少、颗粒形状颗粒形状和和空间构型

5、空间构型。颗粒带颗粒带电荷的密度越大电荷的密度越大，泳动速度，泳动速度越快越快。颗粒颗粒物理形状越大物理形状越大，与支持物介质摩擦力越大，与支持物介质摩擦力越大，泳动泳动速度越小速度越小。对于对于线性双链线性双链DNADNA分子，在凝胶电泳中，分子，在凝胶电泳中，相对分子质量相对分子质量的常用对数的常用对数与与泳动率成反比关系泳动率成反比关系。利用利用DNADNA分子长度（分子长度（bpbp）的负对数）的负对数与与泳动距离泳动距离作图，可作图，可以方便准确地以方便准确地测定测定DNADNA片段片段的分子量。的分子量。构型相同构型相同、但相对、但相对分子质量不同分子质量不同的的DNA片段泳动速度

6、不片段泳动速度不一样，在电泳过程中可以彼此分开。一样，在电泳过程中可以彼此分开。相对相对分子质量相同的分子质量相同的DNADNA分子分子如果它们的如果它们的空间构型不同空间构型不同，其其迁移率也不同迁移率也不同。质粒质粒DNADNA存在闭环（存在闭环（型，型，CCCC）、单链开环（）、单链开环（型，型，OCOC）和线性（和线性（型，型，L L）三种构型，三者之间的迁移率一般为）三种构型，三者之间的迁移率一般为型型 型型 型型以以pUC19质粒为例，有超螺旋的质粒为例，有超螺旋的共价闭合环状质粒共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA, 简称简称ccc

7、DNA）、共价闭合环状质粒）、共价闭合环状质粒DNA一条单一条单链断裂的链断裂的开环质粒开环质粒DNA（open circular DNA, 简称简称ocDNA）、共价闭）、共价闭合环状质粒合环状质粒DNA两条单链断裂的两条单链断裂的线性质粒线性质粒DNA（linear DNA, 简称简称L DNA）三种构型三种构型。电泳时电泳时cccDNA移动最快移动最快，其次为，其次为线性线性DNA，开环质粒开环质粒DNA最慢最慢，所，所以电泳结果为三条分开的带。以电泳结果为三条分开的带。限制性酶切的质粒限制性酶切的质粒DNA为线性分子。为线性分子。 M 1 2 3 21kb 5.1 4.9 4.2 3.

8、5 2.0 1.9 1.5 1.3 0.94 0.83 M：DNA相对分子质量标准物（相对分子质量标准物（marker）；）；1：pUC19质粒质粒DNA经经EcoR完全完全酶切酶切；2：pUC19质粒质粒DNA经经EcoR部分部分酶切酶切；3：未酶切未酶切的的pUC19质粒质粒DNA，提，提取结果好时，为一条带，以超取结果好时，为一条带，以超螺旋质粒螺旋质粒DNA为主，有时结果为主，有时结果为三条带，从下向上分别为超为三条带，从下向上分别为超螺旋质粒、线性质粒和开环质螺旋质粒、线性质粒和开环质粒。粒。通常采用的缓冲体系有通常采用的缓冲体系有3 3种种：TrisTris. .乙酸（乙酸（TAE

9、TAE）、）、TrisTris. .硼酸（硼酸（TBETBE）和）和TrisTris. .磷酸（磷酸（TPETPE）。）。TAETAE缓冲能力很低缓冲能力很低，长时间电泳会导致电泳槽，长时间电泳会导致电泳槽阴极变为阴极变为碱性碱性，阳极变为酸性阳极变为酸性，从而使缓冲能力降低。，从而使缓冲能力降低。琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳的分辨力较低分辨力较低，但它，但它操作简便操作简便、应用范围应用范围广、适合于较大分子的分析广、适合于较大分子的分析。DNADNA分子在电泳后分子在电泳后短时间内位置可以保持不变短时间内位置可以保持不变，该技术已成，该技术已成为为DNADNA、RNARNA分离和检测的重

10、要手段。分离和检测的重要手段。TBETBE与与TPETPE均有较强的缓冲能力，但从均有较强的缓冲能力，但从TPETPE凝胶回收的凝胶回收的DNADNA片片段中含有较高的磷酸盐段中含有较高的磷酸盐，容易与，容易与DNADNA一起沉淀一起沉淀，进而影响一，进而影响一些酶反应，如限制性酶切反应。些酶反应，如限制性酶切反应。琼脂糖浓度琼脂糖浓度 %分离范围分离范围 kb0.35600.61200.70.8100.90.571.20.40.12不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性DNADNA分子的有效范围分子的有效范围（指能够清楚地分开）（指能够清楚地分开）

11、2 2，变性变性琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳RNARNA分子在分子在变性琼脂糖凝胶变性琼脂糖凝胶中可以按中可以按大小不同大小不同而相互分开。而相互分开。变性指利用变性剂变性指利用变性剂破坏破坏RNARNA的二级结构的二级结构，消除二级结构对，消除二级结构对电泳迁移率的影响，使电泳迁移率的影响，使RNARNA分子的泳动由分子的泳动由分子大小来决定分子大小来决定。常用的变性剂有常用的变性剂有甲醛甲醛、乙二醛乙二醛和和二甲基亚砜二甲基亚砜等。等。 变性凝胶也可以检测变性凝胶也可以检测DNA分子的碱基变异分子的碱基变异：恒定变性凝胶电泳，恒定变性凝胶电泳，CDGE瞬时温度梯度凝胶电泳，瞬时温度梯度凝胶

12、电泳，TTGE温度梯度凝胶电泳，温度梯度凝胶电泳，TGGE3 3，脉冲场琼脂糖凝胶电泳，脉冲场琼脂糖凝胶电泳大分子大分子DNADNA在电场作用下挤过在电场作用下挤过孔径小于分子大小孔径小于分子大小的凝的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直沿电场方向伸直，与电场平行，这样与电场平行，这样才能通过凝胶才能通过凝胶。这时大分子通过凝胶的方式均相同，这时大分子通过凝胶的方式均相同，迁移率无差别迁移率无差别，不能达到分离的目的。不能达到分离的目的。当当电场方向改变电场方向改变时，电场内的时，电场内的DNADNA分子构象也发生改分子构象也发生改变，并重新定向，变，并

13、重新定向，沿新的方向伸直沿新的方向伸直. .其其转向时间转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依显著地依赖于分子大小赖于分子大小。DNADNA分子分子越大越大，这种，这种构象改变构象改变需要的需要的时间越长时间越长。在脉冲场琼脂糖凝胶电泳中，在脉冲场琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在分子在两个不两个不同方向的均一或不均一电场同方向的均一或不均一电场中不断随中不断随电场方向改电场方向改变分子本身的构象变分子本身的构象，并挤过凝胶。，并挤过凝胶。DNADNA分子分子构象改变时间小于脉冲电场周期构象改变时间小于脉冲电场周期，DNADNA分子便分子便可以按其可以按其分子大小分子

14、大小，得到较好的，得到较好的分离分离效果；效果；反之，反之，DNADNA分子变换时间大于脉冲电场周期分子变换时间大于脉冲电场周期，则凝胶，则凝胶中中DNADNA分子松弛变形与电场更替时间不相等，分子松弛变形与电场更替时间不相等，达不到达不到分离目的分离目的。 Pulsed-field gel electrophoresis, PFGEField inversion gel electrophoresis, FIGE, 电场倒转凝电场倒转凝胶电泳胶电泳Contour-clamped homogeneous eletric field gel electrophoresis, CHEF, 钳位均匀

15、电场电泳钳位均匀电场电泳 4 4，聚丙烯酰胺凝胶电泳（，聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）聚丙烯酰胺凝胶是一种聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成人工合成的凝胶，由的凝胶，由丙烯酰胺丙烯酰胺单体单体和和甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺在催化剂在催化剂过硫酸胺过硫酸胺和加速剂和加速剂TEMEDTEMED的作用下聚合而成。的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶可分离聚丙烯酰胺凝胶可分离5-500bp的小片段的小片段DNA分子分子，所以手工测序一般只能读出所以手工测序一般只能读出500个碱基。个碱基。聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲交联剂甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺将

16、链与链交联成将链与链交联成网状网状，形成不溶于水的，形成不溶于水的凝胶。凝胶。根据待分离物质的根据待分离物质的分子大小分子大小，应选用合适的凝胶浓度。，应选用合适的凝胶浓度。 被分离物质与凝胶浓度之间的关系被分离物质与凝胶浓度之间的关系被分离物质被分离物质被分离物的相对分被分离物的相对分子质量子质量适用的凝胶浓度适用的凝胶浓度蛋白质蛋白质10520%30%15%20%1015%5%10%2%-5%核核 酸酸104104 105105 210815%20%5%10%2%2.6%最常用的最常用的蛋白质分离体系为蛋白质分离体系为pH8.9pH8.9的碱性缓冲液体的碱性缓冲液体系系. .因为大多数蛋白

17、质的等电点因为大多数蛋白质的等电点略偏酸性或中性略偏酸性或中性，在，在pH8.9pH8.9的碱性缓冲体系中的碱性缓冲体系中带负电荷带负电荷，向正极移动。，向正极移动。在有些情况下，需要在缓冲体系中加入在有些情况下，需要在缓冲体系中加入解离剂解离剂，将分子，将分子内的内的非共价键破坏非共价键破坏，这种体系称为，这种体系称为解离体系解离体系。常用的解离剂有常用的解离剂有SDSSDS、尿素尿素等，它们同时也是某些蛋白等，它们同时也是某些蛋白质（如质（如膜蛋白膜蛋白）的）的促溶剂促溶剂。解离剂可以减弱分子空间构象的差别解离剂可以减弱分子空间构象的差别，有利于了解分子，有利于了解分子的大小与迁移率之间的

18、关系。的大小与迁移率之间的关系。 PAGEPAGE分为分为连续电泳体系连续电泳体系和和不连续电泳体系不连续电泳体系。连续连续电泳体系指整个电泳体系中的电泳体系指整个电泳体系中的缓冲液、缓冲液、pHpH值和凝值和凝胶孔径大小相同胶孔径大小相同，主要用于，主要用于核酸分析核酸分析。不连续不连续电泳体系中，除了电泳槽中的缓冲体系和电泳体系中，除了电泳槽中的缓冲体系和pHpH值值与凝胶中不同外，凝胶本身也由与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、缓冲体系、pHpH值和凝值和凝胶孔径不同的两种凝胶胶孔径不同的两种凝胶堆积而成，该体系主要用于堆积而成，该体系主要用于蛋蛋白质样品白质样品的分离。的分离。不连续

19、电泳体系制胶比较麻烦，但它不连续电泳体系制胶比较麻烦，但它对样品有高效浓对样品有高效浓缩效应缩效应，可以大大提高分辨能力。，可以大大提高分辨能力。蛋白质分子的分离鉴定采用不连续电泳体系进行，在蛋白质分子的分离鉴定采用不连续电泳体系进行，在电泳时除具有电泳时除具有电荷效应电荷效应和和分子筛效应分子筛效应外，还有外，还有浓缩效浓缩效应应。浓缩效应主要在浓缩胶浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶中完成，浓缩胶pHpH为为6.96.9。在浓缩胶中，蛋白质样品在快慢离子间被在浓缩胶中，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一狭浓缩形成一狭小的中间层小的中间层，并按其蛋白质所带负电荷量多少依次排列，并按其蛋白质所

20、带负电荷量多少依次排列成带。成带。浓缩的样品进入分离胶后，胶的浓缩的样品进入分离胶后，胶的孔径变小，孔径变小，pHpH值升高，值升高，电场强度恒定电场强度恒定，蛋白质的分离取决于它们的，蛋白质的分离取决于它们的电荷性质、电荷性质、分子大小和形状分子大小和形状。SDS-PAGESDS-PAGE可用于蛋白质分子量的测定可用于蛋白质分子量的测定SDSSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与与蛋白质分子的疏水部分定量结合蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质，把大多数蛋白质拆分拆分成亚单位成亚单位，并带上，并带上阴离子阴离子。这些阴

21、离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异本身所带的电荷差异。SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了电荷效应消除了电荷效应，只有，只有分子筛效分子筛效应应，蛋白质的电泳迁移率完全，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子量取决于分子量，迁移率与分，迁移率与分子量对数呈线性关系。子量对数呈线性关系。用于用于核酸分离核酸分离的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系是的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系是连续体连续体系系，主要分离较小的核酸（，主要分离较小的核酸（5-500bp5-500bp），迁移率与），迁移率与分子分子大小和构型大小和构型（如线性、缺口环化、超螺旋）有关。（如线性、缺

22、口环化、超螺旋）有关。如果样品中所有的如果样品中所有的DNADNA分子分子均为线性分子均为线性分子，可用，可用迁移率迁移率比较其大小比较其大小（以标准核酸片段作标准对照）。（以标准核酸片段作标准对照）。核酸序列测定采用以核酸序列测定采用以尿素为解离剂尿素为解离剂的聚丙烯酰胺凝胶。的聚丙烯酰胺凝胶。 二、核酸的序列测定二、核酸的序列测定DNA sequencing基本原理：将基本原理：将DNA的的序列测定序列测定转化为转化为DNA片段的片段的长度分长度分析析。1 1，化学法测序，化学法测序-Maxam-Maxam-Gilbert (chemical) sequencing-Gilbert (ch

23、emical) sequencing Allan MaxamAllan Maxam and Walter Gilbert and Walter Gilbert （1977） 用化学物质在用化学物质在特定碱基位置断裂特定碱基位置断裂DNADNA分子，产生总体上分子，产生总体上只差只差一个碱基一个碱基的一套的一套DNADNA片段。片段。chemicals are used to cleave the DNA at chemicals are used to cleave the DNA at certain certain positionspositions, generating , gene

24、rating a set of fragments that differ a set of fragments that differ by one nucleotideby one nucleotide. .DNADNA片段的片段的一条链在一条链在5 5 端端用用3232P P标记。标记。然后进行然后进行特定的化学修饰特定的化学修饰。将将修饰的碱基修饰的碱基从脱氧核糖分子上除去后从脱氧核糖分子上除去后用哌啶断裂用哌啶断裂（piperidinepiperidine）。）。 The reaction conditions are chosen so that,on The reaction c

25、onditions are chosen so that,on average, only one modification will be average, only one modification will be introduced into each copy of the DNA roduced into each copy of the DNA molecule.化学法使用化学法使用特异的化学试剂修饰特异的化学试剂修饰DNADNA分子中的分子中的不同碱不同碱基基，然后用哌啶切断多核苷酸链；，然后用哌啶切断多核苷酸链；通过通过四组不同的特异反应四组不同的特异

26、反应，就可以将末端（，就可以将末端（3-3-或或5-5-端）带有放射性标记的端）带有放射性标记的DNADNA分子分子切成不同长度的切成不同长度的寡核苷酸片段寡核苷酸片段。这些寡核苷酸的这些寡核苷酸的长度长度相当于从特异反应引起的相当于从特异反应引起的切点到切点到标记末端之间的长度标记末端之间的长度。用分辨力极高的用分辨力极高的变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些不电泳将这些不同长度的寡核苷酸片段同长度的寡核苷酸片段分离开来并进行自显影分离开来并进行自显影。在四组反应中，在四组反应中，整体上相邻的两条带整体上相邻的两条带仅仅相差一个碱相差一个碱基基，由此可读出所测定的，由此可读出所测定

27、的DNADNA的序列。的序列。G G反应反应 用用硫酸二甲脂硫酸二甲脂（dimethyldimethyl sulfate sulfate，简称，简称DMSDMS）使）使鸟鸟嘌呤上的嘌呤上的N N7 7原子原子甲基化。甲基化。甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键糖苷键在在中性环境中性环境中加热而断裂中加热而断裂，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸骨架在鸟，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸骨架在鸟嘌呤处发生断裂。嘌呤处发生断裂。G+AG+A反应反应 用用甲酸使甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N原子质子化原子质子化，使糖，使糖苷键变得不稳定，再用哌啶使嘌呤脱落。苷键变得不稳

28、定，再用哌啶使嘌呤脱落。T+CT+C反应反应 用用肼（肼（hydrazinehydrazine）使）使T T和和C C的嘧啶环的嘧啶环断裂，再用哌断裂，再用哌啶除去碱基。啶除去碱基。C C反应反应 当有当有NaClNaCl存在存在时，只有时，只有C C与肼发生与肼发生反应，反应，T T不发生反不发生反应。断裂的应。断裂的C C可用哌啶除去。哌啶也可使脱去碱基可用哌啶除去。哌啶也可使脱去碱基处的磷酸二酯键断裂。处的磷酸二酯键断裂。 上述四组反应中，应上述四组反应中，应控制时间只让很小一部分碱基控制时间只让很小一部分碱基被修被修饰，这样在一种饰，这样在一种DNADNA分子形成的群体中，分子形成的群

29、体中，每个相关位点每个相关位点都都有可能被切断形成一种末端带标记的寡核苷酸片段。有可能被切断形成一种末端带标记的寡核苷酸片段。但用但用哌啶切断链的反应必须是定量的哌啶切断链的反应必须是定量的。反应完毕后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳反应完毕后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（7mol/L7mol/L尿素，尿素，8%8%胶胶）进行分析。）进行分析。电泳时电压在电泳时电压在4000V4000V左右，凝胶的温度保持在左右，凝胶的温度保持在6565，以保证以保证DNADNA在变性状态在变性状态下进行电泳。下进行电泳。电泳完毕后，将胶抽干，进行电泳完毕后，将胶抽干，进行放射自显影放射自显影，从胶片上，从胶

30、片上可读出可读出DNADNA序列。序列。 图图 化学法测定化学法测定DNADNA序列时的序列时的G G反应（反应（A A）和化学法测定）和化学法测定DNADNA序列图解（序列图解（B B） 2 2，酶法测序，酶法测序Sanger-Coulson (dideoxySanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing or enzymatic) sequencing Fred Sanger and Alan CoulsonFred Sanger and Alan CoulsonKlenowKlenow fragment, fragment, single

31、-stranded DNA, single-stranded DNA, a primera primerddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesddNTPs-dideoxynucleoside triphosphatesdNTPs,-dNTPs,-3535SATPSATP用用M13M13噬菌体载体噬菌体载体制备制备单链单链DNADNA。DNA molecule was cloned into a vector such DNA molecule was cloned into a vector such as the bacteriophageas the

32、bacteriophage M13 to produce M13 to produce single-single-stranded DNAstranded DNA. . 测序胶测序胶-6-20% polyacrylamide6-20% polyacrylamide7M urea7M urea which acts as a which acts as a denaturantdenaturant to to reduce the effects of DNA reduce the effects of DNA secondary secondary structure.structure.英

33、国生物化学家英国生物化学家F. SangerF. Sanger（19181918）第一个完成了）第一个完成了胰岛素的氨基胰岛素的氨基酸序列测定酸序列测定。1919世纪前叶人们就知道蛋白质，并了解其水解产物中有一些氨基世纪前叶人们就知道蛋白质，并了解其水解产物中有一些氨基酸。酸。到了到了2020世纪初，科学家发现世纪初，科学家发现蛋白质是氨基酸通过肽键连接而成的蛋白质是氨基酸通过肽键连接而成的长链长链，19401940时基本弄清了组成蛋白质的时基本弄清了组成蛋白质的2020种不同氨基酸种不同氨基酸，但对于，但对于这些氨基酸在蛋白质中这些氨基酸在蛋白质中如何排列一无所知如何排列一无所知。Sange

34、rSanger从从19451945年起，选择当时已知的最小蛋白质胰岛素作为研究年起，选择当时已知的最小蛋白质胰岛素作为研究对象，经过十年的艰苦奋斗，终于测出了对象，经过十年的艰苦奋斗，终于测出了牛胰岛素所含的牛胰岛素所含的5151个氨个氨基酸的排列顺序基酸的排列顺序，于，于19581958年获得第一个诺贝尔奖。年获得第一个诺贝尔奖。双脱氧法（双脱氧法（dideoxydideoxy method method），也称），也称酶法酶法（enzyme enzyme methodmethod）或）或链终止法链终止法（the chain termination the chain termination

35、 methodmethod），由），由SangerSanger于于19771977年建立。年建立。以以3535P P、3535S S替代替代3232P P作为标记物。作为标记物。该方法的原理是利用该方法的原理是利用2,3-2,3-双脱氧三磷酸核苷酸双脱氧三磷酸核苷酸（2,3-ddNTP2,3-ddNTP，dideoxynucleotidedideoxynucleotide ）来）来终止终止DNADNA的复制反应的复制反应。DNADNA聚合酶（如聚合酶（如KlenowKlenow片段片段）在）在DNADNA复制过程中催化多复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸被连接在核苷酸链的延伸，单核苷酸被

36、连接在延伸链的延伸链的3-OH3-OH上上；如果掺入的一个如果掺入的一个2,3-ddNTP2,3-ddNTP，延伸反应就会，延伸反应就会停止停止。根据这一原理设计根据这一原理设计四组反应四组反应，每组反应中都含有，每组反应中都含有: :正常的四种脱氧核苷酸正常的四种脱氧核苷酸dNTPdNTP（其中一种带有（其中一种带有3232P P标记）标记）单链单链DNADNA模板模板（即待测（即待测DNADNA，一般通过，一般通过M13M13丝状噬菌体制备）丝状噬菌体制备）DNADNA聚合酶聚合酶I I引物引物（可以根据载体序列人工合成）（可以根据载体序列人工合成）另外每一组反应还加入另外每一组反应还加入

37、一种一种2,3-ddNTP2,3-ddNTP。也可以标记也可以标记引物引物或或ddNTPddNTP. .以以A A管管为例，凡聚合反应进行到模板的为例，凡聚合反应进行到模板的T T碱基碱基时，时，2-dATP2-dATP和和2,3-ddATP2,3-ddATP都有可能掺入都有可能掺入. .如果掺入如果掺入2-dATP2-dATP，聚合反应可以继续进行聚合反应可以继续进行。如果如果掺入掺入2,3-ddATP2,3-ddATP，链，链延伸反应即告终止延伸反应即告终止，这样在反应产，这样在反应产物中就会产生物中就会产生末端为末端为A A的单链的单链DNADNA片段群体片段群体。将四组反应产物用将四组

38、反应产物用凝胶电泳凝胶电泳进行分析，在进行分析，在整体上四个泳整体上四个泳道道中自显影产生的中自显影产生的相邻条带只有一个碱基的差异相邻条带只有一个碱基的差异，由此，由此可读出可读出DNADNA的序列。的序列。应用应用3535S S标记的标记的dNTPdNTP替代替代3232P P标记的标记的dNTPdNTP，电泳图谱更加清，电泳图谱更加清晰，分辨力更高，每次实验可以晰，分辨力更高，每次实验可以读出更多读出更多的碱基序列。的碱基序列。目前双脱氧测序反应一般利用目前双脱氧测序反应一般利用双链双链DNADNA模板模板通过通过聚合酶聚合酶链式反应链式反应进行，并采用进行，并采用四种不同颜色的荧光素四

39、种不同颜色的荧光素分别标分别标记记四种双脱氧核苷酸四种双脱氧核苷酸。这使得四组测序反应可以在这使得四组测序反应可以在一个一个EppendorfEppendorf管管进行，分进行，分析时通过析时通过毛细管电泳毛细管电泳在在DNADNA自动测序仪自动测序仪即可读出相应的即可读出相应的DNADNA序列。序列。 基本的原理为基本的原理为DNADNA聚合酶不能区分聚合酶不能区分dNTPdNTP和和ddNTPddNTP，一旦，一旦ddNTPddNTP被作为被作为底物连接至新生链，底物连接至新生链，DNADNA的的延伸合成会终止延伸合成会终止，从而产生，从而产生单链的单链的DNADNA片片段段；由于存在由于

40、存在很多模板很多模板分子，以及分子，以及dNTPdNTP和和ddNTPddNTP连接的连接的随机性随机性，DNADNA合成合成反应可以在反应可以在任一碱基位置终止任一碱基位置终止。经过一段时间后可得到经过一段时间后可得到一个不同长度的单链一个不同长度的单链DNADNA群体群体，电泳时它们，电泳时它们可以可以按大小分开按大小分开，并且相邻条带之间，并且相邻条带之间仅差一个碱基仅差一个碱基。从胶的下面开始向上可以读出从胶的下面开始向上可以读出DNADNA分子的核苷酸序列。分子的核苷酸序列。越靠近引物越靠近引物端的位置产生的片段越小端的位置产生的片段越小。链终止法中用于测序的链终止法中用于测序的DN

41、ADNA聚合酶聚合酶必须满足必须满足3 3个条件个条件：高酶活性高酶活性，即与模板结合能力强，可合成足够长的，即与模板结合能力强，可合成足够长的DNADNA单链；单链；无无5 5 33 外切核酸酶活性外切核酸酶活性，5 5 33 核酸酶活性可将新合成的核酸酶活性可将新合成的DNADNA链的链的5 5 端除去，端除去，改变合成产物的长度改变合成产物的长度，给顺序的阅读造，给顺序的阅读造成误差；成误差；无无3 3 55 外切酶活性外切酶活性，原因与，原因与相同。相同。所以用于测序的所以用于测序的DNADNA聚合酶都经过了人工的修饰。聚合酶都经过了人工的修饰。第一个用于测序的第一个用于测序的DNAD

42、NA聚合酶为聚合酶为KlenowKlenow片段片段，不具有不具有5 5 33 外外切酶活性切酶活性，但仅能合成长约，但仅能合成长约250250个核苷酸的个核苷酸的DNADNA分子，经聚丙分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，会形成一些烯酰胺凝胶电泳后，会形成一些阴影条带阴影条带，说明有许多终止，说明有许多终止反应由酶活性造成。反应由酶活性造成。现在广泛采用的现在广泛采用的DNADNA聚合酶由聚合酶由T7T7噬菌体噬菌体编码，又称编码，又称sequenasesequenase，即即测序酶测序酶。SequenaseSequenase工作效率高，工作效率高，无外切酶活性无外切酶活性。链终止法测序链终止法测

43、序时可通过以下时可通过以下几种方法制备模板几种方法制备模板：插入质粒载体的插入质粒载体的双链双链DNADNA，可以采用可以采用碱变性或热变性碱变性或热变性使双链使双链DNADNA变为单链，能够进行双向测序；变为单链，能够进行双向测序；用用M13M13载体制备单链载体制备单链DNADNAM13M13载体是根据载体是根据复制型复制型M13M13基因组基因组改进的双链改进的双链DNADNA，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌可产生单链模板，但只能制备可产生单链模板，但只能制备小片段小片段DNADNA；用用噬菌粒噬菌粒（phagemidphagemid）制备

44、单链）制备单链DNADNA噬菌粒含有两个复制噬菌粒含有两个复制起始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自起始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自M13M13、fdfd等单链等单链DNADNA噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中同同时含有噬菌粒和辅助噬菌体时含有噬菌粒和辅助噬菌体时，因后者携带编码噬菌体复制时，因后者携带编码噬菌体复制酶及外壳蛋白的基因，因此可酶及外壳蛋白的基因，因此可激活噬菌粒激活噬菌粒DNADNA复制复制，产生单链产生单链模板模板。PCRPCR产生单链模板产生单链模板两个两个引物中一个连接有很小的磁珠引物中一个连接有很小的

45、磁珠，可，可用吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。用吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。不对称不对称PCRPCR。DNADNA聚合酶在延伸多聚核苷酸时聚合酶在延伸多聚核苷酸时只有只有3 3 核苷酸配对核苷酸配对正确正确才能进行，这可能是为何完全才能进行，这可能是为何完全单链模板在无引单链模板在无引物时不能起始复制物时不能起始复制的原因。的原因。因为在因为在缺少引物缺少引物的情况下，聚合酶的情况下，聚合酶不能确定不能确定3 3 核苷核苷酸配对正确与否酸配对正确与否，无法确定下一步反应。，无法确定下一步反应。大肠杆菌基因组复制时，每个冈崎片段长大肠杆菌基因组复制时，每个冈崎片段长1000-1000

46、-20002000核苷酸，约需核苷酸，约需40004000个引物。个引物。3 3，光点测序光点测序（pyrosequencingpyrosequencing）焦磷酸测序焦磷酸测序涉及涉及四种酶：四种酶：DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）硫酸化酶硫酸化酶(ATP sulfurylase)荧光素酶荧光素酶(luciferase)双磷酸酶双磷酸酶(apyrase). 反应体系反应体系:DNA单链单链测序引物测序引物。dNTP反应底物反应底物:APS (adenosine 5 phosphosulfate)荧光素荧光素(luciferin)在在每一轮每一轮测序反应中，只能加入四种测序反

47、应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一之一;如该如该dNTP与模与模板板配对配对，聚合酶就可以催化该，聚合酶就可以催化该dNTP掺掺入入到引物链中并释放到引物链中并释放焦磷酸基团焦磷酸基团（PPi）。）。掺入的掺入的dNTP和释放的和释放的焦磷酸焦磷酸是等摩尔数目的是等摩尔数目的. dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是是dATP的替代物的替代物;因为因为DNA聚合酶聚合酶对对dATP S的催化的催化效率效率比对比对dATP的催的催化效率化效率高高，且，且dATP S不是荧光素酶的底物不是荧光素酶的

48、底物。硫酸化酶硫酸化酶 催化催化APS和和PPi形成形成ATP，ATP和焦磷酸和焦磷酸的的摩尔数目摩尔数目是一致的。是一致的。ATP驱动驱动荧光素酶荧光素酶介导的介导的荧光素荧光素向向氧化荧光素氧化荧光素(oxyluciferin) 的转化的转化;氧化荧光素氧化荧光素发出与发出与ATP量成正比量成正比的的可见光信号可见光信号。 光信号光信号由由CCD摄像机摄像机检测。检测。每个每个峰的高度峰的高度(光信号光信号)与反应中与反应中掺掺入的核苷酸数目入的核苷酸数目成正比。成正比。 ATP和和未掺入的未掺入的dNTP由由双磷酸酶双磷酸酶降解，淬灭光信号，降解，淬灭光信号，并再生反应体系。并再生反应体

49、系。然后就可以然后就可以加入下一种加入下一种dNTP。 每次只加入一种每次只加入一种dNTP。当反应液中发出。当反应液中发出亮点亮点时，可时，可知核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。知核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不会出现记录会出现记录。连续快速地依次加入，连续快速地依次加入，周而复始，周而复始，随着链的不断延伸，随着链的不断延伸，相应的顺序也被阅读。相应的顺序也被阅读。4 4，DNADNA芯片测序芯片测序将将各种排列顺序的寡聚核苷酸各种排列顺序的寡聚核苷酸点播在面积很小的点播在面积很小的芯片芯片上，每个点

50、的上，每个点的寡核苷酸在排列的方阵中都有寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置指定的位置。将待测的将待测的DNADNA分子与芯片温浴，凡是分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确能杂交的寡聚核苷酸都会在确定的位置发出信号定的位置发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的顺序，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的顺序进行进行对比组装对比组装，拼接成完整，拼接成完整DNADNA顺序。顺序。根据统计，根据统计，可测可测DNADNA片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根酸数目的平方根。假如寡聚核苷酸的长度为。假如寡聚核苷酸的长度为8 8个碱基，则个碱基，则其可能

51、的排列顺序为其可能的排列顺序为4 48 8=65536=65536，而可读的片段长度仅为，而可读的片段长度仅为6553665536的平方根，等于的平方根，等于256bp256bp。即使一个芯片可容纳即使一个芯片可容纳10485761048576个不同的个不同的1010碱基碱基寡聚核苷酸寡聚核苷酸，可读片段长也仅为，可读片段长也仅为1kb1kb。如果要完成如果要完成1Mb1Mb的测序，以的测序，以2020个寡聚核苷酸的数目计算，个寡聚核苷酸的数目计算，芯片需携带的组合数目将达芯片需携带的组合数目将达10101212，只有采用极微量的电子，只有采用极微量的电子操作才能完成。操作才能完成。 5 5，

52、自动化测序，自动化测序荧光标记物荧光标记物：用不同荧光色彩的化合物标记：用不同荧光色彩的化合物标记ddNTPddNTP，ddATPddATP标记红标记红色荧光、色荧光、ddCTPddCTP标记蓝色荧光、标记蓝色荧光、ddTTPddTTP标记绿色荧光、标记绿色荧光、ddGTPddGTP标记标记黄色荧光。黄色荧光。这这4 4种标记的种标记的ddNTPddNTP混合加入到混合加入到一个反应一个反应中，聚合反应完成后，可以中，聚合反应完成后，可以获得末端分别带有获得末端分别带有A A、C C、T T、G G标记的标记的DNADNA单链。电泳分离的单链单链。电泳分离的单链DNADNA条带通过监测仪时，发

53、出不同的颜色信号，由计算机读出碱条带通过监测仪时，发出不同的颜色信号，由计算机读出碱基顺序。基顺序。自动测序的原理仍然为链终止法，但将自动测序的原理仍然为链终止法，但将4 4个反应合并为一个个反应合并为一个，在一在一个泳道中进行电泳。个泳道中进行电泳。毛细管电泳毛细管电泳：用：用毛细管电泳取代聚丙烯酰胺凝胶平板电泳毛细管电泳取代聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，可大大提高测序的速度。可大大提高测序的速度。人类基因组测序中使用的电泳装置有人类基因组测序中使用的电泳装置有9696个泳道个泳道（一束并列的充（一束并列的充满凝胶的毛细管），每次可同时满凝胶的毛细管），每次可同时进行进行9696次测序次测序，每轮

54、实验不每轮实验不到到2 2小时，一天可完成近千次反应小时，一天可完成近千次反应。序列读取采用序列读取采用共聚焦荧光扫描显微镜共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记，可将核苷酸的荧光标记信号放大并由计算机读取碱基顺序。信号放大并由计算机读取碱基顺序。FluorographicFluorographic detection- detection-荧光检测荧光检测6 6，RNARNA序列测定序列测定尽管尽管DNADNA序列分析技术已相当成熟，但有的时候也需序列分析技术已相当成熟，但有的时候也需要直接测定要直接测定RNARNA的序列，尤其是对的序列，尤其是对tRNAtRNA和和rRNArRNA分子

55、中分子中存在的被修饰的核苷酸位置的确定存在的被修饰的核苷酸位置的确定。RNARNA序列分析的困难是序列分析的困难是RNARNA分子极易被分子极易被RNARNA酶降解酶降解，有，有关关RNARNA的实验都需要在十分严格的条件下进行。的实验都需要在十分严格的条件下进行。首先将首先将RNARNA分子的分子的5 5 末端进行标记末端进行标记，然后用，然后用专一性专一性RNaseRNase断开特殊断开特殊核苷酸的核苷酸的3 3 端端。用适当的用适当的酶量和消化时间酶量和消化时间，可产生一个，可产生一个RNARNA片段梯度，相邻片段之片段梯度，相邻片段之间间只有一个碱基的差别只有一个碱基的差别，PAGEP

56、AGE电泳后即可读出电泳后即可读出RNARNA的序列。的序列。RNase T1可在可在G碱基碱基后断裂后断裂RNA分子；分子；RNase U2可在可在A碱基碱基后断裂后断裂RNA分子；分子；RNase Phy M可在可在A和和U碱基碱基后断裂后断裂RNA分子；分子；芽孢杆菌芽孢杆菌Bacillus cereus RNase可可在在U和和C碱基碱基后断开后断开RNA分子。分子。 三、核酸的保存和定量三、核酸的保存和定量microgram-microgram-微克微克nanogramnanogram-纳克纳克picogrampicogram-匹克匹克核酸定量一般采用核酸定量一般采用260nm260

57、nm的吸收值（的吸收值（absorbanceabsorbance）进行。进行。Spectrophotometer-Spectrophotometer-分光光度计分光光度计 A A260260=1.0-50g/ml =1.0-50g/ml 双链双链DNADNA。A A260260=1.0-40g/ml =1.0-40g/ml 单链单链DNADNA或或RNARNA。equivalent to a concentration of equivalent to a concentration of 50g/ml 50g/ml for double-stranded DNAfor double-stra

58、nded DNA, or , or 40g/ml for 40g/ml for single-stranded DNA or RNA.single-stranded DNA or RNA. A A260260/ A/ A280280 ratio should be around ratio should be around 1.8 for 1.8 for pure DNApure DNA and and 2.0 for pure RNA preparations2.0 for pure RNA preparations. . 小于以上数值说明有小于以上数值说明有蛋白质污染蛋白质污染，DNADN

59、A样品该值如样品该值如果大于果大于1.81.8说明有说明有RNARNA污染污染。溴化乙锭溴化乙锭（ethidiumethidium bromide bromide）可以嵌入碱基之）可以嵌入碱基之间，使间，使DNADNA在紫外光下发出在紫外光下发出橙色荧光橙色荧光。binds between the DNA bases (intercalates) binds between the DNA bases (intercalates) and fluoresces orange under ultraviolet and fluoresces orange under ultraviolet li

60、ght. light. 通过比较样品通过比较样品DNADNA与与分子量标准分子量标准中相当条带的中相当条带的亮度亮度可以估计可以估计DNADNA浓度。浓度。 在在0.2M0.2M盐浓度下，加入盐浓度下，加入2 2倍体积倍体积乙醇（乙醇（ethanolethanol）或）或异丙醇（异丙醇（isopropanolisopropanol）可以引起）可以引起核酸沉淀核酸沉淀。一般在一般在-20-20进行，但这一过程与进行，但这一过程与温度关系不大温度关系不大。沉淀用沉淀用TETE（tristris-EDTA-EDTA）bufferbuffer溶解。溶解。TrisTris（三羟（三羟甲基氨基甲烷）、甲基